Nanoscheiben sind kleine scheibenförmige Partikel, die Membranproteine in einem kleinen Fleckchen Phospholipiddoppelschicht integrieren. Wir stellen eine visuelle Protokoll, das die Schritt-für-Schritt Einarbeitung des MalFGK2 Transporters zu einer Scheibe zeigt.
Die nanodisc ist eine scheibenförmige Teilchen (~ 10-12 nm groß), dass trap Membranproteine in einem kleinen Fleckchen Phospholipiddoppelschicht. Die nanodisc ist eine besonders attraktive Option zur Untersuchung Membranproteine, insbesondere im Kontext von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen. Die Methode erstmals von Sligar und Kollegen auf den amphipathischen Eigenschaften eines technisch hoch ein-helikalen Gerüstprotein aus dem Apolipoprotein A1 abgeleitet. Die hydrophoben Flächen des Gerüstprotein interagieren mit den Fettacyl Seitenketten der Lipiddoppelschicht während die polaren Regionen der wässrigen Umgebung zugewandt. Analysen von Membranproteinen in Nanoscheiben deutliche Vorteile gegenüber Liposom weil die Teilchen kleine, homogene und wasserlösliche sind. Zusätzlich können biochemische und biophysikalische Methoden normalerweise löslichen Proteinen vorbehalten angewandt werden, und von beiden Seiten der Membran. In dieser visuellen Protokoll, präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt Rekonstitution eines gut charakterisiertgekenn zeichnet bakteriellen ABC-Transporter, die männlich-MalFGK 2-Komplex. Die Bildung der Platte eine Selbstorganisation, die auf hydrophoben Wechselwirkungen stattfinden während der progressiven Entfernung des Detergens abhängig ist. Wir beschreiben die wesentlichen Schritte und wir die Bedeutung der Wahl eines korrekten Protein-zu-Lipid-Verhältnis, um die Bildung von Aggregaten und größer polydispersen Liposomen-ähnliche Partikel zu begrenzen. Einfache Qualitätskontrollen wie Gelfiltrationschromatographie, native Gelelektrophorese und dynamische Lichtstreuung Spektroskopie sicherzustellen, dass die Scheiben wurden ordnungsgemäß wiederhergestellt.
Wir beschreiben ein einfaches Verfahren für die Wiederherstellung der Maltose Transporter in Nanoscheiben. Der Transporter ist ATPase aktiv und die Interaktion mit dem löslichen Bindungspartner MalE können wiederhergestellt (Abbildung 3). Die erfolgreiche Rekonstitution des Transporters in Nanoscheiben öffnen den Weg für weitere biophysikalische und biochemische Analyse. Von besonderem Interesse ist dabei die systematische Analyse werden die MalK ATPase und Maltose Transportaktivität in Wasch-, Li…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Canadian Institute of Health Research unterstützt. CSC wurde von einem Postdoc-Stipendium von der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada finanziert. FD ist ein Tier-II Canada Research Chair.
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter | Millipore | UFC805008 | Follow manufacturer's protocol for proper use |
Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | |
E. <em>coli</em> total lipids | Avanti Polar Lipids | 100500C | Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent |
Ni sepharose HP resin | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
Phosphorous standard solution | Sigma-Aldrich | P3869 | |
pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |
Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
<span class="jove_content"><strong>Table I. </strong> Specific reagents.</span> | |||
<table border="1"> <tbody> <tr> <td><strong>Name </strong></td> <td><strong>Composition</strong></td> <td><strong>Comments</strong></td> </tr> <tr> <td>DDM stock</td> <td>10% w/v DDM</td> <td>Resuspend in milliQ water and store at -20 °C</td> </tr> <tr> <td>MalFGK<sub>2</sub> stock</td> <td>1-2 mg/ml <br/> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol <br/> 0.03% w/v DDM</td> <td>Store at -70 °C after purification</td> </tr> <tr> <td>MSP stock</td> <td>10-15 mg/ml <br/> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol</td> <td>Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles</td> </tr> <tr> <td>Phospholipid stock</td> <td>5 nM <em>E. coli </em>total lipids <br/> 0.5% w/v (10 mM) DDM <br/> 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 <br/> 50 mM NaCl</td> <td>Store at 4 °C for 1 week</td> </tr> <tr> <td>TS buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH 7.9 <br/> 50 mM NaCl</td> <td>Store at 4 °C</td> </tr> <tr> <td>TSG10 buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol</td> <td>Store at 4 °C</td> </tr> <tr> <td>TSG20 buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH8 <br/> 100 mM NaCl <br/> 20% v/v glycerol</td> <td>Store at 4 °C</td> </tr> <tr> <td>TSGD buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol <br/> 0.03% w/v DDM</td> <td>Store at 4 °C and add DDM just before use</td> </tr> <tr> <td colspan="3"><p class="jove_content"><strong>Table II. </strong> Solution recipes.</p></td> </tr> </tbody> </table> |