Grauer Star ist die häufigste Ursache für Erblindung in der Welt. Ultraviolette Strahlung der Sonne (UV) ist der Hauptrisikofaktor für die Katarakt-Entwicklung. Ein Tiermodell von weit UVR-B induzierte Katarakt entwickelt. In diesem Artikel beschreiben wir Methoden für die Untersuchung der Entstehung von grauem Star: Exposition gegenüber UV-Strahlung, quantitative RT-PCR und Immunhistochemie.
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Methodenartikel
Charakterisierung der molekularen Mechanismen der
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Grauer Star ist die häufigste Ursache für Erblindung in der Welt ein. Die Weltgesundheitsorganisation definiert Katarakt als einer Trübung der Linse des Auges, die die Übertragung von Licht behindert. Grauer Star ist eine multifaktorielle Erkrankung mit Diabetes, Rauchen, UV-Strahlung (UVR), Alkohol, ionisierende Strahlung, Steroide und Hypertonie. Es gibt starke experimentelle 2-4 und epidemiologische Evidenz 5,6, dass UVR Katarakt verursacht. Wir entwickelten ein Tiermodell für UVR B induzierten Katarakt sowohl betäubt 7 und nicht-narkotisierten Tieren 8.
Das einzige Heilmittel für die Katarakt-Chirurgie ist aber diese Behandlung ist nicht für alle zugänglich. Es wurde geschätzt, dass eine Verzögerung des Einsetzens von Katarakt für 10 Jahre könnte die Notwendigkeit für die Kataraktchirurgie um 50% 9 zu reduzieren. Um das Auftreten von Katarakt verzögern, ist es notwendig, die Mechanismen der Entstehung von grauem Star zu verstehen und wirksame Prävention Strategiegien. Unter den Verfahren zur Kataraktentwicklung spielt Apoptose eine wichtige Rolle bei Einleitung von Katarakt bei Menschen und Tieren 10. Wir konzentrieren uns wurde kürzlich Apoptose in der Linse als Mechanismus zum Kataraktentwicklung 8,11,12. Es wird erwartet, dass ein besseres Verständnis der Wirkung von UV-Strahlung auf der Apoptoseweg werden Möglichkeiten für die Entdeckung neuer Arzneimittel zu verhindern Katarakt liefern.
In diesem Artikel beschreiben wir, wie Katarakt kann experimentell durch in vivo Exposition gegenüber UVR-B induziert. Weitere RT-PCR und Immunhistochemie dargestellt als Werkzeuge zur molekularen Mechanismen von UVR-B induzierte Katarakt studieren.
Protokoll
Ein. Exposition gegenüber ultravioletter Strahlung
- 15 min vor der Belichtung anästhesieren einen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gemisch von 90 mg / kg Ketalar (Ketamin) und 10 mg / kg Rompun (Xylazin) durch intraperitoneale Injektion.
- Platzieren des Tieres in einem Ratten Restrainer und ziehen die Bänder bis Immobilisierung der Ratte ohne einen Stamm Squeeze 13.
- Instill Mydriacyl (Tropicamid), 10 mg / ml, in beiden Augen des Ratten zu induzieren Mydriasis.
- Platzieren des Tieres, so daß ein Auge gegen einen schmalen Strahl von UVR bei 300 nm 10 nm 14 mit voller Breite bei halbem Maximum positioniert und schirmen das kontralaterale Auge mit schwarzer Folie.
- Setzen Sie den rat einseitig zu sub-Schwellendosis 1 kJ / m 2 UVR-B bei 300 nm für 15 min 15.
2. Präparation
- Nach vorgegebenen Nachbelichtung Intervall (1, 5, 24 und 120 Stunden), opfern die 6 Wochen alten Ratte (Gewicht <200 g) von carbon Kohlendioxid Ersticken und Dislokation der Halswirbelsäule.
- Entkernen Augen. Danach legte die Augenhornhaut unten, hinteren Seite nach oben. Dann Stempels eine minimale Öffnung durch Anlegen einer 27 Gauge Kanüle und schieben tangential an der Sklera um eine Beschädigung der Linse, die sehr nahe an der Sklera ist. Dann nutzen Sie ein Paar der Augenchirurgie Schere Umfang geschnitten direkt hinter dem Limbus, bis der hintere Teil der Sklera abgehoben werden kann. Dann heben Sie das Objektiv mit einem stumpfen gebogenen Pinzette.
- Entfernen Sie Reste des Ziliarkörpers von der Linsenäquator unter einem Mikroskop, mit dem Objektiv in einem ausgewogenen Salzlösung nicht länger als 5-10 min.
3. Quantitative RT-PCR
- Platzieren einer Linse in einer Mischung von 350 ul Lysepuffer RA1 (NucleoSpin RNA II Gesamt-RNA Isolation Kit) und 3,5 ul β-Mercaptoethanol in einem 2 ml Eppendorf-Röhrchen.
- Halten Sie die Linse in diesem Mix während 30 min bei Raumtemperatur.
- Homogenisieren Sie das Objektiv miteine Nadel, bis nur harte Kern der Linse wird von der Linse (Cortex und Linsenkapsel im Lysepuffer) verlassen. Entfernen Sie den Kern aus dem Mix.
- Lagern Sie die Proben sofort bei -70 ° C.
- Tauen Sie die Proben und folgen Sie das Protokoll "Total RNA Aufreinigung aus kultivierten Zellen und Gewebe" (NucleoSpin RNA II Gesamt-RNA Isolation Kit).
- Shop-RNA-Proben bei -70 ° C.
- Um eine ausreichende Entfernung von DNA aus jeder Probe zu überprüfen, führen eine PCR unter den folgenden Bedingungen (Schritt 1: 95 ° C für 2 min; Schritt 2 während 40 Zyklen: 95 ° C für 20 sec, 55 ° C für 20 sec, 72 ° C für 20 Sek.; Schritt 3: 72 ° C für 7 min) mit p53 DNA-spezifischen Primern, 5'-Vorwärts ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'und 5'-Reverse TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' und Taq DNA-Polymerase (dNTPack), nach der Herstellung Protokoll. Die erwartete PCR-Produkt ist 243 Basenpaare.
- Ausführen eines 1,5% Agarose-Gel-Elektrophorese DNA-spezifische PCR-Produkt von 243 Basenpaaren nachzuweisen. Zur Vorbereitung1,5% Agarosegel in TBE-Puffer nehmen 3,75 g Agarose und lösen es in 250 ml TBE-Puffer. Hinzufügen Ethidiumbromid (0,5 mg / ml) 500 ul in 500 ml 1,5% Agarose-Gel-Lösung. Das Gemisch wird in einer Mikrowelle und rühren, um die Agarose zu lösen.
Keine der Proben muss keine DNA-spezifischen PCR-Produkte auf 1,5% Agarose-Gelelektrophorese offenbaren.
- Messung der Konzentration von RNA-Proben (1 ul) und das Verhältnis der Probe Absorption bei 260 nm (RNA) und 280 nm (Protein) in einer NanoDrop ND-1000 Spektrophotometer. Wenn das Verhältnis zu Protein von RNA-RNA-Probe Absorption ist 2,0 oder mehr wird die RNA-Probe ist rein. Wenn das Verhältnis der Extinktion RNA-Probe geringer ist als 2,0, Redo RNA Reinigungsschritt 3.5.
- Nehmen ein Volumen von RNA-Probe, die 1 ug cDNA zu synthetisieren und entsprechend dem Protokoll 1. Strang cDNA-Synthese Kit (1 st Strang cDNA-Synthese-Kit für RT-PCR).
- Bewahren cDNA-Proben bei -20 ° C(Für einen Zeitraum von 1 und mehr Jahren, bei -70 ° C).
- Führen quantitative real-time PCR auf iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR Detection System. Last Triplikate auf 96-Well-Platte mit 1 ul cDNA Probe TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay für Caspase 3, nach Anleitung zu fertigen. Last Triplikate auf einem anderen 96-Well-Platte mit 1 ul cDNA Probe TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay für 18s, nach Anleitung (TaqMan Gene Expression Assay Protocol) herstellen. Verdünnen in Serie einen Bruchteil der cDNA aus drei zufällig ausgewählten unbelichteten Linsen. Führen Reihenverdünnungen zusammen mit der cDNA aus Proben in einem 96-Well-Platte.
- Verwenden Sie die Standardkurve Methode zur Quantifizierung der Ergebnisse. Die Zahl der Zyklen bei Schwellenwert Fluoreszenz wird als die Messung in MyiQ Software verwendet. Eine Standardkurve Ausdruck Anzahl der Zyklen an der Schwelle als Funktion der relativen Konzentration des Kalibrator ist established für die seriellen Verdünnungen in jeder Platte. cDNA aus drei nicht behandelten Linse Proben wurde für die Kalibrierung verwendet. Betreffen die Schwelle Anzahl von Zyklen für jede Probe mit der Standardkurve, um die relative Konzentration der Probe gemessen cDNA erhalten. Schließlich erhalten Expressionsniveau der Zielgene durch über die relative Konzentration der Ziel-cDNA, um die interne Kontrolle 18s cDNA.
4. Immunhistochemischen Färbung
- Fixierung
- Sezieren das Auge in PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4).
- Setz das Auge in einem Rohr mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in eiskaltem 20 min gefüllt. Bereiten PFA 4% am Tag zuvor. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung. PFA ist für etwa eine Woche frisch.
- Entfernen PFA mit einer Mikropipette. Dann, mit eiskaltem PBS für 20 min waschen.
- Setzen Sie das Auge in Saccharose 30% bei +4 ° C über Nacht.
- Setzen Sie das Auge in einer Tasse mit Optimal Cutting Temperature (OCT)-Medium gefüllt (Tissue-Tek). Setzen Sie das Auge in eine geeignete Position zum Schneiden.
- Frieren in OCT-Medium über Trockeneis.
- Lagerung bei -70 ° C bis zur Verwendung.
- Schnitte
- Positionieren Sie den Blick für Kryo-Schnitte in angemessener Ebene.
- Geschnitten drei 5 um dicke mittleres Sagittalschnitten von einem zentralen Abschnitt jeder Linse. Entsorgen Sie mindestens 6 Abschnitte zwischen aufeinanderfolgenden Abschnitten zu vermeiden Färbung die gleiche Kerne in verschiedenen Abschnitten.
- Sobald ein Abschnitt geschnitten worden ist, sanft legen eine Folie oben drauf. Der Abschnitt sollte dann auf der Folie haften.
- Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen vor dem Gebrauch. Dias können bei -20 ° C gelagert werden, bis sie benötigt.
- Fluoreszenz Immunhistochemie
- Lassen Proben erreichen Raumtemperatur (5-10 min).
- Zeichnen Ränder um die Proben mit einem PAP-pen (Invitrogen).
- Lassen Sie die Grenze trocken für eine Weile (10 min).
- Beschriften Sie die Objektträger.
- Rehydrieren in 1 × PBS für 15 min.
- Permeabilisieren in Standard-Baustein-Lösung für 30 min.
- Fügen primären Antikörper (polyklonaler Kaninchen, gespalten Caspase-3-Antikörper Asp175 9661; Zelluläre Signalübertragung Technology, Inc) verdünnt 1:3000 in Standard-Baustein-Lösung.
- Speicher in einer befeuchteten Kammer bei 4 ° C über Nacht.
- Waschen in PBS durch Pipettieren (3 × 5 min) oder durch Eintauchen in eine große Badewanne (> 15 min, 1-2 Änderungen).
- Fügen sekundären Antikörper (anti-Kaninchen sekundären Antikörper mit einer spezifischen Absorption / Emissionsspektrum) verdünnt 1:300 in der Standard-Baustein-Lösung.
- Waschen in PBS durch Pipettieren (3 × 5 min) oder durch Eintauchen in eine große Badewanne (> 15 min, 1-2 Änderungen).
- Wischen Sie PAP-pen Abstriche.
- Speicherung in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur während 3 Stunden. Vermeiden Sie Licht.
- Fügen Sie einen Tropfen Vectashield und legen Sie eine Deckglas auf dem Objektträger. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Lassen Sie die Vectashield aushärten (~ 20 min).
- Halten Abschnitten in den dunklen bis zur Analyse.
- Alle Steuer-Abschnitte werden in Abwesenheit von primären Antikörper verarbeitet.
- Achten Sie auf die Ergebnisse innerhalb weniger Stunden unter einem Fluoreszenzmikroskop.
- Graf Epithelzellen 'Kerne von einer Seite Kernbogen zur anderen Seite Kernbogen jeder Linse. Anwenden der Standard Blaufilter alle Linsenepithelzellen Kerne in Blau und einen Standard-Filter, der die Emission des Sekundärantikörpers paßt, um die Caspase-3-positiven Kernen im grünen sehen.
- Aufzeichnung der Anzahl aller Linsenepithelzellen Kerne und die Anzahl der positiven Kernen. Zählen Sie die Zellen dreimal für jeden Abschnitt.
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Ergebnisse
Die verschiedenen Quellen der Variation in den Messungen wurden mit einer Varianzanalyse geschätzt und es wurde festgestellt, dass unter Berücksichtigung drei Messungen pro Tier die Varianz für Messungen in der Größenordnung von 15% der für Tiere war. Somit, wenn man bedenkt gesamte Linse Analyse ist es nicht möglich, die Genauigkeit zu erhöhen. Orthogonal Tests aufgeklärt einen statistisch signifikanten Unterschied für die Caspase-3-Nachricht zwischen 120 hr Latenzzeit im Vergleich zu kürzeren Latenzzeiten Abständen. <...
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Diskussion
Dieses Papier beschreibt Methoden, die Untersuchung der molekularen Ereignisse, die während UVR-B induzierte Katarakt ermöglichen.
In Anbetracht, dass die meisten Informationen für in vivo UVR induzierten Katarakt aus Experimenten an Albino-Sprague-Dawley-Ratten 7, 16, 17, 18, 19 abgeleitet wurde, beschlossen wir, die Albino-Sprague-Dawley-Ratte in der aktuellen Studie zu verwenden. Alter der Ratten betrug sechs Wochen alte. Das Geschlecht wurde gewählt, weiblich ...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
S och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse: Diese Arbeit wurde von der Karolinska Institutet KID-Finanzierung, Swedish Radiation Protection Authority, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, St. Eriks Eye Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg / ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg / ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Schweden | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg / ml |
| Balanced Salzlösung | Alcon | 0007950055 | |
| 3,5 ul β-Mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin RNA II Gesamt-RNA Isolation Kit | Macherey-Nagel GmbH & Co, Düren, Deutschland | 740955,50 | |
| p53 DNA spezifischen Primern | biomers.net GmbH | Maßgeschneiderte | |
| Taq-DNA-Polymerase, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Ethidiumbromidlösung 0,5 mg / ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 Spektralphotometer | NanoDrop Produkte | ||
| 1. cDNA-Synthese-Kit für RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-Well-Platte | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene Expression Assay für Caspase 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assay für 18s | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ Software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Gespaltenen Caspase-3 (Asp175) | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Anti-Kaninchen-IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal-Mikroskop Axioplan 2 Imaging | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyd | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE-Puffer 10x | Promega | V4251 |
Referenzen
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