Eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Rekonstitution eines ABC-Transporter in Nanodisc Lipid Particles

Zusammenfassung

Nanoscheiben sind kleine scheibenförmige Partikel, die Membranproteine ​​in einem kleinen Fleckchen Phospholipiddoppelschicht integrieren. Wir stellen eine visuelle Protokoll, das die Schritt-für-Schritt Einarbeitung des MalFGK2 Transporters zu einer Scheibe zeigt.

Zusammenfassung

Die nanodisc ist eine scheibenförmige Teilchen (~ 10-12 nm groß), dass trap Membranproteine ​​in einem kleinen Fleckchen Phospholipiddoppelschicht. Die nanodisc ist eine besonders attraktive Option zur Untersuchung Membranproteine, insbesondere im Kontext von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen. Die Methode erstmals von Sligar und Kollegen auf den amphipathischen Eigenschaften eines technisch hoch ein-helikalen Gerüstprotein aus dem Apolipoprotein A1 abgeleitet. Die hydrophoben Flächen des Gerüstprotein interagieren mit den Fettacyl Seitenketten der Lipiddoppelschicht während die polaren Regionen der wässrigen Umgebung zugewandt. Analysen von Membranproteinen in Nanoscheiben deutliche Vorteile gegenüber Liposom weil die Teilchen kleine, homogene und wasserlösliche sind. Zusätzlich können biochemische und biophysikalische Methoden normalerweise löslichen Proteinen vorbehalten angewandt werden, und von beiden Seiten der Membran. In dieser visuellen Protokoll, präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt Rekonstitution eines gut charakterisiertgekenn zeichnet bakteriellen ABC-Transporter, die männlich-MalFGK _2-Komplex. Die Bildung der Platte eine Selbstorganisation, die auf hydrophoben Wechselwirkungen stattfinden während der progressiven Entfernung des Detergens abhängig ist. Wir beschreiben die wesentlichen Schritte und wir die Bedeutung der Wahl eines korrekten Protein-zu-Lipid-Verhältnis, um die Bildung von Aggregaten und größer polydispersen Liposomen-ähnliche Partikel zu begrenzen. Einfache Qualitätskontrollen wie Gelfiltrationschromatographie, native Gelelektrophorese und dynamische Lichtstreuung Spektroskopie sicherzustellen, dass die Scheiben wurden ordnungsgemäß wiederhergestellt.

Protokoll

Insgesamt Rekonstitutionsverfahren

Die Rekonstitution Prozess beginnt durch Mischen der Membran Gerüstprotein (MSP) mit dem gereinigten MalFGK _2-Komplex in Gegenwart von Detergens-solubilisierten Phospholipide. Der Schritt wird durch die langsame Entfernen des Detergens durch ein Adsorptionsmittel Polystyrolmaterial genannte Bio-Beads oder Amberlite (Abbildung 1) verfolgt. Selbststartendes Montageprozess tritt am wahrscheinlichsten aufgrund der Wechselwirkungen zwischen den apolaren hydrophoben Phospholipide, die ₂ MalFGK Komplexes und der Oberfläche der MSP amphipathisches Protein. Das Endprodukt....

Diskussion

Wir beschreiben ein einfaches Verfahren für die Wiederherstellung der Maltose Transporter in Nanoscheiben. Der Transporter ist ATPase aktiv und die Interaktion mit dem löslichen Bindungspartner MalE können wiederhergestellt (Abbildung 3). Die erfolgreiche Rekonstitution des Transporters in Nanoscheiben öffnen den Weg für weitere biophysikalische und biochemische Analyse. Von besonderem Interesse ist dabei die systematische Analyse werden die MalK ATPase und Maltose Transportaktivität in Wasch-, Liposome.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Amicon Ultra-4 50K Zentrifugalfilter	Millipore	UFC805008	Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers für die ordnungsgemäße Verwendung
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli Gesamtlipide	Avanti Polar Lipids	100500C	Gelöst in Chloroform, zu behandeln, wie es sich für ein organisches Lösungsmittel
Ni-Sepharose HP Harz	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphor Standardlösung	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Tabelle I. Spezifische Reagenzien.
			Name Zusammensetzung Kommentare DDM Lager 10% w / v DDM Resuspendieren in milliQ Wasser und bei -20 ° C MalFGK 2 stock 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v Glycerin 0,03% w / v DDM Lagerung bei -70 ° C nach der Reinigung MSP Lager 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v Glycerin Lagerung bei -70 ° C nach der Reinigung in <1 ml Aliquots und vermeiden Sie übermäßige Einfrieren / Auftauen Phospholipid Lager 5 nM E. coli Gesamtlipide 0,5% w / v (10mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Lagerung bei 4 ° C für 1 Woche TS-Puffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Lagerung bei 4 ° C TSG10 Puffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v Glycerin Lagerung bei 4 ° C TSG20 Puffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v / v Glycerin Lagerung bei 4 ° C TSGD Puffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v Glycerin 0,03% w / v DDM Lagerung bei 4 ° C und fügen DDM kurz vor Gebrauch Tabelle II. Lösung Rezepte.