Vorbereiten T Cell Growth Factor von Rat Splenozyten

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Herstellung von T-Zell-Wachstumsfaktor für die in vitro Expansion von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten-Ratte-Linien verwendet.

Zusammenfassung

Wartung von Antigen-spezifischen T-Zell-Linien oder Klone in Kultur erfordert Runden von Antigen-induzierte Aktivierung von Phasen der Zellexpansion ^1,2 getrennt. Die Zugabe von Interleukin-2 zum Kulturmedium während der Expansionsphase ist notwendig, um den Zelltod zu verhindern und ausreichend, um kurzfristige T-Zell-Linien zu erhalten, hat aber gezeigt, dass Th1 Polarisierung ^{3 zu} erhöhen. Ersatz von Interleukin-2 durch T-Zell-Wachstumsfaktor (TCGF), die eine Mischung von Zytokinen enthält, ist effektiver als Interleukin-2 in die Pflege langfristiger T-Zelllinien in vitro ^3. Darüber hinaus können TCGF leicht in großen Mengen im Labor hergestellt werden und ist viel billiger als rekombinante Interleukin-2.

Hier zeigen wir, wie man TCGF aus Ratten-Splenozyten Kulturüberständen vorzubereiten. Für dieses Verfahren, ernten wir Milzen von naiven Lewis Ratten Thymus und Blutentnahme getötet. Wir bereiten Einzel-Zellsuspensionen aus der Milz, lysieren die Erythrozyten durch osmotischen Schock und Saatgut die Splenozyten in Kulturmedium. Die Zellen werden mit Concanavalin A, ein Mitogen, dass nicht-selektiv aktiviert alle Ratten T-Lymphozyten, induziert die Produktion von Zytokinen stimuliert. Die Kultur supernantant 48 Stunden später ist andexcess Concanavalin gesammelt A ist alpha Methylmannosid gebunden, um es von der Aktivierung T-Zell-Linien, auf die TCGF hinzugefügt werden verhindern. Die TCGF wird dann sterilfiltriert, aliquotiert und bei -20 ° C.

Protokoll

1. Nehmen Sie Lewis Ratte Milz (Ratten zwischen 160-200g sind am besten). Dilacerate auf Eis in einer Petrischale mit PBS + Antibiotika (PBS-PS) unter Verwendung einer Zelle Sieb. Setzen Sie in einer 50 ml Tube. Füllen mit PBS-PS.
2. Spin für 10 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren.
3. Waschen Sie die Zellen zweimal.
4. Das Pellet in NH ₄ Cl 0,15 M (5 ml pro Milz). Vorsichtig mischen und kontinuierlich mit einer Pipette für 3 min auf Eis, um die Erythrozyten zu lysieren. Füllen Sie das Röhrchen mit Medium.
5. Spin für 10 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren.
6. Waschen Sie die Zellen zweimal.
7. Zählen Sie die Zellen. Eine Ratte Milz gibt 200 bis 250.000.000 Zellen.
8. Seed die Zellen bei 2 Millionen pro ml in komplettem Medium: 50 ml pro 75 cm ^2-Kolben.
9. Lassen Sie wachsen für 48 Stunden in den Brutschrank.
10. Spin 15 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren.
11. Sammeln Sie die überstehende, entsorgen Sie die Zellen.
12. Add 15 mg / ml eine Methylmannosid den Überstand. Gründlich mischen.
13. Filter (0,2 mm)
14. Aliquotieren und bei -20 ° C. Kann bei 4 ° C für 10 Tage, wenn nötig gehalten werden.

Diskussion

Wir bereiten TCGF von Lewis Ratte Splenozyten da wir einschläfern regelmäßig naive Ratten von dieser Sorte zu ernten Serum und Thymi zu Lewis Ratten T-Zelllinien in vitro zu stimulieren. Diese TCGF kann verwendet werden, um das Wachstum und Überleben von T-Zell-Linien aus anderen Zuchtlinien gefördert werden. TCGF können auch von anderen Stämmen von Ratten vorbereitet werden.

Materialien

Zur Vorbereitung komplettem Kulturmedium fügen Sie die folgenden zu einer 500 ml Flasche RPMI 1640 und sterile-Filter: 10% FCS, 1 Flasche PSG; 5 ml RPMI Vitamine, 5 ml Natriumpyruvat, 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren, 50 uM beta-Mercaptoethanol, 2 ug / ml Concanavalin A.