Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Zusammenfassung

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende Art von weißen Blutkörperchen. Sie bilden einen wesentlichen Teil des angeborenen Immunsystems ^ein. Während der akuten Entzündung, Neutrophile sind die ersten Entzündungszellen an der Stelle der Verletzung zu migrieren. Rekrutierung von Neutrophilen an eine verletzte Stelle ist ein schrittweiser Prozess, der erste, Erweiterung der Blutgefäße, um den Blutfluss zu erhöhen beinhaltet, zweitens mikrovaskulären strukturellen Veränderungen und die Flucht von Plasmaproteinen aus der Blutbahn, drittens, Walzgut, Adhäsion und Transmigration der neutrophilen Granulozyten über die Endothel, und eine vierte Akkumulation von Neutrophilen an der Stelle der Verletzung ^2,3. Eine Vielzahl von in vivo und in vitro-Methoden entwickelt hat, das Studium dieser Prozesse ⁴ ermöglichen. Diese Methode konzentriert sich auf die Transmigration neutrophiler über menschliche Endothelzellen.

Eine beliebte Methode zur Untersuchung der molekularen Vorgänge in neutrophilen Transmigration beteiligt nutzt menschliche neutrophils Interaktion mit primären humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) ^5. Neutrophile isoliert wurde optisch an anderer Stelle ⁶ beschrieben, so wird dieser Artikel die Methode zur Isolierung von HUVEC zeigen. Wenn sie einmal isoliert und bis zur Konfluenz werden die aktivierten Endothelzellen, was zur Hochregulierung von Adhäsion und Aktivierung Moleküle. Zum Beispiel, Aktivierung von Endothelzellen mit Cytokinen wie TNF-α zu einer erhöhten E-Selectin und IL-8-Expression ^7. E-Selektin vermittelt Abscheidung und-rollen von Neutrophilen und IL-8 vermittelt die Aktivierung und feste Adhäsion von Neutrophilen. Nach Adhäsion Neutrophilen transmigrieren. Transmigration kann paracellularly auftreten (durch Endothelzellverbindungen) oder transzellulär (durch die Endothelzellen selbst). In den meisten Fällen treten diese Wechselwirkungen unter Strömungsverhältnisse im Gefäßsystem ^7,8 gefunden.

Die parallele Platte Flusskammer ist ein weit verbreitetes System, dass miMikrofone der hydrodynamische Schubspannungen in vivo gefunden und die Untersuchung der Rekrutierung von Neutrophilen unter Strömungsbedingungen in vitro ^9,10. Mehrere Unternehmen produzieren parallele Platte Strömungskammern und haben jeweils Vor-und Nachteile. Wenn Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich ist, muss Glas oder einem optisch ähnlichen Polymer verwendet werden. Endothelzellen nicht so wachsen wie auf Glas.

Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode zur Phasenkontrast-, DIC-und Fluoreszenz-Imaging von neutrophilen Transmigration mit einem geringen Volumen ibidi Kanal Rutsche aus einem Polymer, dass die rasche Adhäsion und das Wachstum von humanen Endothelzellen unterstützt und verfügt über optische Eigenschaften, die vergleichbar sind gemacht Glas. Bei diesem Verfahren wurden Endothelzellen wachsen und stimuliert einen ibidi μslide. Neutrophile wurden unter Strömungsbedingungen eingeführt und Transmigration beurteilt. Fluoreszenz-Imaging der Übergänge ein Echtzeit-Bestimmung des Ausmaßes der parazellulären gegenübertranszellulären Seelenwanderung.

Protokoll

1. Isolierung und Erhaltung des menschlichen vaskulären Endothelzellen

1. Biosafety Level 2 Verfahren müssen bei der Arbeit mit menschlichem Blut und Gewebe werden. Mit einer Schere durchschnitt die Nabelschnur aus der Plazenta und dann genau untersuchen Sie das Kabel für Blutgerinnsel und Schäden, die durch Spannen Sie das Kabel während der Geburt verursacht werden. Schneiden Sie und entsorgen Sie diese Teile des Rückenmarks.
2. Ansetzen Kollagenase-Lösung mit 1 mg / ml durch Gießen 50 ml warmem Kabel Puffer in einer Röhre, die 50 mg Collagenase enthält.
3. Ändern Sie in sterile Handschuhe und öffnen Sie ein Fach mit autoklavierten Instrument s....

Diskussion

Forscher haben routinemäßig Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten zur Rekrutierung von Neutrophilen und Seelenwanderung zu studieren. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, dermale mikrovaskuläre Endothelzellen ^12, Leber sinusoidalen Endothelzellen ¹³ und Endothelzellen aus menschlichen Nabelvene ¹⁰ begrenzt. Unter ihnen HUVEC gewonnen großer Beliebtheit wegen ihrer relativen Einfachheit der Isolation und Verfügbarkeit. HUVEC sind eine starke In-vitro-Modell.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien und Geräte	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Collagenase Typ 1	Worthington	4197
Cord-Puffer			Zusammensetzung: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-Glucose in 1 mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4-Puffer bei pH 7,4
Endothelial Cell Medien (ECM)			M199 mit Adler-Salzen mit 16% Humanserum mit 100 Einheiten Penicillin 100 ug Streptomycin und 0,3 mg L-glutamine/ml ergänzt
M199	GIBCO	31100-035
Penicillin Streptomycin Glutamat (100X)	Invitrogen	10378-016
Ibidi Kammern	Ibidi	80606
TNF-α	Prepro Tech	300-01A
Human Albumin 20% ige Lösung	Zwillinge Bioproducts	800120050
HBSS ohne Ca 2 + und Mg 2 +	Sigma	H2487-10X
HBSS mit Ca 2 + und Mg 2 +	Sigma	H1387-10X