Summary
这里描述的是一种技术,其中脂多糖注入泌乳小鼠乳腺通过乳头模拟乳腺炎,通常由细菌感染引起的一个条件。脂多糖(LPS)的结果中增加核因子kappa B(NF-κB)信号,通过NF-κB荧光素酶报告基因小鼠的生物发光成像的可视化。
Abstract
疾病进展和相关的机制,严格学习阶段,最终的临床前模型测试干预是必要的,人类疾病的动物模型。在这些方法中,我们描述了一种技术,其中脂多糖(LPS)被注入到通过乳头,有效建模乳腺炎,或炎症,腺体泌乳小鼠乳腺。增加核因子kappa B(NF-κB)信号,这个模拟感染的结果,显示通过生物 发光成像的NF-κB荧光素酶报告基因小鼠1。
我们的最终目标是研究开发这些方法有关的炎症,乳腺炎在哺乳期腺,通常包括发红,肿胀,免疫细胞浸润2,3。因此,我们敏锐地意识到,切口或任何类型的受伤的皮肤,乳头,或腺体介绍LPS可以在我们的方法中不能使用,因为该方法可能会混淆的读出的炎症。我们也想要一个直接的方法,并不需要特制的手绘移液器或利用显微操作器来保存这些专门的工具。因此,我们确定了一个完整的乳头进入乳腺导管,使用市售的胰岛素注射器和注射剂。此方法是成功的,并允许我们研究与LPS注射相关的炎症,由注射的过程中没有任何额外的效果重叠。此外,该方法还利用NF-κB的荧光素酶报告基因的转基因小鼠和生物发光成像技术的视觉和定量显示增加的NF-κB信号在LPS注射压盖4。
谁愿意在哺乳期乳腺疾病模型,因为归根结底,这项技术的许多学科的研究人员感兴趣的是这些方法这里描述的可用于注射的物质的数量,并不限定于仅LPS。
Protocol
所有的动物实验,范德比尔特大学实验动物护理和使用委员会的批准。
1。准备转基因小鼠
- NGL(N F-κB-G FP-L uciferase)记者转基因(前面描述1)阳性的雌性小鼠,用于此过程。当女性的年龄至少6周,交配与FVB野生型男性。后宫养殖可以使用(在一个笼子里,男1例,女4例)。 (请注意:FVB应变小鼠用于目前的研究中,也可以使用较深的菌株如C57BL6小鼠,但必须被剃光这些小鼠成像前)。
- 交配后15天开始,定期检查的女性,怀孕的征兆(大突出的周长)。每一个女性一旦怀孕,必须分开,从男性的繁殖笼,一旦女性怀孕后。
- 观看分居女性d注意的出生日期时,会出现一个垃圾箱。一胎至少6个幼崽,需要有足够的哺乳期。八天出生后的垃圾,进行协议(的时间安排示意图参见图1)。
2。注射剂
- 溶解E.大肠杆菌 LPS在PBS中至终浓度为0.1微克/微升。 50μl的该溶液中,或共5微克,将被注入到乳腺。要用于控制注射的PBS单独准备的第二管。
- 建立了一个的解剖范围和异氟醚麻醉设备。鼻锥装置应固定的解剖范围,将鼠标放在舞台。一个很好的光源,是否也应该准备的范围本身或从额外的聚光灯。
- 一旦设置完成后,启动异氟醚机和空气流通。
3。导管内注射LPS
- 用50μl的LPS溶液装入短针注射器。设置这一边。
- 首先将女性的异氟醚填充框,然后一次呼吸减慢麻醉的小鼠被注入,将她搬上舞台,并把她的鼻子,鼻锥体内。用脚趾的捏确认鼠标是完全麻醉。在整个过程中,监视鼠标的呼吸,并相应地调整异氟醚的水平。笼中的一窝幼崽,女性已经从应小心放在一边,直到大坝手术后可以返回。
- 使用一小滴70%乙醇作的被毛平躺着,并帮助可视化鼠标的小腹连接到正确的腹股沟乳腺乳头。
- 重点解剖的范围,以获得最佳的乳头。小心地用细镊子,以进一步绘制出乳头的皮肤一组,但不要刺穿或以任何方式伤害乳头。 “钳子应该永远不会被紧紧地夹住操纵组织在一起的时候,但使用的光保持需要的最小量的应力对乳头。
- 使用镊子在左手轻轻握住乳头的地方。慢慢带来到视图使用右手的字段中的预装注射器。应保持的注射器,以便没有重新定位有发生,为了注入的内容。
- 一旦注射器是在视图中,瞄准仔细的乳头的中心内的小导管开口,和插入注射器。
- 不重新定位的手的情况下,注入的注射器的内容和取下针头从乳头。
- 装入的第二注射器用50微升PBS控制喷射。重新定位鼠标在舞台上,以达到最佳效果#4左腹股沟乳腺乳头的另一端鼠标的小腹。重复步骤3.4至3.7的PBS装注射器。
- 一旦这两个注射的并发症ETE,停止麻醉,将鼠标移动到恢复笼。监控的女性,以确保在5分钟内,她成为移动。允许鼠标保持在1小时的恢复笼。 1小时后复苏,将女性的背部与她关进笼子一窝幼崽。应定期监测小鼠注射后6小时,然后再进行成像。根据我们的经验,无不良后果,无论是在女性的幼崽指出,注射和成像之间的期间。但是,如果遇险的迹象中观察到的女性( 如驼背的姿势,咬或防范的注射部位,一般嗜睡)或幼崽(没有动静,皮肤的色调偏蓝)实验应停止使用。
4。生物光学成像NF-κB活动的可视化
- 一旦小鼠已被运送到的摄像设备,开始成像过程,通过打开的软件和机器初始化。打开的是oflurane机和空气流量,确保麻醉流到两个盒和成像室。
- 在清澈的麻醉中的异氟醚麻醉下,将鼠标。一旦有所放缓呼吸,用脚趾的捏确认鼠标是完全麻醉。然后,眼窝注射用无菌注射器注入100μL荧光素板鼠标。
- 立即将鼠标的成像室和设在那里的异氟醚鼻锥体放在她的鼻子下。鼠标应该是仰卧。每一个脚固定在舞台上,用胶带。
- 输入适当的设置的IVIS软件采取白光摄影图像和图像的生物发光活性。曝光时间是10秒。采集图像。
- 一旦已经获得的图像,让鼠标恢复,然后将她的背部与她的小狗在笼子里,并定期监测。
- 照相和发光图像被自动重叠并显示在屏幕上,如在图2中。分析所获取的图像,通过将感兴趣区域的或“ROI”圈的大小相等的鼠标的下腹部(1以上的PBS注入腺和一个在LPS注射腺)的每一侧。设置的读出的光子。数字显示每个区域内检测到的发光( 见图2B)。使用该号码进行统计分析。
- 为了显示最佳的图像,进一步调整阈值的信号显示。这不会改变总的发光读出,但将允许你去除背景信号和可视化的控制和LPS处理腺之间的差异。减少的发光量,直到PBS注射腺背景信号是免费的。这应该留下经LPS处理的腺仍然明显,在图像中,如在图2中看到的信号的增加。
- 的其他与乳腺组织从女性的验尸报告收集,分析部分,包括蛋白质和RNA的检测,就可以完成。
5。代表性的成果
要获得这些方法的解释结果,LPS(PBS)必须被注入到乳腺导管,使相邻的组织不受干扰。注射到皮下组织乳头周围将导致在炎症由于损伤而不是模拟感染。在PBS中稀释的注射液的台盼蓝染料学习的技术时,是有帮助的, 图3A示出一个成功的注射腺注入用100μl的在PBS中的台盼蓝(trypan blue)。如图所示,只在导管的树应该充满注入的溶液,并在注射部位不应该有大丸剂。在这种情况下A“丸”是一个建立的注射液在乳头或乳头周围组织,不输液导管树。这是sh自己在图3B中 。请注意,在图3所示的做法注射完成了21天的哺乳期女性。在泌乳的高度期间(8-10天,在哪个阶段注入LPS是使用目前的协议),牛奶是丰富的,它是很难以可视化的管道和确定注射,如果已正确完成。因此,在哺乳期的稍后的时间点是更好的做法注射。
成功的注射LPS到乳腺导管导致增加腺内的NF-κB活性。 IVIS成像记者鼠标时,这应该是显而易见的,并在LPS注射腺应具有相当高的荧光素酶活性(由光子计数测量),如在图2中所示的(平均比PBS注射腺,脂多糖腺读取200%的的PBS控制信号)。发光在LPS处理腺体排版的一个统计上的显着增加虽然完成一组4只4 ARED向对侧控制实现。另外一个研究中还利用导管乳腺注射或E.大肠杆菌或的LPS到NF-κB记者的转基因。我们自己的工作,笔者看到一个记者活动6小时后显着增加,E.大肠杆菌注射液2。
请注意,由于在大脑和其他腹腔器官的构NF-κB活性,本报记者小鼠的头部和腹部一直显示信号成像时,即使在基线之前的任何操作。因此,该信号应该被忽略关于这个实验。一个明显的信号应保持在LPS注射的乳腺内读出的图像进行调整,以尽量减少在PBS腺背景发光后, 图2示出的图像的背景降低。
不成功的腺体注射最有可能导致损伤的乳头。这将导致指出,皮肤的水平炎症,会是明显的,在成像。这种类型的伤人信号将是非常强大的,局限于乳头的地方发生的损害,而不是整个腺体产生,作为成功后,LPS注射入管道。
图1。过程示意图。
图2。代表结果由IVIS生物发光成像。(A)获取的图像与背景的减少,在LPS注射腺中揭示荧光素酶的活性增加。 (B)图像从一个地区的利益量化补充。 点击这里查看大图 。
图3。练习注射:注射染料通过乳腺导管内注射。交付通过乳头要测试的精确度,在第21天的小鼠的哺乳期用100μl的在PBS中稀释的台盼蓝染料注入。牺牲后,腺体被曝光的可视化。 (A)成功注入和(B)在乳头丸染料。
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Discussion
在这里,我们利用转基因NF-κB记者的鼠标和优化注射技术模型乳腺炎,乳房组织的炎症最常见的原因是细菌感染。在此过程中最关键的一步是导管内注射本身。
在实践中,这通常也是显而易见注射导管内是否已经成功。注射剂(LPS或PBS)应该感到流体,应该有很少或几乎没有阻力的注射器被清空。最常见的陷阱是导致阻塞通道进入腺体,以乳头的损伤。这可以是可视化的寻找在通过解剖作用域乳头。足够的实践,精致操纵乳头时,并通过确保只有最小的针(31G或更高)被用于执行的程序,可避免伤害。此外,如果针的位置不正确,或者如果它滑倒中期针剂,构建后续LPS或PBS可以形成在注射部位和,液体不会弥漫在导管。如果发生这种情况,您可以直观地看到液体积聚在乳头周围的皮肤,也不会感到流体或注射。虽然这个缺陷不能完全被淘汰,出现的时间在大多数情况下是可以避免的实践和通过使用正确的工具。
这里使用的用于注射的技术是为这个特定的实验的关键。乳腺导管内注入一些已公开的方法所需要的乳头和/或通过皮肤切口7,8的切割/移除。在这种情况下,作为该研究的主要终点是腺体内,以确定的NF-κB相关的炎症,皮肤或乳头的任何切口或扰动是不可取的,会诱发炎症信号,由于组织损伤,将混淆LPS诱导的信号。
此外,我们的用市售的胰岛素注射器和注射完成的拉伸,而无需使用微量吸移管或显微操作的,如在几个其他的注射方法不利用乳头去除9,10。我们相信这是唯一可行的,因为在哺乳期的乳头是略有放大,比较容易投入比一个年轻,的处女鼠标乳头。注入处女鼠,可能需要更严格的工具。
这是从图2中清楚,如果正确地进行,到小鼠乳腺导管注射LPS引起局部炎症为可视化的增加,在NF-κB的荧光素酶报告基因活性。其他更广泛的分析模型急性乳腺炎,或者通过E。大肠杆菌或LPS注射到乳腺组织2-3,8,10-14和后续分析。在众多的研究结果,这些研究表明,炎症反应,我之调制器通过与CD14的相互作用,并且它导致涌入受乳腺肺泡巨噬细胞中的中性粒细胞。建议在我们此前发表的作品,以及他人2乳腺炎这种模式可能被进一步用于研究的机制和治疗相关的人,多达3-33%的哺乳期妇女遭受这种痛苦的感染(百分比变化研究方法的基础上)15。它也证明了一个有用的研究工具对于那些在乳品行业,乳腺炎是一种代价高昂的疾病,导致牛奶生产的重大损失每年16。
最后,用在这里,同样的的HLL记者小鼠17 NGL转基因记者小鼠已用于大量的研究来验证,量化和追踪内的各种疾病和发展模式,包括急性向上或向下调节NF-κB的活性肺损伤,肺癌,气管分支的形态,胰岛素抵抗,肥胖,和心肌梗死,17日至21日 。该模型提供了一个额外的例子,这些记者转基因的效用。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院资助CA113734到F Yull和退伍军人事务部(TS布莱克韦尔)获得。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
Dissecting scope | Leica | M3Z | |
Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
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