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Summary

Nanoscheiben sind kleine scheibenförmige Partikel, die Membranproteine ​​in einem kleinen Fleckchen Phospholipiddoppelschicht integrieren. Wir stellen eine visuelle Protokoll, das die Schritt-für-Schritt Einarbeitung des MalFGK2 Transporters zu einer Scheibe zeigt.

Abstract

Die nanodisc ist eine scheibenförmige Teilchen (~ 10-12 nm groß), dass trap Membranproteine ​​in einem kleinen Fleckchen Phospholipiddoppelschicht. Die nanodisc ist eine besonders attraktive Option zur Untersuchung Membranproteine, insbesondere im Kontext von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen. Die Methode erstmals von Sligar und Kollegen auf den amphipathischen Eigenschaften eines technisch hoch ein-helikalen Gerüstprotein aus dem Apolipoprotein A1 abgeleitet. Die hydrophoben Flächen des Gerüstprotein interagieren mit den Fettacyl Seitenketten der Lipiddoppelschicht während die polaren Regionen der wässrigen Umgebung zugewandt. Analysen von Membranproteinen in Nanoscheiben deutliche Vorteile gegenüber Liposom weil die Teilchen kleine, homogene und wasserlösliche sind. Zusätzlich können biochemische und biophysikalische Methoden normalerweise löslichen Proteinen vorbehalten angewandt werden, und von beiden Seiten der Membran. In dieser visuellen Protokoll, präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt Rekonstitution eines gut charakterisiertgekenn zeichnet bakteriellen ABC-Transporter, die männlich-MalFGK _2-Komplex. Die Bildung der Platte eine Selbstorganisation, die auf hydrophoben Wechselwirkungen stattfinden während der progressiven Entfernung des Detergens abhängig ist. Wir beschreiben die wesentlichen Schritte und wir die Bedeutung der Wahl eines korrekten Protein-zu-Lipid-Verhältnis, um die Bildung von Aggregaten und größer polydispersen Liposomen-ähnliche Partikel zu begrenzen. Einfache Qualitätskontrollen wie Gelfiltrationschromatographie, native Gelelektrophorese und dynamische Lichtstreuung Spektroskopie sicherzustellen, dass die Scheiben wurden ordnungsgemäß wiederhergestellt.

Protocol

Insgesamt Rekonstitutionsverfahren

Die Rekonstitution Prozess beginnt durch Mischen der Membran Gerüstprotein (MSP) mit dem gereinigten MalFGK _2-Komplex in Gegenwart von Detergens-solubilisierten Phospholipide. Der Schritt wird durch die langsame Entfernen des Detergens durch ein Adsorptionsmittel Polystyrolmaterial genannte Bio-Beads oder Amberlite (Abbildung 1) verfolgt. Selbststartendes Montageprozess tritt am wahrscheinlichsten aufgrund der Wechselwirkungen zwischen den apolaren hydrophoben Phospholipide, die ₂ MalFGK Komplexes und der Oberfläche der MSP amphipathisches Protein. Das Endprodukt ist eine scheibenförmige Teilchen von zwei Molekülen MSP Umschlingung der MalFGK _2-Komplex hergestellt. Die Partikel werden von den Addukten und Aggregate durch Ultrazentrifugation und analytische Größenausschluss-Chromatographie getrennt. Die Partikel werden durch native-Gelelektrophorese und dynamische Lichtstreuung Spektroskopie charakterisiert.

Titel "> 1. Vorbereitung der Membrane Scaffold Protein, MSP

1. Die his-markierte MSP (Version MSP1D1 ¹⁾ wird von dem Plasmid in E. hergestellt pMSP1D1 coli BL21 (DE3) bei OD ₆₀₀ ~ 0,5 mit 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid für 3 h induziert bei 37 ° C.
2. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 10 min bei 4 ° C geerntet und in TSG10 Puffer mit 100 uM Phenylmethansulfonylfluorid.
3. Die Zellen werden mit einem Französisch Presse (3x) bei 8000 psi lysiert und das unlösliche Material wird durch Zentrifugation bei 5000 × g für 10 min entfernt wird bei 4 ° C. Die lösliche Fraktion, die das MSP durch Ultrazentrifugation bei 125.000 × g für 45 min isoliert.
4. Der MSP wird durch Nickel-Chelat-Chromatographie mit ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP in TSG10 Puffer gereinigt. Verunreinigungen werden mit auswärts TSG10 Puffer, der 50 mM Imidazol gewaschen. Die MSP ist mit TSG10 Puffer mit 600 mM eluiertImidazol. Das gereinigte Protein wird in TSG10 Puffer dialysiert und in -70 ° C bei einer Proteinkonzentration von ~ 10-15 mg / ml.

2. Vorbereitung der MalFGK ₂ Complex

1. Die MalFGK _2-Komplex, an dem C-Terminus von MalK his-markierte, wird aus dem Plasmid-pBAD22 FGK exprimiert in E. coli BL21 (DE3) und induziert bei OD ₆₀₀ ~ 0,5 mit 0,2% L-Arabinose für 3 Stunden bei 37 ° C.
2. Nach Zellaufschluß und Zentrifugation wie in Schritt 1.3 wird die Membran Pellet in TSG20 Puffer in einer Endkonzentration von 5 mg / ml resuspendiert. Das Material wird mit 1% w / v n-Dodecyl-β-maltopyranosid (DDM) während 3 Stunden bei 4 ° C unter vorsichtigem Schütteln gelöst.
3. Das unlösliche Material wird durch Ultrazentrifugation nach Stufe 1.3 entfernt und der Überstand, der das solubilisierte MalFGK _2-Komplex wird gesammelt und gereinigt, wie in Schritt 1.4, aber ohne Dialyse.
4. Further Reinigung erfolgt durch Gelfiltrationschromatographie in TSGD Puffer auf einer Superdex 200 HR 10/300 Säule erreicht bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min.

3. Vorbereitung der Phospholipide

1. Ein E. coli insgesamt Lipidextrakt in Chloroform gelöst in 1.000 nmol Aliquots in Schraubverschluss Mikrozentrifugenröhrchen getrennt. Das Lösungsmittel wird unter einem leichten Stickstoffstrom eingedampft und getrocknet weitere Nacht in einem Vakuumexsikkator.
2. Der Lipidfilm wird in TS-Puffer bei 5 nM Endkonzentration gelöst und gevortext kräftig und beschallt. Die gelösten Lipide erscheint leicht opak aufgrund ihrer allgemeinen Unlöslichkeit in wässrigen TS-Puffer, aber sie sollten in der Schwebe bleiben. DDM wird bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (~ 10 mM), bei dem die Lösung klar wird zugegeben.
3. Das Lipidgemisch wird in ein Wasserbad gestellt und Puls beschallt 5 mal für ~ 5 sek. Das Lipidgemisch wird bei 4 ° C für maximal 1 wee gespeichertenk.

4. Vorbereitung der Bio-Beads

1. Etwa 10-15 ml (Volumen im trockenen Zustand) Bio-Beads wird in einem 50 ml Röhrchen gegeben.
2. Die Perlen werden nacheinander mit 50 ml 100% Methanol, 95% Ethanol, milliQ H ₂ O und schließlich TS-Puffer (zweimal) gewaschen.
3. Die gewaschenen Kügelchen werden bei 4 ° C in 10 ml ~ TS-Puffer.

5. Nanodisc Rekonstitution

1. Der MSP in TSGD Puffer bei einer Endkonzentration von ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mM) verdünnt.
2. MSP: Lipid-Verhältnis von 1:3:60 oder 1:3:400 in TSGD Puffer ~ 2 nmol von gereinigtem MalFGK _2-Komplex an ein Protein gemischt. Die Endkonzentration beträgt 6 uM MalFGK _2, 18 und 360 pM MSP uM Lipide (1:3:60) oder 2,4 mM Lipide (1:3:400). Das Endvolumen beträgt 300 ul. Die endgültige Konzentration DDM beträgt 0,08% (~ 1,6 mm). Die Endkonzentration von Glycerin ist abhängig von der Menge an Lipid zugesetzt bleibt aber etwa 5-10% v / v; </li>
3. ~ 50 ul Bio-Bead Suspension wird in das Röhrchen gegeben und die Mischung wird über Nacht auf einem Schüttler Tabelle bei 4 ° C inkubiert
4. Die Perlen werden durch Schwerkraft sedimentiert und die Lösung wird durch eine schmale Spitze pipettiert, so viel Bio-Beads wie möglich zu vermeiden.
5. Große Präzipitate werden durch Ultrazentrifugation bei 100.000 × g für 20 min entfernt. Die Scheiben werden durch Gelfiltrationschromatographie, wie in Schritt 2.4 in TSG10 Puffer gereinigt. Fraktionen, welche die Scheiben werden gepoolt und ein Aliquot sollte auf demselben Gelfiltrationssäule, um die Stabilität der Zubereitung testen erneut injiziert werden.
6. Die gereinigten Scheiben können bei -70 ° C über einen längeren Zeitraum gelagert. Nach dem Auftauen auf Eis, sollten die Scheiben Ultrazentrifugation wie in Schritt 5,5 unterzogen werden, um zu entfernen potenziellen ausfällt. Ein Aliquot sollte durch Gelfiltrationschromatographie analysiert werden, um sicherzustellen, dass eine nennenswerte Aggregation oder Ausfällung nicht während des Auftauens auftretenProzess.

6. Nativer Gelelektrophorese

1. 1 uM Nanoscheiben (~ 0,2 mg / ml) werden durch native PAGE ^{6, 7} (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%), um die Qualität der Rekonstitution (3A) zu beurteilen analysiert.
2. Die Bindung der männlichen (1 uM) zur MalFGK _2-Komplex rekonstituiert in Nanoscheiben wird auch durch native-PAGE (3A) beurteilt.
3. Nach der Elektrophorese wird das Gel mit Coomassieblau für 10 min gefärbt und entfärbt für ~ 1 Stunde.

7. Dynamic Light Scattering (DLS)

1. Nanoscheiben werden durch Gelfiltrationschromatographie, wie in Schritt 2.4 in TSG10 Puffer unter Verwendung einer Superdex 200 HR 10/300 Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,1 ml / min gereinigt. Enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und Nanoscheiben konzentriert, um ~ 10 mg / ml mit einer Amicon Filterzentrifuge.
2. Die Probe wird zweimal (0,22 um Filter) gefiltert vor der Analyse unter Verwendung von DLSein DynaPro NANOSTAR Instrument (Wyatt Technology) in einem 1 ul Innenvolumen Quarzküvette. Daten werden unter Verwendung des eingepasst DYNAMICS Software (Wyatt Technology), um den Durchmesser und das Molekulargewicht der Teilchen zu schätzen.

8. ATPase Messungen

1. Die ATPase-Aktivität von _2-MalFGK rekonstituierten Nanoscheiben wird unter Verwendung eines kolorimetrischen Assay ^8.
2. 1 uM des gereinigten Scheiben und 1 mM ATP zusammen mit steigenden Mengen von männlichen und bei 37 ° C für 20 min gemischt. Die Freisetzung von anorganischem Phosphat wird bei 660 nm gemessen.
3. Die Menge an Phosphat-Freigabe mit einer Standardkurve, die mit einer Standardlösung erzeugte Phosphor verglichen.

9. Repräsentative Ergebnisse

Die Nanoscheiben werden durch Gelfiltrationschromatographie (2A, links) gereinigt. Das Chromatogramm zeigt, dass die Mehrheit der rekonstituierten dISCs (schwarze Kurve) eluieren als einzelner Peak, während Discs mit überschüssigem Lipide (rote Linie) eluieren im Leervolumen und als eine Reihe von breiten Peaks hergestellt. Die Qualität der Nanoscheiben wird weiter durch native Gelelektrophorese und dynamische Lichtstreuung Spektroskopie (DLS) analysiert. Richtig rekonstituierten Discs als scharfe Bande auf dem Gel wandern während diejenigen rekonstituierten in Gegenwart eines Überschusses von Lipiden als eine Schmierschicht (2A, rechts) zu migrieren. Analyse durch DLS zeigt, dass die Scheibe Population homogen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 11,4 nm (2B) ist. Die rekonstituierten Scheiben haben ein scheinbares Molekulargewicht von 215 kDa auf dem DLS-Näherung berechnet. Proben rekonstituiert in Gegenwart eines Überschusses an Lipiden Display weithin Radien um 100 nm verteilt sind, was typisch ist für inhomogene Proben.

Die Qualität der MalFGK _2-Komplex wird durch native-Gelelektrophorese und seine Aktivität durch ATPase beurteiltMessungen (Abbildung 3). Die Maltosebindeprotein MalE bindet mit hoher Affinität an den Transporter MalFGK ₂ ^{9, 10.} Verwendung nicht-denaturierender Gelelektrophorese, ist es möglich, einen Komplex zwischen männlichen und MalFGK ₂ (Abbildung 3A) zu detektieren. Die Stimulation des MalK ₂ ATPase-Aktivität von männlichen in 3B gezeigt.

Abbildung 1. Typische Ablaufplan für die Wiederherstellung Protokoll.

Abbildung 2. Qualitätskontrolle der nanodisc Vorbereitung. A. Gelfiltrationsanalyse (Superdex 200 HR 10/300 Spalte) der Nanoscheiben rekonstituiert bei niedrigen Lipid-Verhältnis (1/3/60; schwarze Kurve) oder hoher Lipid-Verhältnis (1/3/400, rote Kurve). Nativer Gelelektrophorese derselben Disk Zubereitung. Molecular Gewicht Marker in kDa angegeben. B. dynamische Lichtstreuung Analyse der gleichen Disc Vorbereitung. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3. Analyse des MalFGK _2-nanodisc Teilchen. A. Gel-Shift-Analyse MalE mit steigenden Mengen MalFGK _2-nanodisc Partikeln inkubiert. B. ATPase Aktivität des MalFGK _2-nanodisc Teilchen als Funktion der männlichen Konzentration.

Discussion

Wir beschreiben ein einfaches Verfahren für die Wiederherstellung der Maltose Transporter in Nanoscheiben. Der Transporter ist ATPase aktiv und die Interaktion mit dem löslichen Bindungspartner MalE können wiederhergestellt (Abbildung 3). Die erfolgreiche Rekonstitution des Transporters in Nanoscheiben öffnen den Weg für weitere biophysikalische und biochemische Analyse. Von besonderem Interesse ist dabei die systematische Analyse werden die MalK ATPase und Maltose Transportaktivität in Wasch-, Liposomen und Nanoscheiben. ABC-Transporter zu ändern Konformationen während des Transports Zyklus, aber der Beitrag von Lipiden zu dieser Konformationsänderungen bleiben, erkundet zu werden.

Die Herstellung des nanodisc ist relativ einfach, aber kleine Abweichungen von optimalen Bedingungen kann dazu führen, Proteinaggregation irreversibel. In diesem Bericht unterstreichen wir die Bedeutung der Wahl eine korrekte Protein: Lipid-Verhältnis, da eine überschüssige Menge von Lipiden der productio führenn großer polydispersen Liposomen-ähnliche Partikel, die nicht von dem biophysikalischen Qualifizierung eines nanodisc reagieren. Eine frühere Analyse verwendet sehr hohe MSP: Lipide Verhältnis für die Wiederherstellung des Maltose-Transporter (1/120 bis 1/20 in unserer Analyse im Vergleich), aber die Partikel gebildet wurden nicht weiter ¹¹ gekennzeichnet. In jedem Fall ist es wichtig, genau analysieren die Qualität der zubereiteten Materials mit anderen Techniken als Gelfiltration, wie Lichtstreuung Spektroskopie, analytische Ultrazentrifugation oder einfacher, nativer Gelelektrophorese. Die Bedeutung dieser Qualitätskontrolle wurde bei der Zubereitung von Bakteriorhodopsin und ^{P-Glykoprotein-12} markiert. Zwei weitere Parameter stark beeinflussen können den Erfolg der Rekonstitution: 1) die Reinheit des Target-Membran-Protein und das Fehlen von Aggregaten und 2) im richtigen Verhältnis zwischen Membranprotein und Gerüstprotein. Darüber hinaus ist die Aktivität von Phospholipid eingearbeitet into die Scheibe, sowie die Länge der Membran Gerüstprotein, kann die Effizienz der Rekonstitution beitragen. Andere Parameter wie die Löslichkeit und Stabilität des Membranproteins in Detergenslösung, dem Puffersystem, der Temperatur und Zeit-Länge der Rekonstitution müssen gegebenenfalls auch eingestellt werden, wenn die Optimierung der Rekonstitutionsprotokoll werden. Zum Beispiel produzieren Membran Gerüstproteine ​​unterschiedlicher Längen Nanoscheiben unterschiedlicher Größe ^1, die die Rekonstitution der größeren Membranproteinkomplexen oder Membranprotein Oligomere helfen kann.

Die nanodisc wurde erfolgreich mit biophysikalischen Methoden wie SPR, ITC, und Fluoreszenz-Spektroskopie ^12-16 zur Membran Forschung, die mit quantitativen Methoden kämpft helfen kombiniert. Vor kurzem hat die nanodisc mit quantitative Massenspektrometrie kombiniert worden, zur Identifizierung Membranprotein interactomes mit besseren Abdeckung und Genauigkeit17. Die pharmazeutische Industrie hat die gleichen Schwierigkeiten, die Wissenschaft zu studieren Membranproteine ​​plagen beschränkt, obwohl es Tatsache ist, dass die am häufigsten verschriebenen Medikamente Zielmembran Proteine ​​(Rezeptoren, Kanäle, Transporter, Sensoren). Es kann vorhergesagt, dass die nanodisc wird die Entwicklung der Wirkstoff-Screening-Strategien, die mit Membran eingebettet Proteine ​​arbeiten zu helfen.

Materials

Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. <em>coli</em> total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
<span class="jove_content"><strong>Table I. </strong> Specific reagents.</span>
<table border="1"> <tbody> <tr> <td><strong>Name </strong></td> <td><strong>Composition</strong></td> <td><strong>Comments</strong></td> </tr> <tr> <td>DDM stock</td> <td>10% w/v DDM</td> <td>Resuspend in milliQ water and store at -20 &deg;C</td> </tr> <tr> <td>MalFGK<sub>2</sub> stock</td> <td>1-2 mg/ml <br/> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol <br/> 0.03% w/v DDM</td> <td>Store at -70 &deg;C after purification</td> </tr> <tr> <td>MSP stock</td> <td>10-15 mg/ml <br/> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol</td> <td>Store at -70 &deg;C after purification in &lt;1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles</td> </tr> <tr> <td>Phospholipid stock</td> <td>5 nM <em>E. coli </em>total lipids <br/> 0.5% w/v (10 mM) DDM <br/> 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 <br/> 50 mM NaCl</td> <td>Store at 4 &deg;C for 1 week</td> </tr> <tr> <td>TS buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH 7.9 <br/> 50 mM NaCl</td> <td>Store at 4 &deg;C</td> </tr> <tr> <td>TSG10 buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol</td> <td>Store at 4 &deg;C</td> </tr> <tr> <td>TSG20 buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH8 <br/> 100 mM NaCl <br/> 20% v/v glycerol</td> <td>Store at 4 &deg;C</td> </tr> <tr> <td>TSGD buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol <br/> 0.03% w/v DDM</td> <td>Store at 4 &deg;C and add DDM just before use</td> </tr> <tr> <td colspan="3"><p class="jove_content"><strong>Table II. </strong> Solution recipes.</p></td> </tr> </tbody> </table>