Methodenartikel

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

DOI:

10.3791/3906

⸱

13. Juni 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Hematology, University of Antwerp, 2Bio Imaging Lab, University of Antwerp

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Abfolge der Ereignisse für multimodale Bildgebung von zellulären Transplantaten im Gehirn von Nagetieren mit: (i) In-vivo-Biolumineszenz-und Kernspintomographie, und (ii) post mortem histologische Analyse. Die Kombination dieser bildgebenden Verfahren auf einem einzigen Tier erlaubt zelluläre Transplantat Auswertung mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Spezifität.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Während der letzten zehn Jahre hat Stammzelltransplantation zunehmendes Interesse als primäre oder sekundäre therapeutische Modalität für eine Vielzahl von Krankheiten, sowohl in vorklinischen und klinischen Studien gewonnen wurden. Bis heute wurde jedoch Ergebnisse in Bezug auf funktionelle Ergebnis und / oder Geweberegeneration folgenden Stammzelltransplantation sind sehr unterschiedlich. Im Allgemeinen wird eine klinische Nutzen ohne tiefes Verständnis der zugrunde liegende Mechanismus (n) 1 beobachtet. Deshalb haben mehrere Bemühungen um die Entwicklung der verschiedenen molekularen Bildgebungsverfahren führte zur Stammzell-Transplantation mit dem Ziel, richtig einschätzen zu Überleben, Schicksal und Physiologie der aufgepfropft Stammzellen und / oder deren Mikro-Umgebung zu überwachen. Änderungen in der einen oder mehrere Parameter bestimmt durch molekulare Bildgebung beobachtet könnte zu der beobachteten klinischen Effekt stehen. In diesem Zusammenhang unsere Studien über den kombinierten Einsatz von Biolumineszenz-Imaging (BLI), Kernspintomographie (MRT) und histologische analysi konzentrierens zu bewerten Stammzell-Transplantation.

BLI wird allgemein nicht-invasiv durchgeführt Zellverfolgung und überwachen das Überleben der Zelle in der Zeit nach der Transplantation 2-7, basierend auf einer biochemischen Reaktion, bei der Zellen, die das Luciferase-Reportergen verwendet werden können, um Licht nach der Wechselwirkung mit seinem Substrat emittieren (z. B. D- Luciferin) 8, 9. MRI auf der anderen Seite ist eine nicht-invasive Technik, die klinisch anwendbare 10 ist und kann verwendet werden, um genau zu lokalisieren zelluläre Transplantate mit sehr hoher Auflösung von 11 bis 15 werden, obwohl seine Empfindlichkeit hängt stark von der Kontrast nach der Markierung von Zellen mit einem MRT-Kontrastmittel erzeugt . Schließlich ist post-mortem histologische Analyse die Methode der Wahl, um Forschungsergebnisse mit nicht-invasiven Techniken mit höchster Auflösung und Empfindlichkeit erhalten zu validieren. Außerdem Endpunkt histologische Analyse ermöglicht es uns, detaillierte phänotypische Analysen von transplantierten Zellen und / oder des umgebenden Gewebes, ba durchführenSED auf die Verwendung von fluoreszierenden Reporter-Proteine ​​und / oder direkte Markierung von Zellen mit spezifischen Antikörpern.

Zusammenfassend haben wir hier visuell demonstrieren die Komplementarität von BLI, MRT und Histologie an verschiedenen Stammzell-und / oder Umwelt-assoziierten Merkmalen nach Stammzell-Transplantation in das ZNS von Mäusen zu entwirren. Als ein Beispiel, Knochenmark-abgeleiteten Stromazellen, gentechnisch verändert, um die verstärkte grün fluoreszierende Protein (EGFP) und Glühwürmchen-Luciferase (Fluc), und markiert mit blau-fluoreszierenden Mikrometergröße Eisenoxidteilchen (MPIOs) exprimieren, wird in der gepfropft werden ZNS von immunkompetenten Mäusen und das Ergebnis wird von BLI, MRT und Histologie (Abbildung 1) überwacht werden.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zellpräparation

  1. Die Experimente sollten initiiert mit ex vivo kultivierten Stammzell-Populationen genetisch manipuliert, um die Luciferase und eGFP Reporter-Proteine ​​zu exprimieren. Wir verwenden hier Luciferase / eGFP-Expression murinen Knochenmark abgeleiteten Stromazellen (BMSC-Luc/eGFP), wie zuvor von Bergwerf et al. 2, 5 beschrieben.
  2. Zwei Tage vor Zellmarkierung, Platte BMSC-Luc/eGFP Zellen bei einer Dichte von 8 x 10 5 Zellen pro T75 Kulturflasche in 15 ml komplett Expansion Medium (CEM) mit 1 ug / ml Puromycin ergänzt.
  3. Willkommen Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Bericht beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Kombination aus drei sich ergänzenden bildgebenden Verfahren (BLI, MRT und Histologie) für eine detaillierte Charakterisierung der zellulären Implantaten im ZNS von immunkompetenten Mäusen. Eine Kombination von Reportergen Markierung von Zellen, auf genetische Modifikation mit der Reportergene Luciferase und eGFP, und eine direkte Markierung von Zellen mit GB MPIO basiert, führt zu einer genauen Beurteilung der Stammzellläppchen in vivo.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, in keinem Interessenkonflikt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren Arbeit wurde durch Forschungsgelder ID-BOF 2006 von der Universität Antwerpen (PPO gewährten und AVDL), durch Forschungsförderung und G.0136.11 G.0130.11 (gewährten AVDL, ZB und PPO) und 1.5.021.09 unterstützt. N.00 (gewährten PPO) des Fonds für wissenschaftliche Forschung-Flandern (FWO-Vlaanderen, Belgien), SBO Forschungsstipendium IWT-60838: BrainStim der Flämischen Institut für Wissenschaft und Technologie (gewährten ZB und AVDL), in Teil von einem Methusalem Forschungsstipendium von der flämischen Regierung (gewährten ZB), zum Teil von EC-FP6-NoE DiMI (LSHB-CT-2005 bis 512146), EG-FP6-NoE Emil (LSHC-CT-2004-503569) , und von der Interamerikanischen Un....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
IMDM Lonza BE12-722F Komponente der Zelle Wachstumsmedium CEM
Fötales Rinderserum Gibco 10270-106 Komponente der Zelle Wachstumsmedium CEM
Pferdeserum Gibco 1605-122 Komponente der Zelle Wachstumsmedium CEM
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Komponente der Zelle Wachstumsmedium CEM
Fungizone Gibco 15290-018 Komponente der Zelle Wachstumsmedium CEM
PBS Gibco 14190
Puromycin Invivogen ant-PR-1
Trypsin Gibco 25300
GB MPIO Bangs Laboratories ME04F/7833
D-Luciferin Promega E1601
Ketamin (Ketalar) Pfizer
Xylazin (Rompun) Bayer Health Care
Isofluran Isoflo 05260-05
0,9% NaCl-Lösung Baxter
Paraformaldehyd Merck 1.04005.1000
Saccharose Applichem A1125
Micro-Einspritzpumpe KD wissenschaftlichen KDS100
Photon-Imager Biospace Lab
9,4 T MR-Scanner Bruker Biospin Biospec 94/20 USR
BX51 Mikroskop Olymp BX51
Mycrom Kryostat HM Prosan HM525
Spritze Hamilton 7635-01
30-Gauge-Nadel Hamilton 7762-03
Photo Vision-Software Biospace Lab
M3vision Software Biospace Lab
Paravision 5.1-Software Bruker Biospin
Amira 4.0-Software Visage Imaging

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. Molecular imaging of stem cells. , (2008).
  2. Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

StammzelltransplantationBiolumineszenz ImagingMagnetresonanztomographiehistologische AnalyseKnochenmarkstromazellenfluoreszierende eisenoxidhaltige Partikel in Mikrometergr eEGFP Luciferase ExpressionImplantation in das Gehirn von M usenstereotaktisches Injektionsverfahrenpostmortale histologische Validierung

Verwandte Artikel