Olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN) zu konvertieren Geruchs-Signale zunächst in einem Rezeptor Strom, wiederum löst Aktionspotentiale, die bis zur zweiten Ordnung Neuronen im Riechkolben gefördert werden. Hier beschreiben wir die Saugpipette Technik gleichzeitig aufzeichnen Duftstoff-induzierte Rezeptor-Strom-und Aktionspotentiale aus Maus ORN.
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Methodenartikel
Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tiere probieren Sie die Geruchsstoffe Umwelt um sie herum durch die chemosensorischen Systemen in der Nasenhöhle befindet. Chemosensorische Signale beeinflussen komplexe Verhaltensweisen wie die Wahl der Lebensmittel, Raubtier, Artgenossen und Mate Anerkennung und anderen gesellschaftlich relevanten Hinweisen. Olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN) im dorsalen Teil der Nasenhöhle im olfaktorischen Epithel eingebettet. Diese bipolare Nervenzellen senden Sie eine Axon zum Riechkolben (siehe Abb. 1, Reisert & Zhao 1, ursprünglich im Journal of General Physiology veröffentlicht) und Erweiterung eines einzigen Dendriten der epithelialen Grenze, von wo aus Zilien strahlt in den Schleim, der die olfaktorische deckt Epithel. Die Flimmerhärchen enthalten die Signaltransduktion Maschinen, die letztlich zu aktuellen Einstrom durch den ciliary Transduktion Kanälen, zyklisch Nukleotid-gesteuerten (CNG)-Kanal und einem Ca 2 +-aktivierten Cl exzitatorischen - Kanal (Abb. 1). Die anschließende depolarization löst Aktionspotential Generation am Zellkörper 2-4.
In diesem Video beschreiben wir die Verwendung des "Saugpipette Technik", um Duftstoff-induzierten Reaktionen von ORN aufnehmen. Diese Methode wurde ursprünglich entwickelt, um aus Stäbchen-Photorezeptoren 5 aufnehmen und eine Variante dieser Methode können jove.com modifiziert, um von der Maus Zapfen-Photorezeptoren 6 aufzeichnen gefunden werden. Die Saugpipette Technik wurde später auch angepasst ist, um aus 7,8 ORN aufzuzeichnen. Kurz nach der Dissoziation des olfaktorischen Epithel und Zellisolation wird die gesamte Zelle Körper eines ORN in die Spitze einer Pipette angesaugt Aufzeichnung. Die Dendriten und die Zilien frei bleiben der Badlösung und somit zugänglich Lösung Änderungen an zB Geruchsstoff oder pharmakologische Blocker-Anwendung zu ermöglichen. In dieser Konfiguration wird kein Zugriff auf die intrazelluläre Umgebung gewonnen (kein Ganzzell-Spannungsklammer) und die intrazelluläre Spannung bleibt frei zu variieren. Dies allesverdankt die gleichzeitige Aufnahme der langsamen Rezeptor-Strom, der an der Zilien und schnelles Handeln Potenziale durch den Zellkörper 9 abgefeuert stammt. Der Unterschied in der Kinetik zwischen diesen beiden Signalen ermöglicht ihnen getrennt mit verschiedenen Filtereinstellungen werden. Diese Technik kann auf jedem Wildtyp oder Knockout-Maus verwendet werden oder selektiv aufzuzeichnen aus ORN, die GFP exprimieren auch an spezifische Teilmengen von ORN kennzeichnen, z. B. die Expression eines bestimmten Rezeptors oder Geruchsstoff Ionenkanal.
Protokoll
Ein. Die Recording Setup
Aufzeichnungsverfahren Kammer auf einem Nikon Eclipse-TE2000U Inversmikroskop mit Phasenkontrast Optik, die auf einer Luft Tisch ausgestattet ist und elektrisch abgeschirmten Verwendung einer Faraday-Käfig angebracht. Die Plexiglas Aufnahme Kammer besteht aus zwei Abschnitten teilweise durch eine Barriere getrennt und klebte auf einem silanisierten Glasobjektträger. Ein Abschnitt der Kammer verwendet wird, um die Zellen absetzen, während der andere für Stimulus-Exposition während der Aufzeichnung verwendet werden, um ein vorzeitiges ständiger Belichtung, aber noch nicht verwendeten Zellen Odorans zu minimieren. Die ....
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Diskussion
Die Saugpipette Technik ist eine elektrophysiologische Methode, die verwendet werden, um den Geruch-induzierten langsamen Rezeptorstrom und die schnelle biphasische Aktionspotentiale aus einem ORN gleichzeitig aufzuzeichnen. Da der Plasmamembran der Zelle nicht verletzt wird, verlässt dieses Verfahren den intrazellulären Milieu ungestörten sicherzustellen, dass die Antworten nicht Odorans verändert aufgrund von Änderungen der cytoplasmatischen Ionenkonzentrationen oder Verdünnung von intrazellulären Faktoren. Zellen .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom NIH DC009613, dem Human Frontier Science Program und Morley Pflege Fellowship (JR) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Bezeichnung des Stoffes | Typ | Firma | Katalog / Modellnummer | Kommentare |
| Lufttisch | Ausrüstung | Newport | ||
| Luftpumpe | Ausrüstung | Newport | ACGP | |
| Pipette Puller | Ausrüstung | Sutter | P-97 | |
| Borosilikatglas | Ausrüstung | WPI | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverses Mikroskop | Ausrüstung | Nikon | TE2000U | Ausgestattet mit Hg-Lampe, GFP-Filter und Ziele 20X und 5X mindestens |
| Amplifier PC-501A | Ausrüstung | Warner | 64-0008 | Headstage 1 G |
| Diamantmesser | Ausrüstung | Maßgeschneidert | ||
| Digitizer Mikro1401 A / D | Ausrüstung | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter-Einheit 3382 | Ausrüstung | Krohn Hite Corporation | ||
| Signal | Software | Cambridge Electronic Design | ||
| Geformt Ag / AgCl Pellet | Ausrüstung | WPI | 64-1297 | |
| Pipettenhalter | Ausrüstung | Warner | 64-0997 | Benutzerdefinierte modifiziert, um fit Headstage |
| Aufnahme Kammer | Ausrüstung | Maßgeschneidert | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | Ausrüstung | Sutter Instrument | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineralöl | Lösung | Sigma | 330.779-1L | |
| Oszilloskop TDS 1001 | Ausrüstung | Tektronix | ||
| Drei Läufen Platz Glasrohr | Ausrüstung | Warner | 64-0119 | 0,6 mm Innendurchmesser, 5 cm lange |
| Ventil | Ausrüstung | Die Lee Company | ||
| ValveLink 8,2 | Ausrüstung | Automatisieren Scientific | ||
| SF-77B Perfusion schnellen Schritt | Ausrüstung | Warner |
Referenzen
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B.
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Nachdrucke und Genehmigungen
