Dieses Video zeigt Verfahren zur Charakterisierung von humanen Langerhans-Inseln mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Immunhistochemie (IHC). Pankreas-Abschnitten von Kopf, Körper und Schwanz Regionen werden sowohl von H & E und IHC gefärbt, um Inselzellen endokrinen Zusammensetzung (Insulin, Glukagon und pankreatische Polypeptid), Zell-Replikation (Ki67) und entzündlichen Infiltraten (H & E, CD3) zu bestimmen. Die uncinatus Region lokalisiert ist mit IHC für pankreatische Polypeptid.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Schätzungen der Insel Bereich und Zahlen und endokrine Zelle Zusammensetzung im erwachsenen menschlichen Bauchspeicheldrüse variieren von mehreren hunderttausend bis zu mehreren Millionen und Beta Masse reicht von 500 bis 1500 mg 1-3. Mit dieser bekannten Heterogenität wurde ein Standard-Verarbeitung und Färbeverfahren entwickelt, so dass der Bauchspeicheldrüse Regionen klar definiert waren und Inselchen gekennzeichnet mit rigorosen Histopathologie und Immunolokalisation Untersuchungen.
Standardisierte Verfahren für die Verarbeitung von menschlichen Bauchspeicheldrüse von Organspendern gewonnen werden, in Teil 1 dieser Serie beschrieben. Die Bauchspeicheldrüse ist in 3 Regionen (Kopf, Körper, Schwanz) von Querschnitten gefolgt verarbeitet. Querschnitte aus der Bauchspeicheldrüse Kopf weiter unterteilt sind, wie angegeben basierend auf Größe, alphabetisch und nummeriert, um Unterabschnitte bezeichnen. Diese Standardisierung ermöglicht einen kompletten Querschnitt Analyse der Kopfbereich einschließlich der uncinatus Region, die Inselchen enthältin erster Linie aus Pankreas-Polypeptid Zellen Schwanzbereich.
Der vorliegende Bericht umfasst Teil 2 dieser Serie und beschreibt die Verfahren für die serielle Schnitt-und histopathologischen Charakterisierung der Bauchspeicheldrüse Paraffinschnitten mit einem Schwerpunkt auf Inselchen endokrinen Zellen, Replikation und T-Zell-Infiltrate verwendet. Pathologie des Pankreas Sektionen soll sowohl exokrinen, ductularen und endokrinen Komponenten zu charakterisieren. Das exokrine Kammer wird auf das Vorhandensein von Pankreatitis (aktiv oder chronisch), Atrophie, Fibrose und Fett sowie der Leitung ausgewertet, insbesondere in Beziehung auf das Vorhandensein von Pankreas intraduktalen Neoplasie 4. Inseln sind für Morphologie, Größe und Dichte, endokrine Zellen, Entzündung, Fibrose, Amyloid, und die Anwesenheit von replizierenden oder apoptotischen Zellen mit H & E und IHC Flecken ausgewertet.
Die letzte Komponente in Teil 2 beschrieben ist die Bereitstellung der gefärbten Objektträgers als digitalisierte Bilder gesamte Folie. Die digitalisierten Dias werden von Fall und Bauchspeicheldrüse Region in einer Online-Datenbank Pathologie Erstellung eines virtuellen Biobank organisiert. Der Zugang zu dieser Online-Sammlung ist derzeit auf über 200 Kliniker und Wissenschaftler beim Typ 1 Diabetes Forschung beteiligt sind. Die Online-Datenbank stellt ein Mittel für eine rasche und vollständige gemeinsame Nutzung von Daten und für die Ermittler, um Blöcke für Paraffin oder gefrorenen Schnittserien wählen.
Protokoll
1. Mikrotomie für ungefärbte Schnitte
- Richten Sie Wasserbad und Mikrotom für Standard-Paraffin Mikrotomie. Verwenden Sie positiv geladene Objektträger und Pre-Etikett mit der Nummer, des Pankreas Region (Probe) und Foliennummer. Ort Paraffinblock im Mikrotom Spannfutter mit der Kassette Etikett auf der linken Seite.
- Folgen Sie den normalen Mikrotomie Verfahren, Abschnitt in den Block, bis Gewebe einheitlich auftritt. Produzieren Sie ein Band von Serienschnitten (4 um dick, 3-6 je nach Anzahl der erforderlichen anfänglichen Flecken (Vgl. Urteil Kontaktformular, Anhang 1)). Separate Abschnitte in der Band, nehmen Sie jeweils in Ord....
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Diskussion
Die Standardisierung der immunhistochemischen Verfahren ist von entscheidender Bedeutung für die Bildanalyse, insbesondere bei Verwendung von Computer-basierten Algorithmen über eine große Anzahl von Dias über die Zeit. Der IHC-Färbung Verfahren in diesem Bericht beschrieben wird es Batch-Analyse einer gegebenen Spenders Proben mit einem Autostainer innerhalb einer 8-stündigen Arbeitstag und werden von einem früheren Bericht 5 modifiziert. Digitalisierte Bilder gesamten Objektträger eines jeden gefärbten Obje.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Die Autoren danken den Spendern die Familien und die Orgel Beschaffung Organisationen in diesem Forschungs-und Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, und Roshan Agarwal für ihre fachkundige Unterstützung beteiligt. Diese Arbeit wurde von der Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) zur Unterstützung des Network for Organ Donors mit Pankreas-Diabetes gefördert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| 30% igem Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) | FisherScientific | H325-500 | Endogene Peroxidase Blocking |
| ABC-alkalische Phosphatase (AP) | Vektor | AK-5000 | AP-Konjugat |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Der primäre Antikörper |
| Avidin-Blocker | Vektor | SP-2001 | Blockieren Sie endogenes Biotin |
| Biotinylierten Ziegen-anti-Meerschweinchen | Vektor | BA-7000 | Sekundärer Antikörper |
| Bläuungsreagenz | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citratpuffer, pH 6,0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen-Retrieval |
| Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | Leica Autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip Deckfluessigkeit |
| DAB | Vektor | SK-4100 | HRP Chromogen |
| Deeb | DAKO | S2003 | Endogene AP Blockierungsreagenz |
| Eosin Y Alkoholische | FisherScientific | 71204 | Leica Autostainer |
| Ethanole-100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Verschiedene | Entparaffinierung und Eindecken |
| Hämatoxylin | DAKO | S3301 | Dako Autostainer |
| Hämatoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica Autostainer |
| IgG (alle Wirtsarten für Primär-Antikörper) | Verschiedene | Verschiedene | Negative Kontrollen für Vorwahlen |
| Flüssige Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP Chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Ziege anti-Maus AP-Konjugat |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Ziege anti-Maus-HRP-Konjugat |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Ziege anti-Maus-HRP-Konjugat |
| Methanol | FisherScientific | Verschiedene | H 2 O 2 Verdünnungsmittel |
| Normalem Ziegenserum | Vektor | S-1000 | IHC Blockierungsreagenz |
| Heckenschütze | Biocare Medical | BS966M | IHC Blockierungsreagenz |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC-Puffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen-Retrieval |
| Xylol | FisherScientific | Verschiedene | Entparaffinierung und Eindecken |
Tabelle 1. Spezifische Reagenzien.
| Primärer Antikörper | Wirtsarten | Verkäufer | Cat. # | Kommentare und Antigen-Retrieval |
|---|---|---|---|---|
| Paraffin | ||||
| Amylase | Maus | Santa Cruz | SC-46657 | Zitrat |
| Amylin | Maus | Serotec | MCA11267 | Zitrat |
| Carboanhydrase 19,9 | Maus | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, gespalten | Kaninchen | Cell Signaling | 9961 | Citrat oder Trilogy |
| CD20 | Maus | DAKO | M0755 | Citrat oder Trilogy |
| CD3 | Kaninchen | DAKO | A0452 | Zitrat |
| CD34 | Maus | Cell Signaling | 3569 | Zitrat |
| CD4 | Maus | DAKO | M7310 | Zitrat |
| CD45 | Maus | DAKO | M0754 | Zitrat |
| CD68 | Maus | DAKO | M0876 | Zitrat |
| CD8 | Maus | DAKO | M7103 | Zitrat |
| Chromogranin A | Kaninchen | DAKO | A0430 | Zitrat |
| CK17 | Maus | DAKO | M7046 | Zitrat |
| CK19 | Maus | DAKO | M0772 | Zitrat |
| CK7 | Maus | DAKO | M7018 | Zitrat |
| C-Peptid | Kaninchen | Cell Signaling | 4593 | Zitrat |
| Foxp3 | Ratte | e Bioscience | 14-4776-80 | Zitrat |
| Ghrelin | Ziege | Santa Cruz | SC-10.386 | |
| Ghrelin | Kaninchen | Abcam | ab85104 | |
| Glucagon | Kaninchen | DAKO | A0565 | |
| Glucagon | Maus | Abcam | ab10988 | Zitrat |
| Glucagon | Guinea Pig | Bachem | T-5037 | Zitrat |
| Glut-1 | Maus | Abcam | ab40084 | Trilogie |
| Glut-2 | Kaninchen | Santa Cruz | SC-9117 | Nicht in menschlichen Inseln ausgedrückt |
| Insulin | Guinea Pig | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | Maus | DAKO | M7240 | Zitrat |
| Mafa | Kaninchen | Novus Biologische | NB400-137A | Trilogie |
| Pankreaspolypeptid | Kaninchen | Invitrogen | 18-0043 | Zitrat |
| PDX-1 | Guinea Pig | Abcam | ab47308 | Citrat oder Trilogy |
| Proinsulin | Maus | Novocastra | NCL-Proin-1G4 | |
| Proinsulin | Maus | Developmental Studies Hybridoma der Bank | GS-9A8 | Zitrat |
| Secretagogin | Kaninchen | Sigma | HPA 006641 | Zitrat |
| Glattmuskelaktin | Kaninchen | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatin | Kaninchen | DAKO | A0566 | |
| Synaptophysin | Maus | DAKO | M0776 | Zitrat |
| Fresh Frozen | Wirtsarten | Verkäufer | Cat. # | Kommentare |
| CD11b | Ratte | Abcam | ab6332 | Fix mit 4% PF |
| CD11c | Kaninchen | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | Maus | Novus Biologische | NB 600-564 | Verwenden Sie Inkubation über Nacht für Paraffinschnitte |
| CD94 | Maus | Abcam | ab61874 | Fix mit Aceton |
| GAD65 | Maus | Santa Cruz | SC-130.569 | Fix mit 4% PF |
| HLA-ABC | Maus | DAKO | M0736 | Fix mit Aceton oder 4% PF |
Tabelle 2. Primäre Antikörper.
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Aperio ScanScope CS | Aperio | Digitale Dia-Scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC Flecken | |
| Label Matrix-Druck-Software | BioCarta | LM7UP57 | Slide-Label-Software |
| Leica Autostainer XL | Leica | H & E Flecken | |
| Premium-Deckglas | FisherScientific | 12 bis 548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner-Software | |
| Superfrost Plus Objektträger | FisherScientific | 12-550-15 | Positiv geladene Objektträger |
| Gemüsedämpfer | Black und Decker | Verschiedene | Antigen-Retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide-Etikettendrucker |
Tabelle 3. Spezifische Versorgungsgüter und Ausrüstungsgegenstände.
Referenzen
- In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008). ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
