Establishment of Microbial Eukaryotische Anreicherungskulturen aus einer chemisch geschichteten antarktischen See und Bewertung der Kohlenstoff-Fixierung Potential

Zusammenfassung

Mikrobielle Eukaryonten sind sowohl eine Quelle der photosynthetisch gewonnene Kohlenstoff und oben räuberische Arten in permanent eisbedeckten Antarktis Seen. Dieser Bericht beschreibt eine Bereicherung Kultur Ansatz zur metabolisch vielseitiges mikrobielle Eukaryoten aus der Antarktis See, Lake Bonney zu isolieren, und beurteilt anorganischen Kohlenstoff-Fixierung mit einem Radioisotopen-Potential Assay für Ribulose-1 ,5-Carboxylase-Oxygenase bisphophate (Rubisco) Aktivität.

Zusammenfassung

Lake Bonney ist eine der zahlreichen permanent eisbedeckten Seen in den McMurdo Dry Valleys gelegen, Antarktis. Die mehrjährige Eisbedeckung unterhält eine chemisch geschichteten Wassersäule und im Gegensatz zu anderen Gewässern im Landesinneren, verhindert weitgehend externen Eingang von Kohlenstoff und Nährstoffen aus Bächen. Biota sind zahlreichen Belastungen der Umwelt, einschließlich der ganzjährig schweren Nährstoffmangel, niedrige Temperaturen, extreme Schatten, hypersalinity, und 24-Stunden Dunkelheit im Winter ¹ ausgesetzt. Diese extremen Umgebungsbedingungen begrenzen die Biota in Lake Bonney fast ausschließlich an Mikroorganismen ^2.

Einzellige Eukaryoten mikrobielle (so genannte "Protozoen") sind wichtige Akteure im globalen biogeochemischen Kreislauf ³ und spielen eine wichtige ökologische Rolle in der Kreisläufe von Kohlenstoff in den trockenen Tal Seen, belegen sowohl die primären und tertiären Rollen in der aquatischen Nahrungskette. In den trockenen Tal aquatischen Nahrungsnetz, Protisten, die ich dieses Problem behebennorganische Kohlenstoff (Autotrophie) sind die wichtigsten Produzenten von organischem Kohlenstoff für organotrophen Organismen ^{4, 2.} Phagotrophic oder heterotropher Protisten in der Lage Einnahme von Bakterien und Protozoen kleiner wirken als den Top-Prädatoren im Nahrungsnetz ^5. Zuletzt ist ein unbekannter Anteil der Bevölkerung in der Lage Protisten kombinierten mixotrophen Stoffwechsel ^{6, 7.} Mixotrophie in Protisten beinhaltet die Fähigkeit, Photosynthese-Fähigkeit mit phagotrophic Einnahme von Mikroorganismen Beute zu kombinieren. Diese Form der Mixotrophie unterscheidet sich von mixotrophen Stoffwechsel in Bakterien-Spezies, die in der Regel beinhaltet die Aufnahme gelöster Kohlenstoff-Moleküle. Derzeit gibt es nur sehr wenige Isolate von Protisten permanent eisbedeckten polaren Seen, sowie Studien über Protisten Diversität und Ökologie in dieser extremen Umgebung waren begrenzt, ^{8, 4, 9, 10, 5.} Ein besseres Verständnis der Protisten metabolischen Vielseitigkeit in der einfachen trockenen Tal See Nahrungsnetz wird an der Entwicklung von Modellen für die r helfenOle von Protisten im globalen Kohlenstoffkreislauf.

Wir haben hierbei ein Anreicherungskultur Zugang zu potentiell phototrophen und mixotrophen Protisten aus Lake Bonney zu isolieren. Beprobungstiefen in der Wassersäule wurden basierend auf der Lage der Maxima und Primärproduktion Protisten phylogenetische Diversität ^{4, 11,} sowie die Variabilität in den wichtigsten abiotischen Faktoren, die Protisten trophischen Modi gewählt: seichte Beprobungstiefen sind für die wichtigsten Nährstoffe begrenzt, während die tieferen Beprobungstiefen werden durch Licht Verfügbarkeit begrenzt ist. Darüber hinaus wurden Seewasser Proben mit mehreren Arten von Wachstumsmedium, um das Wachstum einer Vielzahl von Organismen fördern phototrophe ergänzt.

RubisCO katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Calvin-Benson Bassham (CBB)-Zyklus, der wichtigste Weg, durch den autotrophen Organismen anorganischen Kohlenstoff zu fixieren und bieten organischem Kohlenstoff für höhere trophische Ebenen in aquatischen und terrestrischen Nahrungsnetze ^12. In dieser Studie we aufgetragen ein Radioisotop-Assay für gefilterten Proben ¹³ modifiziert werden, um maximale Carboxylase-Aktivität als Proxy für Kohlenstoff-Fixierung Potenzial und metabolische Vielseitigkeit in den Lake Bonney Anreicherungskulturen überwachen.

Protokoll

1. Probennahme

1. Wählen Sie und bereiten die Probenahme vor Ort einen Tag vor der Abtastung der Wassersäule. Dadurch können die geschichteten Lagen der Wassersäule nach Störung durch Bohr-und Eis-Loch-Schmelzen zu reformieren. Identifizieren Lage der Bohrstelle durch GPS.
2. Um die Wassersäule gelangen, indem ein Loch gebohrt durch das Eis mit einem Jiffy Eisschnecke an einem 4-Zoll-Jiffy Flug Erweiterung und Schneiden Bit beginnen. Um ein Einfrieren des Bohrers in das Loch zu vermeiden, versuchen Sie, das Bohren in dem flüssiges Wasser zu vermeiden, durch Anhalten Bohrungen ca. 4-6 cm über der Oberseite der Wassersäule.
3. Das Bohrloch muss von einem Durchmesser von 15 bis 60 cm verbreitert vor der Probenahme werden. Dies wird durch Verwendung eines Lochs Schmelzvorrichtung (Hotsy Modell), die beheizte Polyethylenglykol zirkuliert durch ein Kupferrohr erreicht. Loch Schmelzen dauert in der Regel bis zu 18 Stunden.
4. Vor dem Abtasten der Wassersäule, sicherzustellen, dass alle erforderlichen Geräte und Probe StOrage Gefäße werden bei der Probenahme vor Ort montiert. Sampling Materialien umfassen: Niskin Flasche (5-10 L Fassungsvermögen), Winde mit Tiefe-Kabel kalibriert, Messenger, ausreichend Probenflaschen für jede Probenahme Tiefe und Kühlern für Probentransport.
5. Beginnen Probenahme früh am Tag (~ 05.00 Uhr), als Seewasser-Filterung am Tag der Probenahme abgeschlossen sein soll. Sammeln Wasserproben (1-5 L) von einem gewünschten Tiefe (für diese Studie: 6-m, 15-m und 18 m Probetiefe, von der piezometrischen Wasserstand im Eisloch gemessen) unter Verwendung eines Niskin Abtaster an einem kalibrierten Handwinde. Um Störungen der Wassersäule zu verhindern sammeln geringen Tiefen vor tiefer liegende zurück.
6. Shop See Proben in Kühlern und Transport aus der Probe vor Ort auf den Bereich Labor mit einem Schlitten befestigt, um ein ATV (All Terrain Vehicle). Die Proben sollten verarbeitet oder stabilisiert werden (zB: Blitzeis in flüssigem Stickstoff) auf dem Feld unmittelbar nach der Probenahme im Labor.

2. Entwicklunt von Anreicherungskulturen

1. Zur Kultivierung von Anreicherungskulturen, Konzentrat 0,5 bis 1 l Wasser des Sees auf 47 mm 0,45 um Porengröße Polyethersulfon-Filter mit schonende Filtration (<0,3 atm). Wenn die Vielfalt der natürlichen Gemeinschaft gewünscht wird, filtern eine zweite Probe auf 47 mm 0,45 um Porengröße Polyethersulfon-Filter und Protokolle folgen nach Bielewicz et al. ⁴ für Eukaryoten phylogenetische Diversität.
2. Übertragen Sie Filter, um 50 ml sterile Falcon-Röhrchen mit ~ 20 ml gefiltertes Seewasser aus der gleichen Tiefe wie der Sampling-Filter gesammelt. Vorsichtig waschen Zellen aus dem Filter mit einer sterilen Pipette.
3. Übertragen Zellsuspension auf eine 25 cm ² sterile Zellkulturflasche. Fügen Sie gefilterte Wasser des Sees von jeder Probe Tiefe gesammelt, um die Kultur Volumen auf 45 ml zu erhöhen. Richten Sie mehrere Wiederholungen für jede Beprobungstiefe wenn Anreicherungen auf verschiedenen Kulturmedien erwünscht sind.
4. Zuschlag Kulturflaschen mit 50X sterile Lösungen für eine Endkonzentration von 1X der folgenden Kulturmedien: Fett der Basal Medium, BG11 und F / 2. Wenn Anbau von mixotrophen Organismen benötigt wird, Set-up zwei F/2-supplemented Schiffe und fügen 2-3 Körner von sterilen Reis zu einem der Kolben.
5. Inkubieren Kulturflaschen bei niedriger Temperatur (4 ° C) und geringer Einstrahlung (20 pmol Photonen m ^-2 s ^-1) in einer Temperatur-kontrolliertes Wachstum Inkubator für mindestens 4 Wochen in der Antarktis vor dem Versand an Ihre US-Labor. Wenn Isolate gewünscht werden, Platte 250 ul Anreicherungskultur auf Agarplatten mit geeigneten Nährmedien nach 2 Wochen Inkubationszeit.
6. Für den Versand in die USA, Transfer Anreicherungskulturen zu sterilen 50-ml Falcon-Gefäße. Anfrage Sendung Erfordernis der "nicht einfrieren" und "Keep Cool" auf Anfrage lieferbar. Während die Versand-Prozess aus der Antarktis ist relativ schnell (2 Wochen im gewerblichen Luftverkehr) und äußerst zuverlässige, gibt es die Möglichkeit des Verlustes von anspruchsvollen OrgelIsmen während des Transports Prozess. So können Ermittler wollen eine Teilprobe zu bewahren vor der Auslieferung, so dass der Verlust bestimmter Arten während des Versand-Prozess beurteilt werden kann.
7. Nach der Ankunft in den USA, gedeckelt Transfer 5 ml Bereicherung der Kultur in 45 ml geeigneten Nährmedien in einem 125-ml sterilen Erlenmeyerkolben mit einem sterilen Schwamm. Anreicherungskulturen sollte als stehende Kulturen in einem Temperatur-kontrollierten Umweltbedingungen Wachstumskammer (Diurnal Growth Chamber, VWR) bei 4 ° C/20 umol Photonen m ^-2 s ^-1 aufrechterhalten werden. Kulturen sollten an die frische Medien alle 30 Tage übertragen werden.

3. Zelllysat Extraktion aus Gefilterte Anreicherungen

1. Filter 5 ml Anreicherungskultur auf eine 25 mm Whatman GF / F Filter mit leichtem Vakuum (<10 psi). Der Filter kann für mehrere Wochen bei -80 ° C gelagert werden vor Testbeginn RubisCO Aktivität.
2. Schneiden Sie den Filter in 4-5 Abschnitte mit einer sterilen Schere und StahlÜbertragen der Stücke mit einer sterilen Zange in ein 2 ml Schraubverschluss gefüllte ein Fünftel der Weg voll mit 0,1 mm Durchmesser Zirkonia / Silicakügelchen.
3. Hinzufügen von 1,25 ml Filter Extraktionspuffer (50 mM Bicin, 10 mM MgCl _2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA und 0,1% Triton X-100; mit frischem: 10 _mM NaHCO3, 10 mM DTT, 3,3 mM Aminocapronsäure Säure, 0,7 mM Benzamidin, pH 7,8) ¹³ und stören Zellen unter Verwendung eines Minibead Schlagleisten dreimal für 30 Sekunden auf Geschwindigkeitseinstellung 48. Zur Erwärmung der Probe, alternative beadbeating mit 1 min Inkubation Eis zu verhindern.
4. Zentrifugen-Filtereinheiten Aufschlämmung für 2 min bei 3000 × g bei 4 ° C, um eine lose Pellet von GF / F Filter Fasern und Zellwandtrümmer bilden.
5. Entfernen Sie ein 200 ul Aliquot und tauchen ein in 800 ul eiskaltem 90% Aceton. Messen Sie extrahierbaren Chlorophyll (Chl) ein in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 664 nm Werte von 647 nm und ^14. Übertragen Sie den Überstand in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Zentrifugieren remaining Überstand bei 4 ° C für 2 min bei 15.000 × g und den Überstand (Vermeidung von unlöslichen Pellet Zellmembranen und den restlichen GF / F Filterfasern) in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Diese löslichen Zelllysat kann nun in der RUBISCO-Carboxylase-Aktivität des Tests verwendet werden.
7. Lysate können bei -80 ° C nach Zugabe von 12,5% Glycerin und Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Ein Verlust der Aktivität kann nach mehreren Gefrier / Tau-Zyklen abhängig von der Empfindlichkeit der Enzyme in dem Lysat auftreten. Daher sollten Aktivität von frischen gegenüber gefrorenen Lysat vor großem Maßstab Zelllysat Extraktionen getestet werden.

4. RubisCO Carboxylase-Aktivität Filter Assay

1. Übertragen Sie 125 ul von löslichen Lysat in ein 15 ml Schraubdeckel Mikrozentrifugenröhrchen (Kappe nicht erforderlich), die auf Eis gekühlt wurde. Für negative Kontrollproben, fügen Sie 125 ul lösliche Lysat auf 15 mL Schraubdeckel Mikrozentrifugenröhrchen, aber nicht hinzufügen Substrat (in Schritt 4.7). Laufenduplizieren Reaktionen für alle Proben und negativen Kontrollen.
2. Bereiten Sie 10 ml Assay-Puffer frisch (50 mM Bicine-NaOH, pH 8,0, 50 _mM NaHCO3, 25 mM MgCl ₂₎ und Chill auf Eis. Aliquotieren genug von der Assay-Puffer für alle Proben und negativen Kontrollen (100 ul pro Probe / Kontrolle plus 100 ul extra) auf eine 5 ml Tube. Führen Sie alle weiteren Schritte unter einer Abzugshaube.
3. In 40 ul NaH ¹⁴ CO ₃ (500 Ci / ml) pro ml Assay-Puffer auf die aliquotierten Puffer und halten Sie den Puffer auf Eis.
4. Entfernen Sie 10 ul der Assay-Puffer mit ¹⁴ C und verdünnen Sie es in 1 ml Assay-Puffer. Nach dem Umdrehen zu mischen, fügen Sie 100 uL des 1:100 verdünnten Mischung auf 3 ml Bio-Safe II Szintillationszählung Cocktail in einer Szintillationsfläschchen. Umkehren, um zu mischen. Scintillation zählt (Beckman LS6500) sollten mehr als 18.000 cpm, bevor Sie mit dem Test sein.
5. Wenn genügend NaH ¹⁴ CO ₃ wurde der Assay-Puffer aufgenommen worden,bewegen die Reaktionsrohre zu einem trockenen Bad voreingestellt auf 25 ° C und Inkubation für 3-5 min.
6. Geben Sie 100 ul Assay-Puffer zu den Lysaten und Inkubation für 5 Minuten bei 25 ° C.
7. In 20 uL 15 mM Ribulosebisphosphat, um Proben und um die Reaktion für 5-10 Minuten bei 25 ° C.
8. Geben Sie 100 ul Propionsäure (100%) (Fisher), um die Reaktion zu stoppen. Säule für 1 Stunde bei 2.000 xg um die nicht inkorporierte ¹⁴ C. erschöpfen
9. Und das gesamte Volumen der Proben in Szintillationsgefäße mit 3 ml Bio-Safe II Szintillationszählung Cocktail. Bestimmen Sie cpm Säure stabile Endprodukte durch Szintillationszählung (B. Witte, R. Tabita persönliche Mitteilung).
10. Berechnen Sie RubisCO Erwerbsquoten auf einem Chl a Grundlage ^14.

5. Repräsentative Ergebnisse

Wir verwendeten Bereicherung der Anzucht bis zur Kälte-und mixotrophen angepasst phototrophen Protisten mit Wohnsitz in der Antarktis L isolierenake Bonney. Um eine größere Vielfalt von Organismen zu erfassen, testeten wir drei Wachstum Medien-Typen: Kühnen Basal Medium (BBM) ^15, F/2-Si Marine Medium ^{16, 17} und ¹⁸ BG11 Medium. Sichtprüfung der Anreicherungskulturen mittels Lichtmikroskopie ergab, dass die Kulturen von phototrophen Protisten (gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Chlorophyll Pigment in den meisten Zellen) wurden dominiert und beherbergt eine Vielzahl von Zellmorphologien abhängig von der Sampling-Tiefe, aus der das Inokulum wurde genommen und die Art der Medien in der Kultur verwendet werden (Abb. 1).

Wir maßen Höchstsätze der Carboxylase-Aktivität durch das Enzym RubisCO als Proxy für Kohlenstoff-Fixierung Potenzial katalysiert. Chl a Häufigkeit wurde auch als eine Schätzung der phototrophen Protisten Biomasse (2) überwacht. Trotz Anbau aller Kulturen unter den gleichen Temperatur / Licht-Regime (zB 4 ° C/20 mol m ^-2 s ^-1), Kohlenstoff-Fixierung Potenzialund phototrophen Biomasse variiert dramatisch zwischen den Kulturen Bereicherung. Maximale RubisCO Aktivität wurde in Anreicherungskulturen wächst in beiden BBM (Anreicherungen 4 und 6) oder BG11 (Anreicherungen 13 und 14) Wachstum Medien beobachtet, während Kulturen auf F / 2 Wachstumsmedium (Anreicherungen 19, 21, 23) bereichert zeigte eine 4 - bis 34-fach geringere maximale Carboxylase-Aktivitäten. Diese Unterschiede waren nicht auf unteren Ebenen Biomasse in den F / 2 Kulturen, wie Carboxylase-Aktivität auf einem Chl Grundlage exprimiert wurde. Außerdem habe RubisCO Aktivität nicht mit einer Konzentration chl (. Abb. 2, Einschub r = -0,023, p> 0,1) korrelieren. Die BBM Kulturen mit Seewasser von 6 m und 15 m (Anreicherungen 4 und 5) eingeimpft hatte den höchsten Ebenen Chl a, während alle anderen Kulturen ausgestellt relativ niedrigen Chl a, unabhängig davon, RubisCO Enzymaktivität (Abb. 2).

Abbildung 1.Repräsentative mikrobiellen Eukaryoten Anreicherungskulturen die für das Wachstum von verschiedenen Organismen ausgewählt haben. Identität der Kultur wird in der unteren linken Seite der Platten gegeben. Alle Bilder zeigen lichtmikroskopische Aufnahmen erzeugt mittels Ölimmersion bei 1000-facher Vergrößerung.

Abbildung 2. Potenzielle Kohlenstofffixierung Kapazität und extrahierbaren Chlorophyll A-Gehalt in Antarktis mikrobielle Eukaryoten Anreicherungskulturen von Lake Bonney isoliert und aufgewachsen auf verschiedenen Kulturmedien. Siehe Tabelle 1 für Kultur Details. Einschub: Pearson-Korrelation zwischen Chlorophyll und eine Fülle Kohlenstoff-Fixierung in den antarktischen Potenzial mikrobieller Eukaryoten Anreicherungskulturen.

Diskussion

Neuere molekularbiologische Untersuchungen haben eine hohe Vielfalt der einzelligen Eukaryoten in einer Vielzahl von Umgebungen, ^{3, 19, 20} berichtet, jedoch aufgrund des Fehlens von Isolaten im gesamten Spektrum von Lebensräumen Protisten die funktionelle Rolle dieser einzelnen Arten in Nahrungsnetze sind weitgehend unbekannt. In dieser Studie haben wir Methoden beschrieben, um für die mikrobielle Eukaryoten Arten ausstellenden metabolische Vielseitigkeit von einem relativ unterabgetasteten Umgebung, eine per...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
BBM	Sigma	B5282
BG11	Sigma	C3061
F / 2	Sigma	G9903
GF / F Filter, 25 mm	Fisher Scientific	09-874-64
GF / F Filter, 47 mm	Fisher Scientific	09-874-71
Polyethersulfon-Filter, 0,45 um Porengröße, 47 mm	Pall Life Sciences	61854
Sterile Zellkulturflasche, 25 cm 2	Corning	430639
Diurnal Wachstumskammer	VWR	35960-076
Zirconia / Silica-Perlen, 0,1 mm diamter	BioSpec Produkte	11079101z
Mini-Bead Beater	BioSpec Produkte	3110BX
Schraubdeckelflasche Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ul)	USA Scientific	1415-8700
NaH 14 CO 3	ViTrax	VC 194	Halten Sie in Aliquots von 400 ul bei -20 ° C
RuBP	Sigma	R0878-100mg	Man löst in 10 mM Tris-Propionsäure (pH 6,5)