Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultur und Manipulation von embryonalen Maus Bauchspeicheldrüse. Dies stellt eine hervorragende Ex vivo System zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Bauchspeicheldrüse Entwicklung, einschließlich der Morphogenese, Differenzierung und Wachstum. Pankreas Knospe Explantate kann für mehrere Tage kultiviert werden und in einer Reihe von verschiedenen Anwendungen, einschließlich whole-mount Immunfluoreszenz und Live-Bildgebung.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Bauchspeicheldrüse steuert wichtige Funktionen unseres Körpers, einschließlich der Produktion von Verdauungsenzymen und Regulierung des Blutzuckerspiegels 1. Obwohl in den letzten zehn Jahren viele Studien zu einer festen Grundlage für das Verständnis der Bauchspeicheldrüse Organogenese beigetragen haben, bestehen große Lücken in unserem Wissen über frühe Bauchspeicheldrüse Bildung 2. Ein vollständiges Verständnis dieser frühen Ereignisse Einblick in die Entwicklung dieses Organs zu schaffen, sondern auch in unheilbaren Krankheiten, die die Bauchspeicheldrüse zielen, wie Diabetes oder Bauchspeicheldrüsenkrebs. Schließlich werden diese Informationen generieren Konzept für die Entwicklung Zell-Ersatz-Therapien im Rahmen des Diabetes.
Während der Embryogenese, stammt die Bauchspeicheldrüse aus unterschiedlichen embryonalen Auswüchse der dorsalen und ventralen foregut Endoderm am embryonalen Tag (E) 9,5 im Maus-Embryo 3,4. Beide Auswüchse evaginate in das umgebende Mesenchym als feste Epithelienl Knospen, die Proliferation unterziehen, Verzweigung und Differenzierung eine ausgereifte Orgel 2,5,6 generieren. Jüngste Beweise haben vorgeschlagen, dass das Wachstum und die Differenzierung von Pankreas-Zelllinien, einschließlich der Insulin produzierenden β-Zellen, auf ordnungsgemäße gewebespezifischen Architektur, epitheliale Zelle Remodellierung und Positionierung innerhalb des Pankreas Epithel Verzweigungsmittel 7,8 abhängt. Doch wie Verzweigungen Morphogenese auftritt und mit der Proliferation und Differenzierung in der Bauchspeicheldrüse koordiniert ist weitgehend unbekannt. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass die derzeitigen Wissen über diese Entwicklungsprozesse bisher fast ausschließlich auf der Analyse von festen Proben herangezogen, während morphogenetischen Ereignisse hochdynamisch sind.
Hier berichten wir über eine Methode zum Präparieren und Kultivieren von embryonalen Maus-Pankreas Knospen ex vivo am Glasboden Gerichte, die direkte Visualisierung der Entwicklung von Pankreas (Abbildung 1) zu ermöglichen. Dieser Kulture-System ist ideal für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie entwickelt und vor allem Live-Cell-Imaging. Pancreatic Explantate können nicht nur von Wildtyp-Maus-Embryonen hergestellt werden, sondern auch aus gentechnisch veränderten Mauslinien (zB transgenen oder Knockout), so dass Echtzeit-Studien von mutierten Phänotypen. Darüber hinaus ist diese ex vivo Kultursystem wertvolle um die Wirkungen von chemischen Verbindungen auf Bauchspeicheldrüsenentwicklung studieren, ermöglicht, um quantitative Daten über die Proliferation und das Wachstum, die Dehnung, Verzweigungsgrad, Tubulogenese und Differenzierung zu erreichen. Zusammenfassend stellt die Entwicklung eines ex vivo Pankreas Explantatkultur Methode mit hochauflösenden bildgebenden kombiniert eine starke Plattform für die Beobachtung morphogenetischen und Differenzierung Ereignisse, wie sie in den Entwicklungsländern Maus-Embryo auftreten.
Protokoll
Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Technik, die ursprünglich in Percival und Slack 9 beschrieben und optimiert für die konfokale Mikroskopie angepasst.
Ein. Beschichtung von Glass Bottom Kultur Dishes
Die folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank durchgeführt werden.
- Pancreatic Explantate werden in 35-mm-Petrischalen mit 20-mm Durchmesser Glas Mikrowell Boden (zB MatTek Corporation) kultiviert. Verwenden Sie ein Glasboden Gericht pro Explantat Kultur und für die gesamte Dauer der Kultur. Am Tag vor der Präparation und Isolierung der Pank....
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Diskussion
Sobald pankreatischen Schicksal angegeben, durchlaufen Pankreas-Vorläuferzellen umfangreiche Proliferation, Differenzierung und Morphogenese zu bilden schließlich ein reifes und funktionalen Organs 2,4. Derzeit dauert, wie Verzweigen in der Bauchspeicheldrüse und wie es um Vorläuferzellen Proliferation und Differenzierung verbunden ist weitgehend unbekannt. Pancreatic Explantatkulturen stellen ein ideales System zur Aufklärung dieser Prozesse ex vivo 5,9,11. Durch die Kombination von Live-.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Research in Die Spagnoli Labor. wird von der Helmholtz-Gemeinschaft, FP7-IRG-2008-ENDOPANC Zuschuss und ERC-2009-Ab HEPATOPANCREATIC Stipendium finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| Antikörper: Carboxypeptidase E-Cadherin F-Actin Glucagon Insulin β1-Integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histon H3 | AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma Bank Zelluläre Signalübertragung | 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept unter sterilen Bedingungen |
| Zellkultur Wasser | PAA | S15-012 | Kept unter sterilen Bedingungen |
| Kulturschalen (Glasboden), 35-mm- | MatTek Konzern | P35G-0-20-C | |
| Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
| Fötalem Kälberserum Gold- | PAA | A15-151 | Kept unter sterilen Bedingungen |
| Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Lager Sol. 1 mg / ml in Zellkultur-Wasser |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept unter sterilen Bedingungen |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | Kept unter sterilen Bedingungen |
| 4-well Multischalen | Nunc | 176740 | |
| Mikroskope: Inverted konfokalen Mikroskop (LSM 700) Stereomikroskop (Discovery V12) | Zeiss Zeiss | Ziele: C-Apochromat 10x / 0,45 W M27 (Arbeit. dist 1,8 mm;. Bildtiefe ~ 100 mm); C-Apochromat 40x / 1,2 W Korr M27 (Arbeit. dist 0,28 mm;. ~ Bildtiefe 50 um) Durchleuchtung von unten und Glasfaser-Beleuchtung von oben | |
| Paraformaldehyd | Roth | 0.335,3 | Stammlösung 20% |
| Pasteur Pipette (Glas), 150 mm | VWR | HECH567 / 1 | |
| Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-010 | Gehalten in sterile cEDINGUNGEN |
| Petrischalen, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Petrischalen, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH 7,4 | PAA | H15-002 | Kept unter sterilen Bedingungen |
| Federschere 8 mm Klinge gebogen | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3051,3 | |
| Uhrmacher-foreceps Dumont # 5 | Roth | K342.1 |
Referenzen
- Slack, J. Developmental biology of the pancreas. Development. 121, 1569-1580 (1995).
- Pan, F., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).
- Puri, S., Hebrok, M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
