Nanoscheiben sind kleine scheibenförmige Partikel, die Membranproteine in einem kleinen Fleckchen Phospholipiddoppelschicht integrieren. Wir stellen eine visuelle Protokoll, das die Schritt-für-Schritt Einarbeitung des MalFGK2 Transporters zu einer Scheibe zeigt.
Die nanodisc ist eine scheibenförmige Teilchen (~ 10-12 nm groß), dass trap Membranproteine in einem kleinen Fleckchen Phospholipiddoppelschicht. Die nanodisc ist eine besonders attraktive Option zur Untersuchung Membranproteine, insbesondere im Kontext von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen. Die Methode erstmals von Sligar und Kollegen auf den amphipathischen Eigenschaften eines technisch hoch ein-helikalen Gerüstprotein aus dem Apolipoprotein A1 abgeleitet. Die hydrophoben Flächen des Gerüstprotein interagieren mit den Fettacyl Seitenketten der Lipiddoppelschicht während die polaren Regionen der wässrigen Umgebung zugewandt. Analysen von Membranproteinen in Nanoscheiben deutliche Vorteile gegenüber Liposom weil die Teilchen kleine, homogene und wasserlösliche sind. Zusätzlich können biochemische und biophysikalische Methoden normalerweise löslichen Proteinen vorbehalten angewandt werden, und von beiden Seiten der Membran. In dieser visuellen Protokoll, präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt Rekonstitution eines gut charakterisiertgekenn zeichnet bakteriellen ABC-Transporter, die männlich-MalFGK 2-Komplex. Die Bildung der Platte eine Selbstorganisation, die auf hydrophoben Wechselwirkungen stattfinden während der progressiven Entfernung des Detergens abhängig ist. Wir beschreiben die wesentlichen Schritte und wir die Bedeutung der Wahl eines korrekten Protein-zu-Lipid-Verhältnis, um die Bildung von Aggregaten und größer polydispersen Liposomen-ähnliche Partikel zu begrenzen. Einfache Qualitätskontrollen wie Gelfiltrationschromatographie, native Gelelektrophorese und dynamische Lichtstreuung Spektroskopie sicherzustellen, dass die Scheiben wurden ordnungsgemäß wiederhergestellt.
Insgesamt Rekonstitutionsverfahren
Die Rekonstitution Prozess beginnt durch Mischen der Membran Gerüstprotein (MSP) mit dem gereinigten MalFGK 2-Komplex in Gegenwart von Detergens-solubilisierten Phospholipide. Der Schritt wird durch die langsame Entfernen des Detergens durch ein Adsorptionsmittel Polystyrolmaterial genannte Bio-Beads oder Amberlite (Abbildung 1) verfolgt. Selbststartendes Montageprozess tritt am wahrscheinlichsten aufgrund der Wechselwirkungen zwischen den apolaren hydrophoben Phospholipide, die 2 MalFGK Komplexes und der Oberfläche der MSP amphipathisches Protein. Das Endprodukt ist eine scheibenförmige Teilchen von zwei Molekülen MSP Umschlingung der MalFGK 2-Komplex hergestellt. Die Partikel werden von den Addukten und Aggregate durch Ultrazentrifugation und analytische Größenausschluss-Chromatographie getrennt. Die Partikel werden durch native-Gelelektrophorese und dynamische Lichtstreuung Spektroskopie charakterisiert.
Titel "> 1. Vorbereitung der Membrane Scaffold Protein, MSP2. Vorbereitung der MalFGK 2 Complex
3. Vorbereitung der Phospholipide
4. Vorbereitung der Bio-Beads
5. Nanodisc Rekonstitution
6. Nativer Gelelektrophorese
7. Dynamic Light Scattering (DLS)
8. ATPase Messungen
9. Repräsentative Ergebnisse
Die Nanoscheiben werden durch Gelfiltrationschromatographie (2A, links) gereinigt. Das Chromatogramm zeigt, dass die Mehrheit der rekonstituierten dISCs (schwarze Kurve) eluieren als einzelner Peak, während Discs mit überschüssigem Lipide (rote Linie) eluieren im Leervolumen und als eine Reihe von breiten Peaks hergestellt. Die Qualität der Nanoscheiben wird weiter durch native Gelelektrophorese und dynamische Lichtstreuung Spektroskopie (DLS) analysiert. Richtig rekonstituierten Discs als scharfe Bande auf dem Gel wandern während diejenigen rekonstituierten in Gegenwart eines Überschusses von Lipiden als eine Schmierschicht (2A, rechts) zu migrieren. Analyse durch DLS zeigt, dass die Scheibe Population homogen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 11,4 nm (2B) ist. Die rekonstituierten Scheiben haben ein scheinbares Molekulargewicht von 215 kDa auf dem DLS-Näherung berechnet. Proben rekonstituiert in Gegenwart eines Überschusses an Lipiden Display weithin Radien um 100 nm verteilt sind, was typisch ist für inhomogene Proben.
Die Qualität der MalFGK 2-Komplex wird durch native-Gelelektrophorese und seine Aktivität durch ATPase beurteiltMessungen (Abbildung 3). Die Maltosebindeprotein MalE bindet mit hoher Affinität an den Transporter MalFGK 2 9, 10. Verwendung nicht-denaturierender Gelelektrophorese, ist es möglich, einen Komplex zwischen männlichen und MalFGK 2 (Abbildung 3A) zu detektieren. Die Stimulation des MalK 2 ATPase-Aktivität von männlichen in 3B gezeigt.
Abbildung 1. Typische Ablaufplan für die Wiederherstellung Protokoll.
Abbildung 2. Qualitätskontrolle der nanodisc Vorbereitung. A. Gelfiltrationsanalyse (Superdex 200 HR 10/300 Spalte) der Nanoscheiben rekonstituiert bei niedrigen Lipid-Verhältnis (1/3/60; schwarze Kurve) oder hoher Lipid-Verhältnis (1/3/400, rote Kurve). Nativer Gelelektrophorese derselben Disk Zubereitung. Molecular Gewicht Marker in kDa angegeben. B. dynamische Lichtstreuung Analyse der gleichen Disc Vorbereitung. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3. Analyse des MalFGK 2-nanodisc Teilchen. A. Gel-Shift-Analyse MalE mit steigenden Mengen MalFGK 2-nanodisc Partikeln inkubiert. B. ATPase Aktivität des MalFGK 2-nanodisc Teilchen als Funktion der männlichen Konzentration.
Wir beschreiben ein einfaches Verfahren für die Wiederherstellung der Maltose Transporter in Nanoscheiben. Der Transporter ist ATPase aktiv und die Interaktion mit dem löslichen Bindungspartner MalE können wiederhergestellt (Abbildung 3). Die erfolgreiche Rekonstitution des Transporters in Nanoscheiben öffnen den Weg für weitere biophysikalische und biochemische Analyse. Von besonderem Interesse ist dabei die systematische Analyse werden die MalK ATPase und Maltose Transportaktivität in Wasch-, Liposomen und Nanoscheiben. ABC-Transporter zu ändern Konformationen während des Transports Zyklus, aber der Beitrag von Lipiden zu dieser Konformationsänderungen bleiben, erkundet zu werden.
Die Herstellung des nanodisc ist relativ einfach, aber kleine Abweichungen von optimalen Bedingungen kann dazu führen, Proteinaggregation irreversibel. In diesem Bericht unterstreichen wir die Bedeutung der Wahl eine korrekte Protein: Lipid-Verhältnis, da eine überschüssige Menge von Lipiden der productio führenn großer polydispersen Liposomen-ähnliche Partikel, die nicht von dem biophysikalischen Qualifizierung eines nanodisc reagieren. Eine frühere Analyse verwendet sehr hohe MSP: Lipide Verhältnis für die Wiederherstellung des Maltose-Transporter (1/120 bis 1/20 in unserer Analyse im Vergleich), aber die Partikel gebildet wurden nicht weiter 11 gekennzeichnet. In jedem Fall ist es wichtig, genau analysieren die Qualität der zubereiteten Materials mit anderen Techniken als Gelfiltration, wie Lichtstreuung Spektroskopie, analytische Ultrazentrifugation oder einfacher, nativer Gelelektrophorese. Die Bedeutung dieser Qualitätskontrolle wurde bei der Zubereitung von Bakteriorhodopsin und P-Glykoprotein-12 markiert. Zwei weitere Parameter stark beeinflussen können den Erfolg der Rekonstitution: 1) die Reinheit des Target-Membran-Protein und das Fehlen von Aggregaten und 2) im richtigen Verhältnis zwischen Membranprotein und Gerüstprotein. Darüber hinaus ist die Aktivität von Phospholipid eingearbeitet into die Scheibe, sowie die Länge der Membran Gerüstprotein, kann die Effizienz der Rekonstitution beitragen. Andere Parameter wie die Löslichkeit und Stabilität des Membranproteins in Detergenslösung, dem Puffersystem, der Temperatur und Zeit-Länge der Rekonstitution müssen gegebenenfalls auch eingestellt werden, wenn die Optimierung der Rekonstitutionsprotokoll werden. Zum Beispiel produzieren Membran Gerüstproteine unterschiedlicher Längen Nanoscheiben unterschiedlicher Größe 1, die die Rekonstitution der größeren Membranproteinkomplexen oder Membranprotein Oligomere helfen kann.
Die nanodisc wurde erfolgreich mit biophysikalischen Methoden wie SPR, ITC, und Fluoreszenz-Spektroskopie 12-16 zur Membran Forschung, die mit quantitativen Methoden kämpft helfen kombiniert. Vor kurzem hat die nanodisc mit quantitative Massenspektrometrie kombiniert worden, zur Identifizierung Membranprotein interactomes mit besseren Abdeckung und Genauigkeit17. Die pharmazeutische Industrie hat die gleichen Schwierigkeiten, die Wissenschaft zu studieren Membranproteine plagen beschränkt, obwohl es Tatsache ist, dass die am häufigsten verschriebenen Medikamente Zielmembran Proteine (Rezeptoren, Kanäle, Transporter, Sensoren). Es kann vorhergesagt, dass die nanodisc wird die Entwicklung der Wirkstoff-Screening-Strategien, die mit Membran eingebettet Proteine arbeiten zu helfen.
The authors have nothing to disclose.
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter | Millipore | UFC805008 | Follow manufacturer's protocol for proper use |
Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | |
E. <em>coli</em> total lipids | Avanti Polar Lipids | 100500C | Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent |
Ni sepharose HP resin | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
Phosphorous standard solution | Sigma-Aldrich | P3869 | |
pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |
Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
<span class="jove_content"><strong>Table I. </strong> Specific reagents.</span> | |||
<table border="1"> <tbody> <tr> <td><strong>Name </strong></td> <td><strong>Composition</strong></td> <td><strong>Comments</strong></td> </tr> <tr> <td>DDM stock</td> <td>10% w/v DDM</td> <td>Resuspend in milliQ water and store at -20 °C</td> </tr> <tr> <td>MalFGK<sub>2</sub> stock</td> <td>1-2 mg/ml <br/> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol <br/> 0.03% w/v DDM</td> <td>Store at -70 °C after purification</td> </tr> <tr> <td>MSP stock</td> <td>10-15 mg/ml <br/> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol</td> <td>Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles</td> </tr> <tr> <td>Phospholipid stock</td> <td>5 nM <em>E. coli </em>total lipids <br/> 0.5% w/v (10 mM) DDM <br/> 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 <br/> 50 mM NaCl</td> <td>Store at 4 °C for 1 week</td> </tr> <tr> <td>TS buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH 7.9 <br/> 50 mM NaCl</td> <td>Store at 4 °C</td> </tr> <tr> <td>TSG10 buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol</td> <td>Store at 4 °C</td> </tr> <tr> <td>TSG20 buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH8 <br/> 100 mM NaCl <br/> 20% v/v glycerol</td> <td>Store at 4 °C</td> </tr> <tr> <td>TSGD buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH7.9 <br/> 100 mM NaCl <br/> 10% v/v glycerol <br/> 0.03% w/v DDM</td> <td>Store at 4 °C and add DDM just before use</td> </tr> <tr> <td colspan="3"><p class="jove_content"><strong>Table II. </strong> Solution recipes.</p></td> </tr> </tbody> </table> |