Messung der Faktor V-Aktivität in humanem Plasma unter Verwendung eines Mikroplatten Koagulationsanalyse

Summary

Diese Studie beschreibt eine neue Mikrotiterplatte Assay, FV Gerinnungsaktivität misst während Fibrin Gerinnselbildung in Humanplasma, die zuvor noch nicht gemeldet. Das Verfahren verwendet eine kinetische Mikroplattenleser das kontinuierliche Messen der Änderung der Absorption bei 405 nm während Fibrin Gerinnselbildung in humanem Plasma.

Abstract

In Reaktion auf eine Verletzung ist die Blutgerinnung aktiviert und führt zur Erzeugung der Gerinnungszeit Protease, Thrombin. Thrombin spaltet Fibrinogen zu Fibrin bildet eine unlösliche Klumpen, die Blutung stoppt. Faktor V (FV) in seiner aktivierten Form, FVa, ist ein kritischer Cofaktor für die Protease Faktor Xa und Beschleuniger der Thrombinbildung während Fibrin Gerinnselbildung als Teil Prothrombinase ^{1, 2.} Manuelle FV Assays wurden ^{3, 4} beschrieben, aber sie sind zeitaufwendig und subjektiv. Automatisierte FV Assays wurden beschrieben ^5-7, aber der Analysator und Reagenzien sind teuer und in der Regel lediglich die Gerinnungszeit, nicht die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Fibrinbildung. Die Mikrotiterplatte Plattform zur Messung enzymkatalysierten Veranstaltungen wegen der Bequemlichkeit bevorzugt, Zeit, Kosten, kleines Volumen, kontinuierliche Überwachung und ^{High-Throughput-8, 9.} Microplate Assays wurden für Gerinnsel-Lyse ^10, Thrombozytenaggregation gemeldet11 und Gerinnungsfaktoren ^12, jedoch nicht für FV-Aktivität in menschlichem Plasma. Das Ziel des Verfahrens war es, eine Mikroplatten-Assay, der FV-Aktivität misst während der Fibrinbildung in humanem Plasma zu entwickeln.

Diese neuartige Mikroplatte Verfahren stellt eine einfache, kostengünstige und rasche Bestimmung von FV-Aktivität in menschlichem Plasma. Der Assay beruht auf einer kinetischen Mikroplattenleser die Extinktionsänderung bei 405 nm während der Fibrinbildung in Humanplasma (Abbildung 1) ¹³ zu überwachen. Der Assay misst genau die Zeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß von Fibrin Gerinnselbildung. Es erfordert nur ul Mengen von Plasma ist in 6 min abgeschlossen hat hohem Durchsatz, ist empfindlich gegen 24-80pM FV, und misst die Menge an unbeabsichtigt betätigt (1-stufig Aktivität) und Thrombin-aktivierten FV (2-Stufen-Aktivität ), um eine umfassende Beurteilung des gesamten funktionelle Aktivität (2-stufig Aktivität - 1-Stufen-Aktivität).

Disseminierte intravasdere Gerinnung (DIC) ist eine erworbene Gerinnungsstörungen, die am häufigsten entwickelt sich aus bereits bestehenden Infektionen ^14. DIC ist mit einer schlechten Prognose und erhöht die Mortalität über dem bereits bestehenden Pathologie ¹⁵ zugeordnet. Der Assay wurde verwendet, um zu zeigen, dass in 9 Patienten mit DIC, der FV 1-stufig, 2-stufig, und insgesamt Tätigkeiten verringert wurden, im Durchschnitt um 54%, 44% und 42%, verglichen mit normalen gepoolten menschlichen Referenz-Plasma (NHP).

Der FV Mikroplattenassay ist leicht anpassbar an die Tätigkeit jedes Gerinnungsfaktor messen. Dieser Assay wird unser Verständnis der FV Biochemie durch eine genauere und vollständigere Messung seiner Tätigkeit in Forschung und klinischen Umgebungen zu erhöhen. Diese Informationen werden positiv beeinflussen Umgebungen im Gesundheitswesen durch eine frühere Diagnose und Entwicklung von wirksameren Therapien für Gerinnungsstörungen, wie DIC.

Protocol

Ein. Vorbereitung der FV-defizienten Humanplasma

1. Dieses Verfahren ist eine Modifikation des Verfahrens ursprünglich von Bloom et al ⁴ beschrieben.
2. Erhalten menschlichem Vollblut von einem zustimmenden gesunden erwachsenen Freiwilligen (männlich oder weiblich, Alter 18 - 50 Jahre), die nicht unter wird keine Medikamente. Latexhandschuhe und einen Laborkittel während des gesamten Verfahrens.
3. Es werden 100 ml 3,2% (w / v) Trinatriumcitrat in destilliertem Wasser. Legen Sie 6,0 ml dieser Lösung werden in separaten 60 ml Spritzen. Entfernen Sie die Luft durch Drücken Kolben vorsichtig auf den 6,0 ml-Markierung auf der Spritze.
4. Verwenden Sie einen Alkoholtupfer, um Bereich Cubitalvene zwischen Bizeps und Unterarm zu reinigen. Schließen 20 Gauge Schmetterling Vorrichtung an einer 3 ml Spritze. Legen Butterfly-Nadel in Cubitalvene und ziehen vorsichtig auf Kolben, bis Blut füllt die 3 ml-Marke. Entsorgen Sie Spritze mit Blut. Dieser Schritt wird ausgeführt, um jegliche Gewebsfaktor aus dem beschädigten Endothel an der Nadel gelöst zu entfernenVerletzungen Website, die Koagulation aktivieren kann und stören mit der Vorbereitung der FV-Mangelplasma.
5. Schließen Butterfly-Nadel bis 60 ml Spritze 'geladen' mit 6,0 ml Trinatriumcitrat und ziehen sanft auf den Kolben, bis das Blut erreicht die 60-ml-Markierung auf der Spritze. (Final Citratkonzentration 10.9mm).
6. Entfernen Sie die Spritze vom Butterfly-Nadel und vorsichtig mischen Spritze während einer behandschuhten Finger oder Daumen auf die Spritze anschließen.
7. Weiter Blutentnahme in 60 ml Spritzen mit jeweils 6,0 ml von 3,2% Trinatriumcitrat, wie oben beschrieben gefüllt. Man sollte Rückgewinnung von ca. 50% des Volumens als Citratblut Plasma nach Zentrifugation und dass 50 FV ul-Mangelplasma wird je Probe in der Mikrotiterplatte Assay erforderlich antizipieren. Unser Labor routinemäßig verarbeitet 300-420 ml Citratblut in einer Zeit mit 5-7 x 60 ml Spritzen mit jeweils 6,0 ml von 3,2% Trinatriumcitrat / Spritze. Dies ist ausreichend, FV-Mangelplasma etwa 3.000 Mikro-Platte-Assays (siehe unten).
8. Entfernen Butterfly-Nadel von freiwilligen Arm und drücken Sie eine sterile Gaze über Ort Venenpunktion für 1,0 min. Titelbild Ort Venenpunktion mit einem sterilen Verband.
9. Zentrifuge Citratblut bei 3.300 xg für 20 min bei Raumtemperatur. Recover obere gelbe Plasmaschicht einem Plastikbecher mit einem Rührstab mit einem Kunststoff-Pipette dabei nicht um die untere rote und weiße Blutkörperchen Schicht zu stören.
10. Measure Volumen von Plasma in ml und behalten 100 ul Plasma vor EDTA-Zugabe auf Eis für zukünftige Prothrombin Gerinnungszeit (PT)-Tests (siehe unten).
11. Langsam feste EDTA Citratplasma unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur zu 5mM erreichen (Endkonzentration). Sobald das EDTA gelöst und pH auf 7,0 durch Eintropfen von 1,0 M NaOH unter leichtem Rühren.
12. Deckel Becher mit Saran Wrap und inkubieren für 8-10 h ohne Rühren bei 37 ° C.
13. Alle 2 Std., erholen 100 ulDie EDTA-behandelten Plasma auf Eis und bestimmen die PT zum Zeitpunkt der Inkubation mit EDTA und zu vergleichen, um die PT von Plasma vor der EDTA-Zugabe (siehe oben).
14. Für die PT Bestimmungen, Ort abnehmbaren 8 gut immunomodule Streifen in Kunststoff Schablonenhalterung und insert into Mikroplatten-Reader.
15. Orient immunomodule Streifen in Mikroplatten-Reader als: leer, leer, Probe, leer, leer, Probe, leer und leer von links nach rechts in der Vorlage Inhaber Lichtstreuung Störungen von benachbarten Probe-haltigen Streifen zu minimieren. Außerdem verwende nur Brunnen 2-7 von oben nach unten in jedem 8 gut immunomodule Streifen auf Lichtstreuung Störungen von Kanten aus Kunststoff Schablonenhalterung minimieren.
16. Der FV Mikrotiterplatten-Assay ist für die Messung von Fibringerinnselbildung in mindestens 12 verschiedene Proben gleichzeitig (6 Proben pro immunomodule Streifen über 2 immunomodule Streifen).
17. Mit einer Mehrkanal-Pipette 50 ul HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4)Jede Mikrotitergefäß für jede der zu untersuchenden Probe. Mit einem einzigen Pipette 50 ul des normalen menschlichen gebündelt Referenzplasmas (NHP) oder Plasma vor der Zugabe von EDTA oder an verschiedenen Inkubationszeiten nach Zugabe von EDTA zu Mikrotitervertiefungen trennen.
18. Mit einer Mehrkanal-Pipette 50 ul Thromboplastin (siehe unten Herstellungsverfahren) an alle Mikrotitervertiefungen mit Plasma untersucht werden. Inkubieren in Mikroplatten-Reader bei 25 ° C für 1 min und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader, um die Platte während der 15-25 sec des 1 min Inkubation schütteln.
19. Mit dem Computer Schnittstelle mit dem Mikroplatten-Reader, den Zugang SoftMax Pro Software Mikroplatten Anwendung. Stellen Sie den Leser auf Absorption, Wellenlänge 405nm, Modus Kinetic, Temperatur bis 25 ° C, und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader für 5 sec schütteln, und die Extinktion bei 405 nm alle 5 Sek. für 6 min.
20. Mit einer Mehrkanal-Pipette Calciumchlorid (50 ul von 25 mM in destilliertem Wasser; 2.1mm final Konzentration), um alle Mikrotitervertiefungen, warten Sie 15 Sekunden, und drücken Sie die 'Start' Symbol auf der Mikrotiterplatte SoftMax Pro Menü, um den Test zu beginnen.
21. Bestimmen Sie die PTs aus der Extinktion gegen die Zeit-Profile in SoftMax Pro, wie die Zeit die Hälfte der maximalen Zunahme der Absorption bei 405nm (Die Mitte der sigmoidal Extinktion gegen die Zeit-Kurve nach Thromboplastin und Calciumchlorid Zusätzlich produziert. Siehe unten zu erreichen, Abbildung 1).
22. Berechnen Sie die FV 1-stufig Aktivität aus dem Log Clot Time (sec) vs Log FV Aktivität (Einheiten / ml), wie unten in Abbildung 2A dargestellt. Für die Quantifizierung Zwecke wird 1HE der FV-Aktivität als die Aktivität in 1,0 ml NHP vor vorsätzlichen Aktivierung mit aufgenommen Thrombin (Siehe unten, Assaying menschlichem Blutplasma-Proben mit dem FV 1-stufig und 2-stufiger Mikroplatten Koagulationsanalyse) definiert.
23. Planen 4.0l von 20 mM HEPES, enthaltend 0,15 M NaCl in destilliertem Wasser unter leichtem Rühren. Der pH-Wert auf 7,4 mit langsamen dropwise Zugabe von 5.0M NaOH (HBS, pH 7,4).
24. Besorgen Sie sich eine ausreichende Länge der Dialyseschlauch und gründlich mit destilliertem Wasser. Einen Knoten in ein Ende des Schlauchs. Transfer EDTA behandelte Plasma in einen Dialyseschlauch mit einem Kunststoff-Pipette, Luft zu entfernen, und binden Sie einen Knoten in das andere Ende des Schlauchs.
25. Sorgfältig hängen die EDTA-behandelte Plasma in den Schlauch in die HBS unter leichtem Rühren. Deckel mit Saran Wrap und Dialyse für 14-16h unter leichtem Rühren bei 4 ° C.
26. Entfernen Sie vorsichtig das EDTA-treated/dialyzed Plasma in 3,0 ml Aliquots auf 15,0 ml mit Schraubverschluss Röhrchen und behalten 100 ul für PT-Assay von 'final' FV-Mangelplasma auf Eis. Bewahren Sie die FV-Mangelplasma in bei -80 ° C bis zur Verwendung. Unter den oben beschriebenen Bedingungen, die PTs Anstieg von 10 bis 15 Sekunden vor EDTA Neben 90-100 sec 8-10 Stunden nach EDTA-Zugabe. Die FV-Mangelplasma nach dieser Methode hergestellt routinemäßig enthält weniger als 0,1% der aktiven FV im Ausgangsgemischfrisches Humanplasma.

2. Herstellung von Thromboplastin

1. Dialyse gezwungen ist, einen Calcium aus diesem Reagenz zu entfernen, um präzise Timing Fibringerinnselbildung vom Zeitpunkt der Zugabe Calciumchlorid zur Gerinnung einzuleiten gestatten.
2. Planen 100 ml und 4.0l von 20mM HEPES und 0,15 M NaCl in destilliertem Wasser in einem Kunststoffbecher unter leichtem Rühren. PH-Einstellung auf 7,4 unter langsamen Zutropfen von 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4).
3. Fügen Sie 6,0 ml HBS, pH 7,4 auf jeder Flasche des Thromboplastinreagenz, ersetzen Deckel, und schütteln Sie leicht zu lösen. Inkubieren Reagenz in verschlossenen Ampullen für 15 min bei Raumtemperatur auf getrocknete Material aufzulösen. Leicht schütteln, um sich vollständig aufzulösen.
4. Schneiden Sie eine ausreichende Länge der Dialyseschlauch, gründlich mit destilliertem Wasser, und binden Sie ein Ende des Schlauchs mit einem Knoten. Übertragen Thromboplastinzeit einen Dialyseschlauch, Luft zu entfernen, und binden Sie andere Ende des Schlauchs mit einem Knoten.
5. Carefully hängen Dialyseschlauch in 4.0l von HBS, pH 7,4 und vorsichtig umrühren bedeckt mit Saran Wrap bei 4 ° C für 14-16 Std.
6. Übertragen 3,0 ml Aliquots der dialysierten Thromboplastinzeit bis 15 ml mit Schraubverschluss Röhrchen und bei -80 ° C bis zur Verwendung.

3. Vorbereitung der FV 1-stufig Microplate Koagulationsanalyse Activity Norm Curves

1. Auftauen FV-Mangelplasma, NHP, und Thromboplastin bei 37 ° C für 10 min. Vorsichtig mischen FV-Mangelplasma und Thromboplastin unabhängig, Transfer zum Kunststoff-Wasch-Trays zu trennen und auf Eis inkubieren. Bewahren Sie die NHP auf Eis nach vorsichtigem Mischen. Laden Calciumchlorid (25 mM in destilliertem Wasser) in einem separaten Fach Waschen bei Raumtemperatur.
2. Bereiten 200 ul jeder der 2-fach serielle Verdünnungen von NHP von 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-fach in HBS mit pH 7,4 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex gut und auf Eis inkubieren.
3. Zeigen abnehmbare 8 gut immunomodule Streifen in plastic Schablonenhalterung und insert into Mikroplatten-Reader.
4. Orient immunomodule Streifen in Mikroplatten-Reader als: leer, leer, Probe, leer, leer, Probe, leer und leer von links nach rechts in der Vorlage Inhaber Lichtstreuung Störungen von benachbarten Probe-haltigen Streifen zu minimieren. Außerdem verwende nur Brunnen 2-7 von oben nach unten in jedem 8 gut immunomodule Streifen auf Lichtstreuung Störungen von Kanten aus Kunststoff Schablonenhalterung minimieren.
5. Der FV Mikrotiterplatten-Assay ist für die Messung von Fibringerinnselbildung in mindestens 12 verschiedene Proben gleichzeitig (6 Proben pro immunomodule Streifen über 2 immunomodule Streifen).
6. Schalten Sie Mikroplatten-Reader und den Zugang SoftMax Pro Mikroplatten Anwendungssoftware.
7. Mit einer Mehrkanalpipette machen gleichzeitige Zugabe von FV-Mangelplasma (50 ul) für alle Proben Mikrotitervertiefungen. Verwenden Sie eine einzelne Pipette 50 ul der 10 serielle Verdünnungen von NHP oben, um Mikrotitervertiefungen trennen vorbereitet.
8. Mit einer Mehrkanal-Pipette Thromboplastinzeit (50 ul) für alle Probenvertiefungen. Inkubieren im Mikrotiterplattenfotometer bei 25 ° C für 1 min und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader, um die Platte während der 15-25 sec des 1 min Inkubation schütteln.
9. Mit dem Computer Schnittstelle mit dem Mikroplatten-Reader, den Zugang SoftMax Pro Software Mikroplatten Anwendung. Stellen Sie den Leser auf Absorption, Wellenlänge 405nm, Modus Kinetic, Temperatur bis 25 ° C, und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader für die ersten 5 Sekunden nach Calciumchlorid Zusätzlich zu schütteln, und messen die Absorption bei 405nm alle 5 Sek. 6 min danach. Die 5 Sek. Schütteln Intervall wird nicht in den berechneten Gerinnungszeiten USt. (siehe unten).
10. Mit einer Mehrkanal-Pipette Calciumchlorid (50 ul von 25 mM in destilliertem Wasser; Endkonzentration 3,5 mm) für alle Proben Mikrotitervertiefungen, warten Sie 15 Sekunden, drücken Sie die 'Start' Symbol in der Mikroplatten Anwendung in SoftMax Pro vom Computer auf den Beginn Assay.
11. Ter Gerinnungszeiten sind als die Zeit in Sekunden, um den Mittelpunkt zwischen dem minimalen und maximalen Absorption bei 405nm erreicht nach Thromboplastin und Calciumchlorid Zusätzlich berechnet.
12. Die Anfangsgeschwindigkeiten der Gerinnselbildung sind als die Rate der Zunahme der Absorption bei 405nm (mEinheiten / min), die die ersten fünf Zeitpunkte der Gerinnselbildung in dem linearen Abschnitt der Extinktion in Abhängigkeit von Zeit-Kurve umfasst berechnet.
13. Das Ausmaß der Gerinnselbildung wurde als die Differenz zwischen dem maximalen und minimalen Extinktion bei 405nm (Einheiten) während des Ereignisses erreicht Gerinnselbildung ermittelt.

4. Testen Human Plasma-Proben mit dem FV 1-stufig und 2-stufiger Microplate Koagulationsanalyse

1. Auftauen FV-Mangelplasma, NHP, Probe Plasmen und Thromboplastin bei 37 ° C für 10 min. Vorsichtig mischen FV-Mangelplasma und Thromboplastin unabhängig, Transfer zum Kunststoff-ELISA Waschen Schalen zu trennen und auf Eis inkubieren. Bewahren Sie die NHP und Probe Plasmen auf EisNach vorsichtigem Mischen. Laden Calciumchlorid (25 mM in destilliertem Wasser) in einem separaten Fach ELISA Waschen bei Raumtemperatur.
2. Bereiten 200 ul jeder der 40-fache Verdünnungen von NHP und Probe Plasmen in HBS, pH 7,4 mit 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex gut und auf Eis inkubieren.
3. Legen Sie ein Wechselmedium 8 gut immunomodule Streifen in Kunststoff Schablonenhalterung legen und in Mikroplatten-Reader.
4. Alternate leer, leer, Probe, leer, leer, Probe, leer und leer immunomodule Streifen von links nach rechts in der Vorlage Inhaber Lichtstreuung Störungen von benachbarten Probe enthaltenden Streifen zu minimieren. Nur 2-7 Vertiefungen von oben nach unten in jedem immunomodule Streifens an Lichtstreuung Interferenz von Kanten aus Kunststoff Schablonenhalterung minimieren.
5. Schalten Sie Mikroplatten-Reader und den Zugang SoftMax Pro Mikroplatten Anwendungssoftware.
6. Mit einer Mehrkanal-Pipette FV-Mangelplasma (50 ul) für alle Proben Mikrotitervertiefungen. Mit einem single Pipette 50 ul 40-fach verdünnte NHP oder Probe Plasmen oben, um Mikrotitervertiefungen trennen vorbereitet.
7. Mit einer Mehrkanal-Pipette Thromboplastinzeit (50 ul) für alle Probenvertiefungen. Inkubieren im Mikrotiterplattenfotometer bei 25 ° C für 1 min und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader, um die Platte während der 15-25 sec des 1 min Inkubation schütteln.
8. Mit dem Computer Schnittstelle mit dem Mikroplatten-Reader, den Zugang SoftMax Pro Software Mikroplatten Anwendung. Stellen Sie den Leser auf Absorption, Wellenlänge 405nm, Modus Kinetic, Temperatur bis 25 ° C, und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader für die ersten 5 Sekunden nach Calciumchlorid Zusätzlich zu schütteln, und messen die Absorption bei 405nm alle 5 Sek. 6 min danach. Die 5 Sek. Schütteln Intervall wird nicht in den berechneten Gerinnungszeiten USt. (siehe unten).
9. Mit einer Mehrkanal-Pipette Calciumchlorid (50 ul von 25 mM in destilliertem Wasser; 6,25 Endkonzentration) für alle Proben Mikrotitervertiefungen und sofort prESS 'Start' Symbol in der Mikroplatten Anwendung in SoftMax Pro vom Computer auf den Test zu beginnen.
10. Am Ende des Versuchs, die Zeit bestimmen, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß der Gerinnselbildung für 40-fach verdünnten Probe Plasmen NHP und aus der Absorption gegen die Zeit-Profile in SoftMax Pro.
11. Unter Berücksichtigung des 40-fachen Verdünnung, verwenden Sie die Gerinnungszeit für jede Probe, um den FV Aktivität in Units / ml aus der FV 1-stufig Aktivität Standardkurve von Log Clot Zeit vs Log FV Activity (2A) zu berechnen. Dies stellt die FV-1 Bühne Aktivität oder dass ohne "absichtlich" Aktivierung durch Thrombin.
12. Da FV ist mit dem aktiven Thrombin aktiviert Cofaktor ist FVa ^1, eine zweite Assay nach Zugabe und Inkubation mit Thrombin kritischen die genaue Messung der FV 2-stufigen Aktivität einer Plasmaprobe (Mit "absichtlich" Aktivierung durch Thrombin hinzugefügt).
13. Für den FV 2-stufigen Test vorzubereiten 200-300 ul gereinigtes Thrombin ¹⁸ at 100nM in HBS, pH 7,4 und auf Eis inkubieren. Planen Sie 10 ul verdünnte Thrombin für jede Plasmaprobe verwenden, um mit dem FV 2-stufig Assay getestet werden.
14. 120 ul verdünnte der obigen NHP und Probe Plasmen von 40-fach bis 100-fach mit 170 ul HBS, pH 7,4 mit 2,8 Calciumchlorid. Fügen Sie 10 ul Thrombin (10 nM Endkonzentration) zu jeder Probe. Vortex gut mischen und bei 37 ° C inkubieren für 1 min.
15. Verdünnen NHP und Probe Plasmen 500-fach durch Zugabe von 400 ul HBS, pH 7,4, Vortex gut, und Assay 50 ul jeder Plasmaprobe in der FV 1-stufig Mikroplattenassay wie oben beschrieben.
16. Bestimmen Sie die Gerinnungszeit für NHP und jeder Plasmaprobe aus der Extinktion gegen die Zeit-Profile in SoftMax Pro getestet. Unter Berücksichtigung der 500-fachen Verdünnung, verwenden Sie die Gerinnungszeit für jede Probe, um den FV 2-stufig Aktivität aus dem FV berechnen 1-stufig Standardkurve von Log Clot Zeit vs Log FV-Aktivität (Abbildung 2A).
17. Die gesamte FV AktivitätenFV 1-stufig Aktivität - ty kann dann als FV 2-stufig Aktivität berechnet werden.

Results

Repräsentative Ergebnisse - Vorbereitung der FV 1-stufig Mikroplatten Koagulationsanalyse Aktivität Standardkurven

Ein repräsentatives Beispiel eines Fibringerinnsels Formation in der FV-Assay im Zeitablauf mit dem Mikroplattenleser gefertigt ist in Abbildung 1 veranschaulicht. Die FV-Assay misst genau die Zeit, anfängliche Rate und Ausmaß von Fibrin Gerinnselbildung. Inspektion der Brunnen auf Assay Abschluss bestätigt, dass die Bildung von Blutgerinnseln aufgetreten. Alle Reaktionen erreicht etwa den gleichen Umfang der Gerinnselbildung mit einer allgemeinen Extinktionsänderung bei 405 nm von 0,35 bis 0,45 Einheiten zwischen dem Anfangspunkt Extinktion vor und nach der maximalen Absorption Thromboplastin und Calciumchlorid hinaus. Repräsentative Beispiele von FV 1-stufig Aktivität Standardkurven von Log Clot Zeit (in Sekunden) vs Log FV Aktivität (Einheiten / ml) und Log Initial Rate der Gerinnselbildung (in mEinheiten / min) vs Log FV Aktivität (Einheiten / ml ) für serielle Verdünnungen von NHP in gezeigt, und 2B sind. Montage des Log-Log Grundstück von Clot Zeit vs FV 1-Aktivität zeigte eine starke Beziehung zwischen diesen Variablen nach der linearen Regressionsanalyse (2A, R ² = 0,980). Montage des Log-Log Plot des Initial Rate der Gerinnselbildung vs FV Aktivität zeigte auch eine starke Beziehung zwischen diesen Variablen nach der linearen Regressionsanalyse (2B; R ² = 0,983). Die Beziehung der beiden Log Clot Zeit und Log Initial Rate der Gerinnselbildung vs Log FV Aktivität blieb linear für NHP bis zu 512-fach verdünnt. Da FV zirkuliert in NHP bei ca. 40 nM ^12-16, ist die Mikroplattenassay empfindlich auf ca. 24-80pM FV in NHP. Da die Dissoziationskonstante der Wechselwirkung FVa-FXa-Lipid in Prothrombinase etwa 1 nM ¹⁷ ist, ist der FV Mikroplattenassay durchaus geeignet zur Messung von FV Ebenen im physiologisch relevant nM Bereich für FVa Funktion in Prothrombinase.

Mit dem FV Mikroplattenassay wurde auch festgestellt, dass im normalen Bereich der FV-Aktivität in der FV 1-stufig Aktivitätstest von 15 gesunden Kontrollpersonen Plasmen (männlich und weiblich, Alter 18-20yrs) (Mittelwert ± Standardabweichung; Range) war: 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Dies stimmt gut mit der normalen, gesunden FV-Aktivität und Reichweite (0.66-1.14U/ml) von Cutler et al. für den FV 1-stufig Aktivität mit einem automatischen Analysator ⁷ bestimmt. Die Intra-Assay-Variabilität der Zeit, den Umfang und die anfängliche Rate der Bildung von Blutgerinnseln in der FV 1-stufig Assay in 6 Bohrungen auf 8 verschiedenen Tagen betrug 3,4%, 4,4% und 3,1% betragen. Die Inter-Assay-Variabilität der Zeit, den Umfang und die anfängliche Rate der Bildung von Blutgerinnseln in der FV 1-stufig Assay in 6 Vertiefungen 8 verschiedene Experimente an 8 verschiedenen Tagen betrug 7,1%, 7,8% und 9,2% betragen. Somit ist die Intra-und Inter-Assay-Variabilität dieser drei Messred Variablen war auf einem niedrigen und akzeptablen Niveau für robuste Testleistung innerhalb und zwischen Mikroplattenassay von mehreren Proben gleichzeitig (bis zu 12).

Repräsentative Ergebnisse - Assaying menschlichem Blutplasma-Proben mit dem FV 1-stufig und 2-stufiger Mikroplatten Koagulationsanalyse

Die Standardkurve von Log Clot Zeit vs Log FV Activity (2A) wurde verwendet, um die FV-Aktivität in NHP und 9 DIC Patientenplasmen, die nicht absichtlich mit zusätzlichen Thrombin (FV 1-stufig Aktivität) wurden aktiviert oder wurden absichtlich mit aktiviertem messen Thrombin zugegeben (FV 2-Stufen-Aktivität) und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Alle 9 DIC Patientenplasmen zeigten FV 1-stufig Aktivitäten und Anfangsgeschwindigkeiten der Gerinnselbildung, die durchschnittlich verringert wurden, um 54% bzw. 18%, bzw. von NHP. Die Ausmaße der Gerinnselbildung in der FV 1-stufig Assay in den DIC Patienten waren nicht groß anders NHP und erhöhte im Durchschnitt um 13% von NHP.

Aktivierung des NHP mit Thrombin erzeugt eine ungefähre 8-fachen Anstieg der FV 2-Stufen-Aktivität über dem FV 1-Stufen-Aktivität (Tabelle 1). Dies deutet darauf hin, dass der FV in NHP hauptsächlich in ihrer aktivierten Form war und stimmt mit den zuvor berichteten Ergebnisse mit manuellen Kipp-tube FV Assays ^{3, 4} und automatisierte FV Assays ^5-7. Der FV 2-stufig und Gesamtaktivität wurden auch in den DIC-Patienten im Durchschnitt gesunken, von 44% und 42%, bzw. von NHP. Die ersten Preise und Ausmaß der Gerinnselbildung in der FV 2-stufig Assay in den DIC Patienten waren nicht signifikant verschieden von NHP und variiert im Durchschnitt um ca. 9% und 4%, bzw. von dem mit NHP beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, daß mit dem FV in NHP, der FV in den DIC Patientenplasmen Vergleich in Folge einer verlängerten Zeit und verringerte Rate von Fibrin Gerinnselbildung und dass der Patient FV war durchschnittlich nur 56% als aktivierbare mit Thrombin als auch.

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Abbildung 1. Gerinnselbildung im normalen gepoolten menschlichen Referenz-Plasma mit der kinetischen Mikrotiterplatten FV 1-stufig Koagulationsanalyse gemessen. Fibringerinnselbildung in NHP wurde kontinuierlich bei 405 nm mit Hilfe eines kinetischen Mikroplatten-Reader überwacht. Die Handlung ist die Mikroplattenleser Ausgang eines 6 min Reaktion von 32-fach verdünnten NHP, FV-Mangelplasma, Thromboplastin und Calciumchlorid in einer Mikrotiterplatte. Die vertikale Achse stellt die Änderung der Absorption bei 405 nm, die als Ergebnis der Fibrinbildung im Plasma aufgetreten ist. Der Zeitpunkt der Fibrinbildung wurde als die Zeit, um die Hälfte der maximalen Erhöhung in der Absorption oder den Mittelpunkt einer Kurve (36,40 sec) erreicht definiert. Die anfängliche Geschwindigkeit der Gerinnselbildung wurde als die Rate der Änderung der Absorption bei 405 nm über die ersten 5 Zeitpunkte des linearen Anstiegs der Absorption Abschnitt der Kurve (611,88 mEinheiten / min) definiert. Der ExZelt der Gerinnselbildung wurde als die Differenz zwischen dem maximalen und minimalen Absorption bei 405 nm (0,35 Einheiten) definiert.

Abbildung 2. Standardkurven von Zeit und anfänglichen Rate von Gerinnselbildung vs Faktor V-Aktivität im normalen gepoolten menschlichen Referenzplasmas mit dem FV 1-stufig Mikroplattenassay. NHP wurde seriell verdünnt (0 - bis 512-fache in HBS) und einem Assay mit dem FV 1-stufig Mikroplattenassay wie im Protokoll beschrieben. Log-Log Plots der Zeit und Anfangsgeschwindigkeit der Gerinnselbildung vs FV Aktivität im FV 1-stufig Mikroplattenassay Nach linearer Regressionsanalyse der Daten in Felder A und B, gezeigt.

Probe	1-stufig Assay Aktivität (Einheiten / ml)	1-stufig Assay Umfang (Units)	1-stufig Assay Initial Rate (mEinheiten / min)	2-stufige Assay Aktivität (Einheiten / ml)	2-stufige Assay Umfang (Units)	2-stufige Assay Initial Rate (mEinheiten / min)	Insgesamt Aktivität (Einheiten / ml)
NHP	1,02	0,363	744,96	7,93	0,433	375,84	6,91
Patient 1	0,36	0,404	583,80	3,84	0,432	249,96	3,48
Patient 2	0,67	0,416	704,04	5,28	0,469	323,16	4,61
	0,31	0,435	562,08	3,92	0,453	294,96	3,61
Patient 4	0,39	0,435	617,04	4,14	0,462	372,60	3,75
Patient 5	0,73	0,401	641,40	5,91	0,433	354,24	5,18
Patient 6	0,45	0,403	600,72	4,16	0,445	393,96	3,71
Patient 7	0,49	0,395	575,40	4,89	0,449	357,48	4,40
Patienten 8	0,19	0,448	489,00	2,89	0,450	330,48	2,70
Patienten 9	0,64	0,423	699,48	5,11	0,455	417,24	4,47

Tabelle 1 FV Activity in NHP und in 9 Patienten, die disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) entwickelt. Die FV 1-stufig, 2-stufig, und Gesamtaktivität in NHP und 9 DIC Patientenplasmen wurden aus dem FV 1-stufig Mikroplattenassay Standard bestimmt Kurve der Zeit der Gerinnungsbildung vs FV Aktivität (2A) und sind in Einheiten / ml angegeben. Die ersten Preise (Initial Zuwachsrate in A405nm über die ersten fünf Zeitpunkten in mEinheiten / min) und Extents (Maximum A405nm - Minimum A405nm) der Gerinnselbildung in der FV 1 - und 2-stufiger Mikroplattenassay sind ebenfalls gezeigt.

Discussion

Die kinetische Mikroplatte Assayverfahren skizziert die Entwicklung eines neuartigen, schnelle, kostengünstige und praktische Technik zur Messung von FV Gerinnungsaktivität in Proben von humanem Plasma, das kein (FV 1-Stufen-Test) oder wurden absichtlich mit zugesetzten Thrombin (FV aktiviert 2-Stufen-Test). Der Assay beruht auf einer kinetischen Mikroplattenleser und alle Materialien und Reagenzien erforderlich sind kommerziell erhältlich oder können in-house erfolgen. Der Assay überwacht ständig die Änderung in der Lichtstreuung von Plasma während Fibringerinnsels Formation bei 405nm. Die Mikroplattenassay hat den Vorteil, mit kleinen Plasma Probenvolumina (ul) und ist zugänglich für die Analyse von mehreren Proben gleichzeitig (bis zu 12). Diese Attribute sind Assay vorteilhaft, wenn teure Geräte und Reagenzien verwendet werden (automatische Analysegeräte und Faktor-defizienten Plasmen), nur kleinen Probenvolumina zur Verfügung (Patientenplasmen) oder Analysieren einer großen Anzahl von Proben (Während FV Aufreinigung from Plasma).

Die FV Mikroplattenassay hat die zusätzlichen Vorteile, dass es bequem, schnell ist, und erfordert nicht die Isolierung und Reinigung der benötigten Bestandteile. Verglichen mit manueller Dreh-Rohr ^{3, 4} und automatisierte ^5-7 FV-Assays, die gemeldet wurden, hat der FV Mikroplattenassay vergleichbaren Reihe von nützlichen Gerinnungszeiten (25-75 sec) und der entsprechenden FV Ebenen in der Probe (0,5 bis 0,005 Einheiten / ml), und die Empfindlichkeit / Nachweisgrenzen (20-80pM). Im Vergleich zum manuellen Kipp-Rohr FV Assays, die aus einer subjektiven visuellen Beurteilung der Gerinnselbildung ^{3, 4} leiden erlaubt der FV Mikroplattenassay objektive und quantitative Messung der Gerinnungszeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß von Fibrin Gerinnselbildung. Verglichen mit automatisierten FV Assays, die von der Pflicht zur teure Analysegeräte und Reagenzien ^7.5 leiden, sind die FV Mikroplattenassay Reagenzien und Materialien kostengünstig und alle benötigten Materialien können purcha seinsed kommerziell oder aus in-house. Manuelle Kipp-Rohr ^{3, 4} und ^5-7 automatisierten Assays FV Allgemeinen nur den Zeit bis zur Gerinnselbildung; nicht die Zeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß von Fibrin Gerinnselbildung, die alle genau spektrophotometrisch mit der Mikroplatte FV-Assay gemessen. Schließlich leiden manuellen Tilt-Rohrs ^3,4 und automatisierte ^5-7 FV Assays ab nur in der Lage, das FV-Aktivität in Plasmaproben ein zu einer Zeit zu messen, während die FV Mikroplattenassay zugänglich ist, um mit hohem Durchsatz und 12 Proben können Assay gleichzeitig.

Die Mikrotiterplatte wurde verwendet, um zu demonstrieren, dass die in 9 FV DIC Patientenplasmen weniger aktiv als in NHP aufgrund einer Kombination von verzögerten Gerinnungszeiten und unteren Anfangsgeschwindigkeiten der Gerinnselbildung in der FV 1-Stufen-Test war. Die ersten Preise der Gerinnselbildung in der FV 2-stufig Assay in den DIC Patientenplasmen wurden nicht von NHP geändert. Die Ausmaße der Gerinnselbildung in der DIC patient Plasmen wurden auch nicht von NHP in der FV 1-stufig und 2-stufiger Assays geändert. Verminderte FV 1-stufig, 2-stufig, und insgesamt Aktivitäten können schon aufgrund der erhöhten FV Verbrauch ¹⁹ und / oder Inaktivierung ⁶ in Übereinstimmung mit anderen Studien, die während der Pathogenese dieser erworbenen Erkrankung des Blutes haben. Angesichts des Umfangs der Gerinnselbildung in den Plasmen DIC war das gleiche wie mit NHP beobachtet, war diese Variable wahrscheinlich eine Folge der Konzentration an Fibrinogen in der FV-Mangelplasma und nicht auf die Eigenschaften der Patientenplasmen verwandt.

Die Ergebnisse aus der Mikroplatten-Assay zeigte, dass die Messung von FV-Aktivität in Proben von humanem Plasma kann aus der Zeit und Anfangsgeschwindigkeit der Gerinnselbildung vom FV 1-Stufen-Test und dem Zeitpunkt der Gerinnselbildung und Gesamtaktivität von der FV 2 erhalten werden - Bühne Assay. Es war nicht möglich, quantitative Messung der FV-Aktivität in einer Plasmaprobe erhalten bezogen auf das Ausmaß der Bildung von Blutgerinnseln in tEr FV 1 - und 2-stufiger Assays oder die anfängliche Geschwindigkeit der Gerinnselbildung in der FV 2-stufig Assay. Angesichts alle Reaktionen erreicht etwa den gleichen Umfang der Gerinnselbildung von 0,35 bis 0,45 Einheiten zwischen den Anfangs-Absorption vor und nach der maximalen Absorption Thromboplastin und Calciumchlorid hinaus bedeutet die Messung des Ausmaßes der Gerinnselbildung keine quantitative Beurteilung der FV-Aktivität in einem gegeben Plasmaprobe.

Das neuartige Mikroplattenassay finden Einsatz in Forschung und klinischen Einrichtungen zur Messung von FV-Aktivität in Proben von humanem Plasma und Fraktionen während dessen Reinigung aus menschlichen und tierischen Plasmas. Die Mikroplatte Assay verwendet werden, um die Zeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß der Gerinnselbildung zu messen; Parametern allgemeinen nicht gleichzeitig im manuellen Plane-Rohr Assays und automatisierte Gerinnungsmeßgeräte überwacht. Mit diesen Informationen kann eine vollständige quantitative Bewertung der Beteiligung der FV während der Gerinnselbildung Eventin humanem Plasma als bisher ^3-7 berichtet. Diese Information ist besonders wichtig in Forschung und klinische Labors beim Messen signifikanten Veränderungen FV-Aktivität in Proben von Plasma oder mit gereinigten FV oder FVa. Die FV Mikroplatte Assay kann auch verwendet werden, zu charakterisieren und zu messen, die Verbindungen zu aktivieren oder zu inaktivieren, FV und FVa können, messen die FV Aktivität bei Patienten mit einem Risiko für venöse Thrombose als Folge des FV-Leiden-Mutation ^{20, 21} und um die Aktivität zu überwachen FV während seiner Reinigung aus Plasma.

Die FV Mikroplattenassay leicht anpassbar ist, um die Aktivität von jedem Gerinnungsfaktor im extrinsischen, intrinsische oder gemeinsamen Pfad zu messen unter Verwendung der entsprechenden Faktor-Mangelplasma und Initiieren Reagenzien zur Fibrinbildung. Der Test wird unser Verständnis der FV Biochemie durch eine genauere und vollständigere Messung seiner Tätigkeit in Forschung und klinische Labors zu erhöhen. Letztely, werden diese Informationen positiv beeinflussen Umgebungen im Gesundheitswesen durch eine frühere Diagnose und Entwicklung von wirksameren Therapien für Menschen mit Gerinnungsstörungen, wie DIC heimgesucht.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Namen Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (Optional)
Kinetic Mikroplatten-Reader	Molecular Devices	Spectra Max 190	Softmax PRO 4,3 LS Software
Normale gepoolten menschlichen Referenzplasmas	Precision Biologicals	CCN-10
Trinatriumcitrat	Becton Dickenson	B10242
EDTA	Becton Dickenson	B10093
FV-defizienten Humanplasma 4			Aus frischem Humanplasma und in Aliquots bei -70 ° C
3 und 60ml Spritzen	Becton Dickenson	309585 und 136898
Schmetterling Gerät	Vacutainer	367251	20 Gauge
HEPES	Sigma / Aldrich	H-3375
NaCl	Fischer	BP358-212
Thromboplastin	Trinity Biotech	T1106	Dialysierte vs HBS, pH 7,4 und in Aliquots bei -70 ° C
Calciumchlorid	Becton Dickenson	B10070
Humanes Thrombin 15			Aus Humanplasma; bei -20 ° C in 50% (v / v) Glycerol gelagert.
Dialysemembran	Fischer	21-152-6	6-8kDa Molekulargewichtsschnitt; 50mm x 3m.
Schablonenhalterung und abnehmbare 8 Vertiefungen.	Nunc	14-245-63 und 469957
ELISA Waschen Trays	BioRad	224-4872
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und 15 ml mit Schraubverschluss Röhrchen.	Sarstedt	72690 und 62554205
Mehrkanalpipette	Fischer	2703630	8-Kanal-Modell.