Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)

Summary

Dies ist eine schnelle und umfassende Methode der Immunphänotypisierung Myeloide Suppressorzellen (MDSC) und bereichernde Gr-1 ⁺ Leukozyten aus Maus-Milz. Diese Methode verwendet Durchflusszytometrie und autoMACS Zellsortier für tragfähige Gr-1 bereichern ⁺ Leukozyten vor der FACS-Sortierung MDSC zur Verwendung In-vivo- Und In-vitro- Assays.

Abstract

MDSC sind eine heterogene Population von unreifen Makrophagen, dendritischen Zellen und Granulozyten, die in lymphatischen Organen bei pathologischen Zuständen einschließlich parasitäre Infektionen, Entzündungen, traumatischen Stress, Graft-versus-host-Krankheit, Diabetes und Krebs ^7.1 ansammeln. Bei Mäusen, MDSC ausdrückliche Mac-1 (CD11b) und Gr-1 (Ly6G und Ly6C) Oberflächenantigene ^7. Es ist wichtig zu beachten, dass MDSC auch in verschiedenen Tumor-tragenden Hosts, wo sie deutlich erweitert werden untersucht und zu unterdrücken Anti-Tumor-Immunantwort gegenüber naiven Kollegen ^7-10. In Abhängigkeit von den pathologischen Zustand, gibt es verschiedene Subpopulationen von MDSC mit unterschiedlichen Mechanismen und Ziele der Unterdrückung ^11,12. Daher sind wirksame Mittel zur lebensfähigen MDSC Populationen zu isolieren, die Aufklärung ihrer verschiedenen molekularen Mechanismen der Unterdrückung in vitro und in vivo.

Vor kurzem hat die Ghansah Gruppe hat den Ausbau MDSC in einem murinen Pankreaskarzinom-Modell berichtet. Unsere tumortragenden MDSC zeigen ein Verlust der Homöostase und erhöht suppressive Funktion im Vergleich zu naiven MDSC ^13. MDSC Prozentangaben sind deutlich weniger in lymphoiden Kompartimente von naiven vs Tumor-tragenden Mäusen. Dies ist eine große Einschränkung, die oft behindert genaue vergleichende Untersuchungen dieser MDSC. Deshalb bereichern Gr-1 ⁺ Leukozyten aus naiven Mäusen vor Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) erhöht Reinheit, Viabilität und reduziert Art Zeit. Allerdings ist die Anreicherung von Gr-1 ⁺ Leukozyten aus tumortragenden Mäusen optional, da diese in Hülle und Fülle für die schnelle FACS-Sortierung sind. Daher wird in diesem Protokoll beschreiben wir eine hocheffiziente Methode der Immunphänotypisierung MDSC und bereichernde Gr-1 ⁺ Leukozyten aus Milzen von naiven Mäusen für die Sortierung MDSC in einer fristgerechten Weise. Immunkompetenten C57BL / 6 Mäusen mit murinem Panc02 ce inokuliertlls subkutan während naive Mäuse erhalten 1XPBS. Etwa 30 Tage nach der Inokulation, Milzen entnommen und in den Single-Zellsuspensionen mit einem Zellabtrennungssiebes verarbeitet. Milzzellen werden dann Rote Blutkörperchen (RBC) lysiert und ein Aliquot dieser Leukozyten angefärbt mit Fluorochrom-konjugierten Antikörper gegen Mac-1 und Gr-1 zu Immunphänotyp MDSC Prozentsätze mittels Durchflusszytometrie. In einem parallelen Experiment, werden ganze Leukozyten aus naiven Mäusen mit fluoreszierenden konjugierten Gr-1-Antikörper, mit PE-Microbeads inkubiert und positiv selektiert mit Hilfe eines automatisierten Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator gefärbt. Als nächstes wird ein Aliquot der Gr-1 ⁺ Leukozyten mit Mac-1-Antikörper gefärbt, um die Erhöhung der MDSC Prozentwert mit Durchflusszytometrie zu identifizieren. Nun sind diese Gr1 ⁺ angereicherten Leukozyten bereit für FACS-Sortierung von MDSC in vergleichenden Analysen verwendet werden (naiv vs tumortragenden) in in vivo und in vitro

Protocol

Vor dem Start, bereiten Sie die folgenden Lösungen:

3% Färbung Media (SM):

-3% Fötalem Rinderserum (FBS) in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)

MACS-Puffer (MB):

- 0,5% Albumin aus Rinderserum (BSA) in 1XPBS

1. Ernte Milz von Mäusen

1. Subkutan injizieren 6-8 Wochen im Alter von C57BL / 6 Mäuse (Harlan) mit 1,5 x 10 ⁵ Panc02 murinen Zellen in 100 ul 1x PBS suspendiert (tumortragenden; TB). Kontrollmäusen (Naive) erhalten 100 ul 1XPBS.
2. Etwa 4 Wochen nach der ....

Discussion

Dies ist eine detaillierte Verfahren zum Verarbeiten und immunophentyping MDSC Populationen, die für verschiedenen lymphoiden Geweben von verschiedenen Tiermodellen ist. Insbesondere kann autoMACS Anreicherung für die Isolierung von verschiedenen Leukozytenpopulationen einschließlich Gr-1 Depletion von Splenozyten ^4, Reinigung von myeloiden Teilmengen aus Milzzellen und Lymphknoten ^5, Isolierung von Knochenmark Neutrophilen ¹⁴ und Reinigung von CD8 ⁺ T-Zellen aus der Milz verw.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENZ	UNTERNEHMEN	Katalog #	KOMMENTARE
1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung	Thermo Scientific Hyclone	SH30028.02	Ca 2 + / Mg 2 + / Phenolrot-freiem
Albumin aus Rinderserum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Lassen Sie ungestört auflösen BSA in PBS; sterilen Umgebung
Fötales Rinderserum (FBS)	Thermo Scientific Hyclone	SV3001403HI	Hitze inaktiviert; sterilen Umgebung
Ratte anti-Maus-CD16/32 monoklonalen Antikörper (Fc-Block)	BD Biosciences	553142	Sterilen Umgebung
Anti-Maus-CD11b (Mac-1) FITC	eBiosciences	11-0112	SterilUmwelt
Anti-Maus Ly6G (Gr-1) APC	eBiosciences	17-5931	Sterilen Umgebung
Anti-Maus Ly6G (Gr-1) PE	eBiosciences	12-5931	Sterilen Umgebung
DAPI	Invitrogen	D1306	Verdünnungsreihe sterilen Umgebung
Zellabtrennungssiebes	Sigma-Aldrich	CD1-1KT	Autoklav vor der Verwendung
Um 70-Sieb	BD Biosciences	352350	Sterilen Umgebung
1X RBC Lysis Buffer	eBiosciences	00-4333-57	Warm auf Raumtemperatur vor Gebrauch; sterilen Umgebung
Petrischalen	Fisher Scientific	08-757-12	Sterilen Umgebung
50ml coniCal-Rohre	Thermo Scientific	339652	Sterilen Umgebung
5ml 12X75mm Polystyrol Röhrchen mit rundem Boden	BD Biosciences	352054	Bekannt als FACS-Röhrchen, sterile Umgebung
96-Well-Platten mit V-Boden	Corning	3897	Sterilen Umgebung
Trypanblau	Cellgro	25-900-CI	Sterilen Umgebung
PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801	Sterilen Umgebung
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
AutoMACS Spalten	Miltenyi Biotec	130-021-101
AutoMACS Laufpuffer	Miltenyi Biotec	130-091-221