Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

Summary

In dieser Studie beschreiben wir ein verbessertes Protokoll für eine Multiplex-Hochdurchsatz-Antikörper Mikroarray mit Lektin Detektionsverfahren, das in der Glykosylierung Profilierung spezifischer Proteine ​​verwendet werden können. Dieses Protokoll bietet zuverlässige neue Reagenzien und reduziert den Zeitaufwand, Kosten und Laborgeräte Anforderungen an das vorherige Verfahren verglichen.

Abstract

In dieser Studie beschreiben wir ein effektives Protokoll für die Verwendung in einem Multiplex-Hochdurchsatz-Antikörper-Microarray mit Glykan-Bindungsprotein-Detektion, das die Erstellung von Glykosylierungsprofilen spezifischer Proteine ermöglicht. Die Glykosylierung von Proteinen ist die am weitesten verbreitete posttranslationale Modifikation von Proteinen und führt zu diversifizierten Modifikationen der physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften von Proteinen. Da die Glykosylierungsmaschinerie besonders anfällig für das Fortschreiten der Krankheit und die maligne Umwandlung ist, wurde die aberrante Glykosylierung als Biomarker für die Früherkennung von Krebs und anderen Krankheiten anerkannt. Die derzeitigen Methoden zur Untersuchung der Proteinglykosylierung sind jedoch in der Regel zu kompliziert oder zu teuer für den Einsatz in den meisten normalen Labor- oder klinischen Umgebungen, und es wird eine praktischere Methode zur Untersuchung der Proteinglykosylierung benötigt. Das in dieser Studie beschriebene neue Protokoll verwendet einen chemisch blockierten Antikörper-Microarray mit Glykan-bindendem Protein (GBP)-Nachweis und reduziert den Zeit-, Kosten- und Laborausrüstungsaufwand für die Untersuchung der Proteinglykosylierung erheblich. Bei dieser Methode werden mehrere immobilisierte Glykoprotein-spezifische Antikörper direkt auf die Microarray-Objektträger gedruckt und die N-Glykane auf den Antikörpern blockiert. Die blockierten, immobilisierten Glykoprotein-spezifischen Antikörper sind in der Lage, Glykoproteine aus einer komplexen Probe einzufangen und zu isolieren, die direkt auf die Microarray-Objektträger aufgebracht wird. Der Glykannachweis kann dann durch die Anwendung von biotinylierten Lektinen und anderen GBPs auf den Microarray-Objektträger erfolgen, während die Bindungsniveaus mit Dylight 549-Streptavidin bestimmt werden können. Durch die Verwendung eines Antikörper-Panels und die Sondierung mit mehreren biotinylierten Lektinen ermöglicht diese Methode die Entwicklung eines effektiven Glykosylierungsprofils der verschiedenen Proteine, die in einer gegebenen menschlichen oder tierischen Probe vorkommen.

Einführung

Die Glykosylierung eines Proteins, die die am weitesten verbreitete posttranslationale Modifikation von Proteinen ist, modifiziert die physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften eines Proteins und spielt eine grundlegende Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen^1-6. Da die Glykosylierungsmaschinerie besonders anfällig für das Fortschreiten der Krankheit und die maligne Umwandlung ist, wurde die aberrante Glykosylierung als Biomarker für die Früherkennung von Krebs und anderen Krankheiten anerkannt ^7-12. Tatsächlich sind die meisten aktuellen Krebs-Biomarker, wie die L3-Fraktion des α-1-Fetoproteins (AFP) für das hepatozelluläre Karzinom ^13-15 und CA199 für Bauchspeicheldrüsenkrebs ^{16, 17}, allesamt abweichende Glykananteile auf Glykoproteinen. Die Methoden zur Untersuchung der Proteinglykosylierung waren jedoch kompliziert und nicht für routinemäßige Labor- und klinische Umgebungen geeignet. Chen et al. haben kürzlich einen chemisch blockierten Antikörper-Microarray mit einer Glykan-bindenden Protein-Detektionsmethode (GBP) für die Hochdurchsatz- und Multiplexprofil-Glykosylierung von nativen Glykoproteinen in einer komplexen Probe ^{erfunden 18}. Bei dieser affinitätsbasierten Microarray-Methode fangen und isolieren mehrere immobilisierte Glykoprotein-spezifische Antikörper Glykoproteine aus dem komplexen Gemisch direkt auf dem Microarray-Objektträger, und die Glykane auf jedem einzelnen eingefangenen Protein werden mit GBPs gemessen. Da alle normalen Antikörper N-Glykane enthalten, die von den meisten GBPs erkannt werden können, besteht der entscheidende Schritt dieser Methode darin, die Glykane auf den Antikörpern chemisch daran zu hindern, an GBP zu binden. In dem Verfahren wurden zunächst die ci s-Diol-Gruppen der Glykane auf den Antikörpern unter Verwendung von NaIO₄ in Natriumacetatpuffer unter Vermeidung von Licht zu Aldehydgruppen oxidiert. Die Aldehydgruppen wurden dann an die Hydrazidgruppe eines Vernetzers, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)buttersäurehydrazid HCl (MPBH), konjugiert, gefolgt von der Konjugation eines Dipeptids, Cys-Gly, an die Maleimidgruppe des MPBH. Somit wurden die cis-Diol-Gruppen auf Glykanen von Antikörpern in sperrige Nicht-Hydroxylgruppen umgewandelt, was die Bindung der Lektine und anderer GBPs an die Fängerantikörper behinderte. Durch dieses Blockierungsverfahren binden die GBPs und Lektine nur an die Glykane der eingefangenen Proteine. Nach dieser chemischen Blockierung wurden Serumproben mit dem Antikörper-Microarray inkubiert, gefolgt von der Glykandetektion mit verschiedenen biotinylierten Lektinen und GBPs und der Visualisierung mit Cy3-Streptavidin. Die parallele Verwendung eines Antikörperpanels und mehrerer Lektinsondierungen liefert diskrete Glykosylierungsprofile mehrerer Proteine in einer gegebenen Probe ^18-20. Diese Methode wurde in mehreren verschiedenen Laboren ^{1, 7, 13, 19-31} erfolgreich eingesetzt. Die Stabilität von MPBH und Cys-Gly, das komplizierte und ausgedehnte Verfahren bei dieser Methode beeinträchtigen jedoch die Reproduzierbarkeit, Wirksamkeit und Effizienz der Methode. In diesem neuen Protokoll haben wir sowohl MPBH als auch Cys-Gly durch ein viel stabileres Reagenz, Glutaminsäurehydrazid (Gluhydrazid), ersetzt, was die Reproduzierbarkeit der Methode deutlich verbessert, das gesamte Verfahren vereinfacht und verkürzt hat, so dass es innerhalb eines Arbeitstages abgeschlossen werden kann. In diesem neuen Protokoll beschreiben wir das detaillierte Verfahren des Protokolls, das von normalen Labors ohne weiteres für routinemäßige Proteinglykosylierungsstudien übernommen werden kann, sowie die Techniken, die notwendig sind, um reproduzierbare und wiederholbare Ergebnisse zu erzielen.

Protocol

1. Drucken Sie einen Antikörper Microarray für die Assay-

1. Die Serum-Antikörper bis 0,5 mg / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2 (PBS).
2. 40 ul Aliquot jedes Antikörpers in die 384-Well-Platte Quelle.
3. Laden Sie das 384-Well-Platte auf die Quelle Scienion sciFLEXARRAYER Microarrayer.
4. Legen Sie 20 PATH Microarray Slides auf den Microarrayer als Ziel.
5. Stellen Sie die Microarrayer zu 48 identische Untergruppen, in denen 27-Antikörpern und Kontroll-Proteinen in dreifacher Ausfertigung in einer 9x9-Muster (Abbildung 1E, 1F) gesichtet werden zu drucken.
6. Starten Sie den Microarrayer, um die Antikörper Microarray-Slides zu drucken.
7. Sammeln Sie die Antikörper Microarray Slides, und speichern sie in Dias Kassette mit Trockenmittel. Vakuumieren Sie die Kassette in einer Plastiktüte mit Folienschweißgerät (FoodSaver).
8. Lagern Sie die versiegelte Microarray Slides bei 4 ° C im Kühlschrank.

2. Chemisch blockieren Antikörper Microarray GBP zu verhindernBindung an die Fänger-Antikörper

Die Mikroarray-Test beginnt, sobald die Microarray-Slides sind chemisch blockiert und dauert ca. 8 Stunden. Nach dem Start der Microarray-Assay wurde abgeschlossen werden (Schritte 2 bis 8).

1. Nehmen Sie die Microarray-Slides aus dem Kühlschrank, und sie ins Gleichgewicht auf Raumtemperatur für 30 Minuten.
2. Entfernen der Folie aus dem Aufbewahrungsbehälter und kurz spülen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 mit 0,1% Tween 20 (PBST0.1) einmal in einer Folie Waschbecken, und dann in 15 mM Natriumacetat, pH 5,0 mit 0,1% Tween (CBT0 .1) in einer sequenziellen Weise. Die Objektträger in CBT0.1 für 10 Minuten in Folie Waschbecken.
3. Bereiten Sie frischen 150 mM NaIO ₄ in 15 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,0 (CB), und halten Sie sie in in eine Folie Waschbecken in einem Kühlschrank bei gleichzeitiger Vermeidung Licht vor dem Gebrauch.
4. Entfernen Sie die Folie aus der CB, und steckte es in das Becken mit frischem NaIO ₄ mit dem Antikörper Seitenach oben zeigt. Decken Sie die Schüssel mit Alufolie, um Licht zu vermeiden, und inkubieren Sie die Folie Becken für 2 Stunden unter leichtem Schütteln bei 4 ° C im Kühlschrank aufbewahrt.
5. Bereiten Sie 300 ml 10 mM Hydrazid Glutaminsäure (der Blocker) in CB.
6. Entfernen Sie die Folie aus dem Becken, und spülen Sie ihn kurz in CB 3 mal für jeweils 5 min in Folie Waschbecken.
7. Objektträger in der Blocker in ein Waschbecken für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
8. Entfernen Sie die Dias aus dem Becken, und waschen Sie sie mit PBST0.1 für 3 Minuten.

3. Sperren nicht-spezifische Bindungen zu dem Mikroarray mit Rinderserumalbumin (BSA)

1. Planen 300 ml 1% BSA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 mit 0,5% Tween (PBST0.5) in einem Schlitten Waschbecken, und Inkubieren des Mikroarrays Folie in dem Becken für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln.
2. Spülen Sie die Folien in PBST0.1 dreimal für jeweils 3 Minuten Zeit.
3. Legen Sie die Folieauf einer Folie Rack, und drehen sich mit 1.200 xg auf einer Zentrifugation für 2 Minuten, um die Dia-Mikroarray trocknen.

4. Impressum Wax Gitter auf den Microarray-Slide an jede Untergruppe Trennen

1. Vorwärmen das Wachs Imprinter bei 70 ° C für 5 Minuten.
2. Laden Sie das blockierte Microarray gleiten in den Wachs-Imprinter mit Antikörper Seite nach dem Wachs. Ziehen Sie den Griff zum Impressum Wachs gleichmäßig auf den Objektträger.

5. Bewerben Serumproben auf den Microarray-Slide

1. Während der Schritt 2.4, bereiten Serumproben entweder für Glyco-Profiling-Test in einer Probe (5.1.1), oder einzelne Glyco epiptope Messung von mehreren Proben (5.1.2).
   1. In einem Experiment für die Glykan Profilierungen mehrerer Serumglycoproteinen in einer Serumprobe, indem Sie mehrere Euros (siehe Probe Experiment 1), wird ein Serum-Proben auf alle Untergruppen angewendet werden. In diesem Fall wird 40 ul Serum ausreichend in 360 ul PBS, enthaltend 0,1% verdünntTween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml Maus-IgG, 100 ug / ml Ratten-IgG, 100 ug / ml Kaninchen-IgG, 100 ug / ml Ziegen IgG und 100 ug / ml IgG Esel. Diese Menge ist ausreichend für die Anwendung von 6 ul verdünnte Serum-Lösung auf jedes Sub-Arrays.
   2. In einem Experiment für die eine Glykan Messung an mehreren Serumproteine ​​unter mehreren Serumproben unter Verwendung eines GBP Erkennungen (siehe Beispiel Experiment 2). In diesem Fall wird 1 ul Serum ausreichend in 9 l PBS, enthaltend 0,1% Tween-20 verdünnt, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml Maus-IgG, 100 ug / ml Ratten-IgG, 100 ug / ml Kaninchen-IgG , 100 ug / ml Ziegen IgG und 100 ug / ml IgG Esel. Diese Menge ist ausreichend für die Anwendung von 6 ul verdünnte Serum-Lösung auf jedes Sub-Arrays.
2. Nach Wachs Impressum in Schritt 4, sorgfältig anwenden 6 ul der verdünnten Proben bzw. Kontrollproben (PBST0.1) zu jedem Subarray des Schlittens. Inkubieren Sie den Objektträger in einer feuchten Kassette mit feuchten Papiertüchern bei Raumtemperaturfür 1 Stunde.
3. Spülen Sie den Schlitten mit PBST0.1 dreimal für jeweils 3 Minuten Zeit.
4. Trocknen Sie die Folie, durch Drehen der bei 1200 xg für 2 Minuten.

6. Bewerben Biotinyliertes GBP (Lektin oder Anti-Glykan Antikörper) auf den Objektträger

1. Während der Schritt 2.4, bereiten 10μg/ml von biotinylierten Lektine / Gbps in PBST0.1.
   1. In Glykan Profiling-Experiment, dass die Sonde eine Probe mit mehreren Lektine (Probe Experiment 1), bereiten 350 ul biotinylierten Lektin, das reicht für alle Teilfelder ist.
   2. In einzelnen Glykan Epitop / Biomarker-Screening in mehreren Proben durch die Verwendung mehrerer Lektine, bereiten 10 ul jeder biotinylierten Lektin, das reicht für eine Subarray ist.
2. Bewerben 6 ul der verdünnten biotinylierten Lektin (s) zu jeder Teilmatrix von der Folie, und bebrüten in der befeuchteten schiebeschachtel mit feuchten Papiertüchern bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
3. Spülen Sie die Dias mit PBST0.1 dreimal für jeweils 3 Minuten timich.
4. Trocknen Sie die Folie, durch Drehen der bei 1200 xg in der Zentrifuge für 2 Minuten.

7. Bewerben Farbstoff markiert NeutrAvidin für Fluoreszenzdetektion

1. Bereiten Sie 350 ul DyLight 549 beschriftet NeutrAvidin, die ausreichend für alle Teilfelder ist.
2. Bewerben 6 &mgr; l DyLight 549 beschriftet NeutrAvidin auf jede Untergruppe, und inkubieren Sie die Folie in der befeuchteten Objektträger Kassette bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
3. Spülen Sie den Schlitten mit PBST0.1 dreimal für jeweils 3 Minuten Zeit.
4. Trocknen Sie die Folie durch Spinnen der es bei 1200 xg in der Zentrifuge für 2 Minuten.

8. Erhalten Microarray Slide Bild durch Scannen des Slide

1. Scannen Sie das Bild mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroarray-Scanner mit 10 mm Auflösung. Die Laser-und PMT-Einstellungen sollten so stark sein wie möglich, aber keine Sättigung vor Ort beobachtet wird.

9. Datenextraktion und-analyse

1. Öffnen Sie das Bild in ArrayPro 3.2.
Richten Sie den Array-Vorlage nach dem Array Karte, die die Antikörper Flecken Standorten zeigt. Richten Sie jede Vorlage Kreis auf die entsprechende Stelle im Bild.
2. Entpacken Sie die Intensität jedes Spots in eine Excel-Datei zur weiteren Analyse.

10. Repräsentative Ergebnisse

Probe Experiment 1

Glykosylierung Profilierung von mehreren Serumglycoproteinen in hepatozellulären Karzinoms Patientenserum Beispiel mithilfe von chemisch blockiert Antikörper-Mikroarray mit mehreren Lektine Erkennung.

Das Ziel dieses Experiments ist es, die einzelnen Glycosylierungsprofil von 20 Glykoproteine ​​in hepatozellulären Karzinoms (HCC) Patientenproben untersuchen mit Hilfe chemisch blockiert Antikörper-Mikroarray mit Lektin-Erkennung. Ein Antikörper-Mikroarray, der 48 identischen Untergruppen, die 26-Antikörpern und Biotin-BSA zählen enthält, wurde entwickelt und gebaut wie in S beschriebenTEP-1. Diese 26 Antikörper wurden gegen 20 Serumglycoproteinen, die als erste vielversprechende Diagnose Wert für HCC-Patienten unter Verwendung Lectin basierten Immunpräzipitation mit massenspektrometrischen Proteinidentifizierung ^{12, 32,} wie in Tabelle 1 gezeigt kombiniert identifiziert. Das Muster und die Anordnung der Antikörper Stellen in dreifacher Ausfertigung in einer repräsentativen Subarray gedruckt werden in 1E und 1F gezeigt. Zwei identische Microarray Substrate, war eine nicht chemisch blockiert (1A), während die andere wurde (1B), wurden verwendet, um die Durchführung der gleichen Glykosylierung Profilierung Experiment, um die Bedeutung der chemisch blockiert Verfahren zur Analyse nachweisen. Für die chemisch blockiert Schieber (Abbildung 1B), begann das Experiment an der Stufe 2, für die keine chemisch blockiert Schieber (Abbildung 1A), begann das Experiment ab Schritt 3. Das Experiment wurde durchgeführt, indem following alle Schritte in dem Protokoll mit Ausnahme von Schritt 5.1.2 und 6.1.2 beschrieben. Im Schritt 5.2 wurde eine Kontrollprobe PBST0.1 auf Subarrays in Spalte 1 und 3 angelegt und eine gepoolte HCC Serumprobe wurde auf Teilfelder in Spalte 2 bzw. 4 aufgetragen (wie in Figur 1G gezeigt). Dieser Vergleich ist es, die Effektivität, Effizienz des Verfahrens, sowie die Antigen-Bindungsaffinität der Antikörper nach der chemisch blockiert zeigen. 22 biotinylierten Lektine (wie in Tabelle 1 gezeigt), die speziell für verschiedene Glykane ^{18, 20} auf jeder Teilmatrix angewendet wurden, wie in 1G für die Glycosylierung Profilierung gezeigt. Bilder der chemisch blockiert (Abbildung 1B) und nicht-chemisch blockiert (Abbildung 1A) Microarrays nach der Glykosylierung Profiling-Test, indem Sie das Protokoll. Wie in den Subarrays in Spalte 1 und 3 in nicht-chemisch blockiert Mikroarrays (1A und 1C), gezeigt, auf demnur PBST0.1 angelegt wurde, die meisten Lektine gebunden an Antikörper zu erfassen, und zeigten eine sehr hohe Hintergrund vergleichbar mit den Sub-Arrays in Spalte 2 und 4, auf dem der Serum-Probe wurde aufgetragen. Es ist unmöglich, Glykan Profilinformationen ins Mikroarray Folie zu erhalten. Im Gegenteil, wenn das gleiche Experiment auf einem chemisch blockiert Antikörper Microarray Objektträger wurde durchgeführt, die Sub-Arrays in Spalte 1 und 3, auf denen nur PBST0.1 angelegt wurde, zeigten die meisten Lektine keine oder nur geringe Bindungen an Antikörper zu erfassen, während hohe Antigen Bindungen wurden noch in Untergruppen in Spalte 2 und 4 beobachtet, an dem Serumprobe angewandt wurde (1B und 1D). Diese Ergebnisse zeigten, das chemisch blockiert Verfahren war ein entscheidender Schritt Vordergrund der Messung der Antikörper-Glykane auf Glykoproteinen eingefangen. Mit dem Anschluss an das Protokoll, kann Glycosylierungsprofilen von 22 Glykoproteine ​​in HCC Serum gewonnen werden.

Experiment 2

Screen für veränderte fucoslierung auf spezifische Serum-Glykoproteine ​​als Biomarker für diskriminiert Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom-Patienten.

Das Ziel dieses Experiments ist es, Bildschirm für veränderte Fucosylierung auf spezifische Serum-Glykoproteine ​​als Biomarker, die Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom (HCC) Patienten zu diskriminieren. Verschiedene aus dem Experiment 1, die nur ein Serumprobe auf alle Untergruppen angewendet wurde und sondiert mit verschiedenen Lectinen, in diesem Assay, insgesamt 40 verschiedene Serumproben von Patienten mit Leberzirrhose und HCC wurden auf jede Untergruppe angelegt, und sondiert mit einem Lektin (AAL ). Die statistische Analyse, wie T-Test, Receiver-Operating Characteristic (ROC)-Kurve, wurde durchgeführt, um die Verteilungen oder diagnostische Leistung des Glycans epiptope / Biomarker für jedes einzelne Protein in allen Serumproben zu bewerten. Wir verwendeten die gleichen Antikörper Mikroarray in Versuch 1 hergestellt, außer für anti-CA19-9 und anti-Lewis-X-Antikörper in dieser Studie. Das Knowiment wurde vom 2. September bis 9 durchgeführt, außer für den Schritt 5.1.1 und 6.1.1 fort. Insgesamt 40 Serumproben von 20 Leberzirrhose und 20 Patienten mit HCC wurden zufällig Untermatrix der 48 Subarrays zusammen mit den Steuerdaten PBS Proben als negative Kontrolle eingesetzt. Fukosylierung jedes der erfassten Proteine ​​wurde dann durch Verwendung von biotinylierten Fucose-spezifischen Lektin detektiert. Die Mikroarray-Bild in 1 gezeigt nachgewiesen das Lektin AAL nur Serumproteinen, auf dem Mikroarray (2D) anstelle von gebundenen Antikörper (2E) aufgenommen gebunden. Die AAL Bindung Intensitäten aller Punkte wurden dann extrahiert und analysiert unter Verwendung von T-Test und ROC-Kurven, um die Leistung des Fucosylierung (AAL Bindungsintensität) von jedem Serum-Protein auf der Diskriminierung zwischen den HCC und Zirrhose evaluieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Fucosylierung von GP73-Protein die beste Diskriminierung zwischen den beiden Gruppen gab mit einem p = 0,03 und die Fläche unter-Kurve der ROC-Kurve ist gleich 0,72. Dieses Experiment zeigte, dieses Verfahren ist eine schnelle, effiziente Methode zur Glycan Epitop / Biomarker-Screening auf mehrere Proben innerhalb mehrerer Proteine.

Identifikation	Name des Reagenzes	Abkürzung	Firma	Katalog #
L1	Biotinyliertes Concanavalin A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	Biotinyliertes Sambucus nigra-Lectin	SNA	Vector Laboratories	B-1305
L3	Biotinyliertes Lens culinaris Agglutinin	LCA	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Biotinylierte Ricinus communis-Agglutinin I	RCA	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Biotinyliertes Aleuria aurantia-Lectin	AAL	Vector Laboratories	B-1395
L6	Biotinyliertes Erythrina cristagalli Lektin	ECL	Vector Laboratories	BK-3000
L7	Biotinyliertes Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lektin II	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Biotinyliertes Weizenkeim-Agglutinin	WGA	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Biotinyliertes Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	Biotinyliertes Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	Biobiotinylierte Erdnußagglutinin	PNA	Vector Laboratories	BK-1000
L12	Biotinylierte Pisum sativum Agglutinin	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Biotinyliertes Dolichos biflorus Agglutinin	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Biotinyliertes Datura Stramonium Lektin	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Biotinyliertes Sophora Japonica Agglutinin	SJA	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Biotinyliertes Sojabohnen Agglutinin	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Biotinyliertes Solanum tuberosum (Kartoffel) Lektin	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	Biotinyliertes Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lektin I	GSL ich	Vector Laboratories	BK-2000
L19	Biotinylierte Vicia villosa-Lectin	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Biotinyliertes Lycopersicon esculentum (Tomate) Lektin	UEG	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Biotinyliertes Ulex europaeus Agglutinin I	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Biotinyliertes Jacalin	Jacalin	Vector Laboratories	BK-3000
A1	Ziegen-F (ab ') 2 Fragment Anti-Human-IgM, Antikörper Fc5μ	IgM	Jackson Immuno Research	109-006-129
A2	Esel F (ab ') 2Frag Anti-Human-IgG (H + L) antibody	AB1	Jackson Immuno Research	709-006-149
A3	Maus Anti-Human-IgG F (ab ') 2-Antikörpers	AB3	Jackson Immuno Research	209-005-097
A4	Anti-Human-Alpha-2-Makroglobulin polyklonalen Antikörper	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Kaninchen anti-Human-alpha-1-Antitrypsin polyklonaler Antikörper	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Maus Anti-Human-alpha-1-Antitrypsin monoklonalen Antikörper	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Kaninchen anti-Human-alpha-1-Antitrypsin polyklonaler Antikörper	HANDELN	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	Kaninchen anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyklonaler Antikörper	HANDELN	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Maus Anti-Human-Transferrin monoklonalen Antikörper	Transferrin	GeneTex	GTX101035
A10	Kaninchen anti-Human-Transferrin polyklonaler Antikörper	Transferrin	GeneTex	GTX77130
A11	Anti-Human-Apolipoprotein J polyklonaler Antikörper	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	Maus Anti-Human-GP73 monoklonalen Antikörper	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Maus Anti-Human-GP73 monoklonalen Antikörper	GP73	Santa Cruz Biotechnology INC	sc-101275
A14	Kaninchen anti-Human-alpha-1 Fetoprotein polyklonaler Antikörper	AFP	GenWay	GWB-41C966
A15	Maus Anti-Human-alpha-1 Fetoprotein monoklonalen Antikörper	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Maus Anti-Human-Hämopexin monoklonalen Antikörper	Hämopexin	Assaypro	60190-05011
A17	Maus Anti-Human-Glypican-3 (1G12) monoklonaler Antikörper	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Maus Anti-Human-Kininogen (LMW) monoklonaler Antikörper	Kininogen	Assaypro	20333-05011
A19	Kaninchen anti-Human-MMP-21 monoklonalen Antikörpers	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Maus Anti-Human-CEACAM-1 monoklonalen Antikörper	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
Ein21	Ratten-Anti-Human-DPPIV/CD26 monoklonalen Antikörper	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Maus Anti-Human-PIVKA-II-monoklonalen Antikörpers	PIVICA	Kristall-chem	8040
A23	Maus anti-carcinoembryonales Antigen	CEA	US biologischen	C1300
A24	Maus anti-CA125 Cancer Antigen	CA125	US biologischen	C0050-01D
A25	Maus anti-CA19-9 Cancer Antigen	CA19-9	US biologischen	C0075-18
A26	Maus Anti-Lewis-x monoklonalen Antikörper	Lewis-X	Calbiochem	434631
Bio	Biotinyliertes BSA (positive Kontrolle)	Bio	Hausgemachte	N / A

Tabelle 1. Liste der Lektine und Antikörper in diesem Protokoll verwendet.

Name des Reagenzes s / Ausrüstungen	Firma	Katalog-Nummer
Berührungslose Microarrayer	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 Mikroplatte	Fischer	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultradünne Nitrocellulose Coate Microarray-Slides	Gentel	PATH
Slide Imprinter (optional)	Das Gel Unternehmen	WSP60-1
Shaker	Fischer	15-453-211
Zentrifugieren	Eppendorf	5804 000.013
Schieben Waschbecken / Glaszylinder, Schale with Wechselrahmen	Fischer	08-812
Slide Inkubationskammer / Objektträger-Box	Fischer	03-448-5
Brij 35, 30 w / v% igen Lösung in Wasser	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Fischer	P337-100
Natriumperiodat (NaIO 4)	Sigma	311448
L-Glutaminsäure-γ-hydrazid	Sigma	G-7257
Natriumacetat wasserfrei (CH 3 COONa)	Sigma	S2889
Rinderserumalbumin (BSA)	Lampire Biologische Labs	7500804
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10X)	Scientific Denville	CP4390-48
DyLight 549 konjugierten NeutrAvidin	Thermo	22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	4693159001
ChromPure Human-IgG, Fc-Fragment	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure Human-IgG, ganze Molekül	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure Maus-IgG, ganze Molekül	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc-Fragment	Jackson Immunoresearch	015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, ganze Molekül	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure Donkey IgG, ganze Molekül	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Microarray Scanner	Tecan	LS Reloaded

Tabelle 2. Listevon Geräten und Reagenzien in diesem Protokoll verwendet.

Schema 1 ein Schema, das Lektin Antikörper Microarray-Basis Glykan Biomarkern Prozess 1 (Schritt 2 bis 4): Blockieren Sie die Antikörper mit der Microarray-Blocker (Glu-hydrazid) und BSA; 2 (Schritt 5):.. Gelten Serumproben und erfassen spezifische Glykoproteine ​​mit spezifischen Antikörpern; 3 (Schritt 6): gelten biotinylierten Lektin (s); 4 (Schritt 7): Probe der biotinylierte AAL DyLight mit 549 beschriftet NeutrAvidin für Microarray-Bildgebung.

Abbildung 1. Microarray-Bilder der Probe Experiment 1 Glykosylierung Profilierung von mehreren Serumglycoproteinen in HCC Patienten Serumprobe mit ChemicVerbündeter blockiert Antikörper Microarray mit mehreren Lectin Detektion. Zwei identische Microarray Slides, (A) keine chemisch blockiert, oder (B) chemisch blockiert, wie in Schritt 2 beschrieben, beide gingen durch alle Schritte 2 bis 9 für die Glykosylierung Profiling, sowie Vergleich Zweck. (A) und (B) werden die Microarray-Bildern bei Schritt 8 in einer Auflösung von 10 Mikrometern gescannt. (D) die Zoom-Bild der ersten beiden Zeilen des nicht chemisch blockiert Mikroarray Folie (B));, (C) die Zoom-Bild der ersten zwei Zeilen der keine chemisch Mikroarray Folie (A) blockiert (E) Das Diagramm des Antikörpers Anordnung innerhalb jedes Sub-Arrays; (F)-Array-Karten: Die Lage der einzelnen Antikörper innerhalb der Subarray stellt jedes Antikörper-Name 3 Spots, (g) Serumprobe und Lektin Lage: Ein Diagramm zeigt, welche Subarray jeder Serumprobe und Lectin wurde auf aufgebracht.

Abbildung 2. Microarray-Bildern von derProbe Experiment 2 Bildschirm für veränderte Fucosylierung auf spezifische Serum-Glykoproteine ​​als Biomarker dass diskriminieren Leberzirrhose und HCC-Patienten. Die Microarray-Assay wurde wie im Sample-Experiment 2 beschrieben durchgeführt. (A) Die gesamte Folie Bild des Mikroarrays Folie aus Schritt 8, (B) die Darstellung der Antikörper-Anordnung innerhalb jedes Sub-Arrays, (C)-Array-Karten: Die Lage der einzelnen Antikörper innerhalb der Subarray stellt jedes Antikörper-Name 3 Spots; (D) ein Zoom-in-Bild einer Untermatrix, die mit Serumprobe inkubiert wurden, (E) ein Zoom-in-Bild einer Untermatrix, die mit PBS-Kontrolle inkubiert wurden.

Abbildung 3. Glycan Profiling-Ergebnisse von Probe-Experiment ein. Jedes Balkendiagramm darstellen Lectin Profil (oder Glykan Profile) von einem der 20 getesteten Proteins. Insgesamt 22 verschiedene Lektine wurden verwendet, um th zu analysierene Glykan Profil jedes Protein.

Discussion

1. Zielprotein und Fängerantikörper Auswahl

Vor der Antikörper-Mikroarray-Test werden einige Reagenzien und Materialien benötigt, um in Betracht gezogen werden und vorbereitet. Um einen Antikörper Microarray-Profiling für Glykan oder Glykan Biomarker-Screening, ein Gremium von spezifischen Antikörpern gegen Glykoprotein Kandidaten entwerfen sollte nach der Literatur oder von früheren Ergebnissen festgestellt werden. Diese Antikörper wurden in der Regel von verschiedenen Anbietern wie R & D ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Identifikation	Name des Reagenzes	Abkürzung	Firma	Katalog #
L1	Biotinyliertes Concanavalin A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	Biotinyliertes Sambucus nigra-Lectin	SNA	Vector Laboratories	B-1305
L3	Biotinyliertes Lens culinaris Agglutinin	LCA	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Biotinylierte Ricinus communis-Agglutinin I	RCA	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Biotinyliertes Aleuria aurantia-Lectin	AAL	Vector Laboratories	B-1395
L6	Biotinyliertes Erythrina cristagalli Lektin	ECL	Vector Laboratories	BK-3000
L7	Biotinyliertes Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lektin II	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Biotinyliertes Weizenkeim-Agglutinin	WGA	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Biotinyliertes Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	Biotinyliertes Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	Biotinyliertes Erdnußagglutinin	PNA	Vector Laboratories	BK-1000
L12	Biotinylierte Pisum sativum Agglutinin	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Biotinyliertes Dolichos biflorus Agglutinin	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Biotinyliertes Datura Stramonium Lektin	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Biotinyliertes Sophora Japonica Agglutinin	SJA	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Biotinyliertes Sojabohnen Agglutinin	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Biotinyliertes Solanum tuberosum (Kartoffel) Lektin	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	Biotinyliertes Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lektin I	GSL ich	Vector Laboratories	BK-2000
L19	Biotinylierte Vicia villosa-Lectin	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Biotinyliertes Lycopersicon esculentum (Tomate) Lektin	UEG	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Biotinyliertes Ulex europaeus Agglutinin I	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Biotinyliertes Jacalin	Jacalin	Vector Laboratories	BK-3000
A1	Ziegen-F (ab ') 2 Fragment Anti-Human-IgM, Antikörper Fc5μ	IgM	Jackson Immuno Research	109-006-129
A2	Esel F (ab ') 2 Frag Anti-Human-IgG (H + L) einkörper-	AB1	Jackson Immuno Research	709-006-149
A3	Maus Anti-Human-IgG F (ab ') 2-Antikörpers	AB3	Jackson Immuno Research	209-005-097
A4	Anti-Human-Alpha-2-Makroglobulin polyklonalen Antikörper	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Kaninchen anti-Human-alpha-1-Antitrypsin polyklonaler Antikörper	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Maus Anti-Human-alpha-1-Antitrypsin monoklonalen Antikörper	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Kaninchen anti-Human-alpha-1-Antitrypsin polyklonaler Antikörper	HANDELN	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	Kaninchen anti-humanAlpha-1-Antichymotrypsin polyklonaler Antikörper	HANDELN	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Maus Anti-Human-Transferrin monoklonalen Antikörper	Transferrin	GeneTex	GTX101035
A10	Kaninchen anti-Human-Transferrin polyklonaler Antikörper	Transferrin	GeneTex	GTX77130
A11	Anti-Human-Apolipoprotein J polyklonaler Antikörper	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	Maus Anti-Human-GP73 monoklonalen Antikörper	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Maus Anti-Human-GP73 monoklonalen Antikörper	GP73	Santa Cruz Biotechnology INC	sc-101275
A14	Kaninchen anti-human alpha-1 fetoprotein polyklonaler Antikörper	AFP	Genway	GWB-41C966
A15	Maus Anti-Human-alpha-1 Fetoprotein monoklonalen Antikörper	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Maus Anti-Human-Hämopexin monoklonalen Antikörper	Hämopexin	Assaypro	60190-05011
A17	Maus Anti-Human-Glypican-3 (1G12) monoklonaler Antikörper	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Maus Anti-Human-Kininogen (LMW) monoklonaler Antikörper	Kininogen	Assaypro	20333-05011
A19	Kaninchen anti-Human-MMP-21 monoklonalen Antikörpers	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Maus Anti-Human-CEACAM-1-monoklonalen Antiköry	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
A21	Ratten-Anti-Human-DPPIV/CD26 monoklonalen Antikörper	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Maus Anti-Human-PIVKA-II-monoklonalen Antikörpers	PIVICA	Kristall-chem	8040
A23	Maus anti-carcinoembryonales Antigen	CEA	US biologischen	C1300
A24	Maus anti-CA125 Cancer Antigen	CA125	US biologischen	C0050-01D
A25	Maus anti-CA19-9 Cancer Antigen	CA19-9	US biologischen	C0075-18
A26	Maus Anti-Lewis-x monoklonalen Antikörper	Lewis-X	Calbiochem	434631
Bio	Biotinyliertes BSA (positive Kontrolle)	Bio	Hausgemachte	N / A

Name des Reagenzes s / Ausrüstungen	Firma	Katalog-Nummer
Berührungslose Microarrayer	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 Mikroplatte	Fischer	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultradünne Nitrocellulose Coate Microarray-Slides	Gentel	PATH
Slide Imprinter (optional)	Das Gel Unternehmen	WSP60-1
Shaker	Fischer	15-453-211
Zentrifugieren	Eppendorf	5804 000.013
Slide Waschbecken / Glaszylinder, Schale mit Wechselrahmen	Fischer	08-812
Slide Inkubationskammer / Objektträger-Box	Fischer	03-448-5
Brij 35, 30 w / v% igen Lösung in Wasser	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Fischer	P337-100
Natriumperiodat (NaIO 4)	Sigma	311448
L-Glutaminsäure-γ-hydrazid	Sigma	G-7257
Natriumacetat wasserfrei (CH 3 COONa)	Sigma	S2889
Rinderserumalbumin (BSA)	Lampire Biologische Labs	7500804
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10X)	Scientific Denville	CP4390-48
DyLight 549 konjugierten NeutrAvidin	Thermo	22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	4693159001
ChromPure Human-IgG, Fc-Fragment	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure Human-IgG, ganze Molekül	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure Maus-IgG, ganze Molekül	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc-Fragment	Jackson Immunoresearch	015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, ganze Molekül	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure Donkey IgG, ganze Molekül	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Microarray Scanner	Tecan	LS Reloaded