Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Zusammenfassung

Fluoreszierend In situ Hybridisierung (FISH) auf mRNA-Transkripte in den einzelnen Zellen zu identifizieren ermöglicht die Analyse von polygenen Tätigkeit wie die gleichzeitige Transkription von mehr als einem Mitglied der Var Multigenfamilie in Plasmodium falciparum Infizierten Erythrozyten ¹. Die Technik ist anpassbar und kann bei verschiedenen Arten von Genen, Zellen und Organismen verwendet werden.

Zusammenfassung

Adhäsion von Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten (IE) für die menschliche endotheliale Rezeptoren bei Malaria-Infektionen durch Expression PfEMP1 Protein-Varianten durch die Gene kodiert var vermittelt.

Die haploiden P. falciparum Genoms beherbergt etwa 60 verschiedene Gene var von denen nur eine geglaubt hat, die pro Zelle zu einem Zeitpunkt während des Blut Stadium der Infektion transkribiert. Wie solche gegenseitig ausschließenden Regulierung der Gentranskription var erreicht ist unklar, da die Identifizierung einzelner Gene oder var Untergruppen von var Gene mit verschiedenen Rezeptoren und die Folge der unterschiedlichen Bindung auf das klinische Ergebnis von P. zugeordneten falciparum-Infektionen. Vor kurzem hat die gegenseitig ausschließende Transkription Paradigma in Zweifel durch Transkription Assays auf Basis einzelner P. aufgerufen falciparum transcript Identifikation in einzelnen infektiert erythrozytären Zellen unter Verwendung von RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) von var Gentranskription durch den Parasiten im einzelnen Kerne von P. falciparum IE ^1.

Wir beschreiben hier ein ausführliches Protokoll zur Durchführung des RNA-FISH-Methodik zur Analyse von var Gentranskription in Einzel-Kerne von P. falciparum infiziert menschliche Erythrozyten. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von Digoxigenin-Basis und Biotin-markierte Antisense-RNA-Sonden unter Verwendung der Fluoreszenz-Plus-TSA Palette System ² (Perkin Elmer), mikroskopische Analysen und frisch ausgewählt P. falciparum IE. Die in situ-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, um Transkription und Regulation einer Vielzahl von Genen in den verschiedenen Phasen des P. ausgedrückt überwachen falciparum Lebenszyklus und ist anpassungsfähig an andere Malaria-Parasiten Arten und anderen Organismen und Zelltypen.

Protokoll

Ein. Generation von Frisch gewählte infizierten Erythrozyten

Für diesen Test werden die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn unter Verwendung von frisch ausgewählt Kulturen für Oberflächenexpression von PfEMP1 Protein. In diesem speziellen Experiment das 3D7 P. falciparum Linie gewählt wurde mittels spezifischer Antikörper wie zuvor ¹ beschrieben.

Tag 1

1. Ernte 200 ul verpackt Blutzellen aus einer P. falciparum Kultur enthaltend 2-5% Spätstadium IE durch Zentrifugation bei 800 × g für 8 Minuten bei Raumtemperatur.
2. Resuspendieren das Blut Pellet in 2 ml 37 ° C warmes 0,75% Gelatine Lösung in einem 14 ml steriles Röhrchen und lassen für 15-20 min bei 37 ° C, um die nicht-infizierten und Ring-Stadium IE zu sedimentieren lassen.
3. Ernten die Late-Stage-IE, dh die obere Phase in ein neues 14 ml Tube und waschen zweimal mit 10 ml 37 ° C warmen RBC-wash Medien.
4. Verdünnen Sie 50 ul von spezifischen Anti-PfEMP1-Antikörpern in 2 ml 37 ° C warmen RBC-Waschmedium und Sterilfilter.
5. Mischen des gewaschenen Spätstadium IE mit der sterilisierten verdünnten Antiseren in einem 14 ml steriles Röhrchen und Inkubation 30 min bei 37 ° C unter vorsichtigem Rühren.
6. Spin-Down bei 800 xg für 8 min bei Raumtemperatur und waschen zweimal mit 10 ml 37 ° C warmen RBC-wash Medien.
7. Waschen 50 ul Dynabead Protein Eine Suspension zweimal mit RBC-wash Medien mit einem DynaMaq-15 Magnet.
8. Resuspendieren Dynabeads in 300 ul RBC-wash Medien und fügen Sie sie der gewaschenen späten Stadium IE. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C unter vorsichtigem Rühren.
9. Übertragen des Rohres mit dem DynaMaq-15-Magnet. Lassen Sie für 1-2 min und entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit.
10. Resuspendieren Dynabeads in 4-5 ml RBC-wash Medien. Übertragen Sie den Schlauch wieder auf den Magneten und lassen Sie es für 1-2 min, bevor Sie die gesamte Flüssigkeit. Wiederholen Sie den Waschschritt einmal.
11. Übertragen Sie die gewaschenen Perlen zu einem 25 cm ² sterile culture fLASK mit 200 ul frisch verpackt roten Blutkörperchen. Fügen Sie 5-6 ml Albumax Medien in der Kultur. Bewahren Sie über Nacht bei 5% CO ₂ bei 37 ° C.

Tag 2

12. Entfernen Sie die Dynabeads aus der Kultur, wenn der ausgewählte IE hat die frischen roten Blutkörperchen durch die Übertragung all der Kultur auf eine 14 ml steriles Röhrchen reinvaded. Setzen Sie den Schlauch auf den DynaMaq-15 Magneten und lassen für 1-2 min. Dann gießen Sie die gesamte Flüssigkeit zurück zu einer Kulturflasche.
13. Kultur für so wenige Zyklen wie möglich, bis einer Parasitämie von 5-10% und Parasiten sind in der ringstage.
14. IE sollte durch FACS analysiert werden, um sicherzustellen, dass die richtige Oberfläche Phänotyp, dh Protein Expression von entweder PFD1235w and/orPF11_0008 wurde ¹ erhalten.

2. Herstellung von Sonden

Die Antisense-RNA-Sonden wurden aus den variablen Regionen der PFD1235w und dem PF11_0008 var erzeugt </ Em> Gene aus P. falciparum 3D7 genomischer DNA. DNA wurde durch PCR amplifiziert und in den Vektor pSPT18 oder 19 für die Transkription, jeweils gemäß der Beschreibung des Herstellers (Roche). Die Sonden (580 Basenpaare (bp) und 590 bp in der Länge) wurden mit Digoxigenin (DIG) oder Biotin markiert unter Verwendung eines DIG-RNA-Markierungskits oder einer RNA-Markierung Biotin-Mischung sind. Wir bestätigten die Spezifität der Sonden sowohl durch Northern Blot-Analysen und einfacher Bezeichnung FISH-Analyse ^1.

3. Thin Smear und Fixierung der Parasiten Vor In-Situ-Hybridisierung

Tag 1

Alle Schritte werden in einer RNase-freien Umgebung durchgeführt wird und alle Reagenzien sind RNase-frei oder mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) oder RNase Zap (Invitrogen) vorbehandelt. Die Objektträger und Deckgläser sollten mit Alkohol gereinigt werden, um restliche Fertigung Fett zu entfernen. Es ist wichtig, um das Protokoll ohne Pause zwischen den Schritten durchzuführenUm das Risiko einer Kontamination zu minimieren Nuklease.

1. Machen Sie eine dünne Blutausstrich von der Norm Streumethode ^3. Mit der 100x Öl Objektiv des Mikroskops, zählen die IE und berechnen den Anteil der IE in der Kultur. Prüfen, ob die Parasitenstadien in ungefährer Synchronität sind, in dem Ring und der frühen Stadien der Trophozoiten IE Zyklus. Dies sind die pre-Replikation, uni-nukleieren Stufen exprimieren var-mRNA und geeignet für einzelne Zelle FISH Transkriptionsassays dieses Typs.
2. Übertragen 50 ul des Parasiten Kultur bei einer Parasitämie von 5-10%, einem 1,5 ml RNase-freies Eppendorfröhrchen. Säule für 1 min bei 2.000 rpm bei Raumtemperatur.
3. Entfernen Sie die Medien und 50 ul PBS pH 7,2 in DEPC-behandeltem Wasser. Man schüttelt das Rohr vorsichtig. Wiederholen Sie den Zentrifugalsedimentation Schritt zweimal, um die Zellen frei von Medien und Zelltrümmer zu waschen.
4. Machen Sie vier gute Qualität dünne Abstriche. Für jeden Abstrich machen ein Abstrich aufein Durchmesser von 11 mm sowie einer 4 gut Rutsche, dh vier Glasobjektträger insgesamt in einem RNase-free Haube (ein kritischer Schritt). Welle gleitet kurz in die Luft zu trocknen. Make drei zusätzliche Folien für Negativkontrollen-one Rutsche für einzelne Sonde Färbung für jede andere irrelevant Gen durch Verwendung einer spezifischen Sonde, ein weiterer Schieber für RNase-Behandlung und einer dritten Folie mit IE nicht Expression des Gens von Interesse. Lassen Sie die Folien auf der Bank für 10-20 min trocknen.
5. Befestigen Sie die dünnen Schichten durch Zugabe von 60 ul der Fixierung Lösung mit 4% Paraformaldehyd und 5% Eisessig in die Vertiefungen. Lassen Sie für 10 Minuten auf der Bank bei Raumtemperatur.
6. Waschen der Objektträger in 2x SSPE-Puffer für 5 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Entfernen Sie kurz die überschüssige Flüssigkeit durch Berühren die Brunnen, welche die Zellen vorsichtig mit einem Papiertuch.
7. Bedecken Sie die Folien mit 0,01% Pepsin in 0,01 M HCl für 2 min bei 37 ° C (ein äußerst wichtiger Schritt). Waschen der Objektträger in 2x SSPE, 5 min bei Raumtemperatur.
8. Verdünnt das RNase-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml. Bedecken Sie die negative Kontrolle Abstriche mit 60 ul der RNase-Lösung. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C und dann waschen Sie die Folien in 2x SSPE für 5 min bei Raumtemperatur.
9. Fahren Sie direkt mit der Hybridisierung.

4. Hybridisierung von RNA-Sonden auf Fixed Slides

Tag 1

1. Bereiten Sie die Hybridisierung Kammer, wie ThermoStar 100 HC4 oder eine leere Pipettenspitzen-Kasten in einem sauberen Ofen geschoben, durch Bespritzen mit RNase Zap und Abwischen mit einem Papiertuch reinigen. Füllen der Kanäle der Hybridisierungskammer oder dem Boden der Schachtel mit DEPC-behandeltem Wasser, um sicherzustellen, daß die Schieber nicht austrocknet während der Hybridisierung. Schließen Sie die Kammer und Vorwärmung auf 48 ° C.
2. Verdünnt den Sonden in der Hybridisierungslösung bis zu einer Endkonzentration von 12 ng / ul. Denaturieren die Sonde Lösung bei 65 ° C für 5 min in einem Heizblock. Sofort auf Eis kühlen.
3. Kurz an der Luft trocknen die Folien nach der 2x SSPE waschen. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit rund um den Brunnen mit einem Papiertuch.
4. Öffnen Sie die Hybridisierung Kammer und legen Sie die Folien in der Kammer. Anwendung einer oder beide Sonden in einem Gesamtvolumen von 60 ul pro Vertiefung. Sorgfältig decken die Flüssigkeitstropfen mit einem RNase-free Deckglas mit einer sterilen Pinzette.
5. Schließen Sie die Kammer und hybridisieren die Folien bei 48 ° C für mindestens 16 Stunden über Nacht.

5. Antikörper Konjugation und Fluoreszenz Amplification

Tag 2

Die folgenden Schritte werden auf der TSA Plus-Fluoreszenz Palette System von Perkin Elmer basiert. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.

1. Waschen Sie die Slides 3 mal in TNT-Puffer für 5 min unter leichtem Schütteln.
2. Blockieren Sie den Brunnen in 150 ul TNB-Puffer für 30 min.
3. Verdünnt das HRP-konjugiertem α-DIG Antikörpers in TNB-Puffer in einem Verhältnis von 1:100 und das HRP-konjugiertem α-Biotin-Antikörper in TNB-Puffer, in einem Verhältnis von 1:500. Entfernen Sie überschüssiges TNB-Puffer von den Dias mit einem Papiertuch. Bei der Erfassung zwei Transkripte gleichzeitig können beide Antikörper auf einmal zu gehen. Tragen Sie eine Gesamtmenge von 100 ul des Antikörper-TNB-Lösung pro Well und vorsichtig mit einem Deckglas abdecken. Inkubieren Sie die Objektträger für 2 Stunden.
4. Entfernen Sie die Deckgläser vorsichtig. Waschen der Objektträger in TNT-Puffer 3-mal für 5 min.
5. Verdünnt das FITC-Fluorophor in der Tyramid Amplifikationsreagens in einem Verhältnis von 1:500 und anzuwenden 100 ul der Lösung in jede Vertiefung. Bedecken Sie die Wells mit Deckgläsern und inkubieren für 12 min.
6. Entfernen Sie den Deckel rutscht sorgfältig waschen und die Folien 3 mal für 5 min in TNT-Puffer durch vorsichtiges Schütteln.
7. Verdünnt das Cyan3-Fluorophors in der Tyramid Amplifikationsreagens in einem Verhältnis von 1:500. Fügen Sie 100 ul proauch dieser Lösung. Bedecken Sie die Wells mit Deckgläsern und inkubieren für 12 min.
8. Entfernen Sie den Deckel rutscht vorsichtig und dann spülen Sie die Folien schnell durch Eintauchen in TNT-Puffer.
9. Waschen Sie die Slides 3 mal mit TNT-Puffer für 5 min.
10. Eintauchen der Objektträger schnell in DEPC-behandeltem Wasser.
11. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen. Montieren Sie die Folien mit Anti-Fade Reagenz DAPI. Verschließen Sie die Ecken der Deckgläser mit Nagellack.
12. Die Folien sind nun bereit für die Mikroskopie. Halten Sie die Folien mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C abgedeckt, wenn das Experiment abgeschlossen am nächsten Tag ist. Eine vollständige Abdichtung der Seiten der Folien kann werden 24 Stunden nach dem Aufbringen des Anti-Fade-Reagens durchgeführt wird. Dadurch können die Folien für abgebildet werden bis zu einer Woche nachdem das Protokoll abgeschlossen ist.

6. Visualisierung der hybridisierten Sonden

1. Schalten Sie das Mikroskop. Ein Standard Immunfluoreszenzmikroskop ist sufficient für diese Art von Experiment, aber wenn Sie Zugang zu einem konfokalen Mikroskop haben, können Sie dieses auch verwenden, für 3D-Bilder oder Videos von Ihrem gefärbten Zellen zu erhalten. Lassen Mikroskop zum Aufwärmen für 15-30 min. Schalten Sie den Computer und die Software.
2. Prüfen Sie die Qualität der Färbung auf der Immunfluoreszenzmikroskop. Wählen Sie einen Ort mit ein paar Parasiten.
3. Passen Sie die Verstärkung jedes Laser manuell. Passen Sie die Pixel zu 4-6 m ^-1 s ^-1 und die Schritte zu 512 x 512 Pixel wohnen.
4. Nehmen Sie ein Testbild mit Frame Lambda. Stellen Sie die Laserverstärkung.
5. Nehmen Sie ein Minimum von 20 gute Bilder von fluoreszierenden Einzelzellen. Mindestens 2-5 Bilder eines Feldes mit 5-20 Parasiten notwendig sind, um eine faire Überblick über den Prozentsatz an positiven Parasiten erhalten.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der wichtigsten Schritte und der Zeitdauer der RNA FISH Methodik.

Eine Reihe von repräsentativen Bildern von gut und schlecht erhaltenen gefärbten mRNA FISH-Experimente mit einzelnen P. falciparum IE sind in Abbildung 2 gezeigt. Diese intrazellulären Protozoen hat einen kleinen (1-1.5 Mikrometer Durchmesser) Kern, blau gefärbt mit DAPI wird. Vierundzwanzig Stunden nach Erythrozyten Invasion im P. falciparum

Diskussion

FISH-Analyse RNA im Gegensatz zu Verfahren, wie Northern Blot und RT-PCR, erlaubt die Diskriminierung von spezifischen mRNA-Transkripte in der einzelnen Zelle. Dies macht es möglich, zwischen transkriptionell aktiven und inaktiven Zellen zu unterscheiden, in diesem Beispiel, P. parasitischen Protozoen falciparum in menschlichen roten Blutzellen. Solche whole-cell Beobachtungen sind oft notwendig und kann zu entwirren wichtige und neuartige transkriptionellen Mustern ^ein.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Essigsäure	Sigma / Aldrich	338.826-100ml
Albumax Medien: RPMI 1640 Glutamin-Lösung	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml Glutamin-Lösung
Albumax Medien: Gentamycinsulfat Albumax-Lösung	Lonza	BE02-012E	2,5 ml Gentamicinsulfat 50 ml Albumax-Lösung
Albumax-Lösung: Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 g Hypoxanthine
Albumax-Lösung: AlbuMAX II	Ichnvitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax-Lösung: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 Liter RPMI 1640 Auflösen mit Magneten an max. 50 ° C. Filtern sterilisieren und bei -20 ° C in Aliquots.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Resin zu Formamid entionisieren.
Anti-Biotin Ziege pAb Peroxidase Konjugat	Calbiochem	203206
Anti-Dig-Antikörper	Novus Biologicals	NB100-41330
Anti-Fade Reagenz mit DAPI	Invitrogen	P36931	Die Montage media hat für 24 h vor dem Versiegeln die Folie vollständig zu heilen.
Biotin RNA Labeling Mix	Roche	11685597910
Kamera digital	Nikon digitale Anblick DC-F11
Deckgläser	Menzel-glaser	631-1570
Kulturflasche 25 cm 2 Nunclon Oberfläche	Nunc	156340
DEPC	Fluka / Sigma	32.490-100ml	1 ml DEPC in 1000 ml deinonized Wasser. Schreibe einen Rührstab und rühren für 12 Stunden. Autoklaven für 30 min.
Digitalkamera	Nikon digitale Anblick DC-F11
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Magnet	Invitrogen	123-01D
Formamid bioultra 99%	Fluka/ Sigma	47.671-1l-F	Deionisiertes Formamid: 5 g Ionenaustauscherharz pro 100 ml Formamid. Stir 30 min. Anschließend wird durch Whatman-Papier.
. Gelatine 0 75% ige Lösung: Gelatine	Sigma-Aldrich	G2500	3,75 g Gelatine in 500 ml RPMI 1640. Wärme auf 56 ° C zu lösen. Filtern sterilisieren, wenn 56 ° C. Lagerung bei -20 ° C in Aliquots.
. Gelatine 0 75% ige Lösung: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3,75 g Gelatine in 500 ml RPMI 1640. Wärme auf 56 ° C zu lösen. Filtern sterilisieren, wenn 56 ° C. Lagerung bei -20 ° C in Aliquots.
Glutamin-Lösung: L-Glutamin	Sigma-Aldrich	G3126	14,6 g L Glutamin in 500 ml 0,9% NaCl. Auflösen, Filter sterilize und bei -20 ° C in Aliquots.
Glutamin-Lösung: HCl	Sigma	H1758	14,6 g L Glutamin in 500 ml 0,9% NaCl. Auflösen, filtern sterilisieren und bei -20 ° C in Aliquots.
Hybridisierungslösung: Formamid Bio Ultra 99% SSC 20x	Fluka / Sigma	47.671-1l-F	Insgesamt 20 ml, halten gefroren bei -20 ° C in Aliquots 10 ml entionisiertem Formamid
Hybridisierungslösung: Denhardts 50x Konzentrat	Sigma	D2532	5ml 20 × SSC
Hybridisierungslösung: Hefe tRNARoche Blockierungsreagenz	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt 250 ul 20 mg pro ml Hefe tRNA
Hybridisierungslösung: Lachs-Sperma-DNA	Fluka / Sigma	31.149-106GF	0.4g Roche Blockierungsreagenz 1 ml von 10 mg pro ml Lachssperma-DNA (Critical: denaturieren Lachs spermDNA bei 96 ° C für 5 min vor Zugabe zu der Hybridisierungslösung)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Kann durch Hybridisierung Backofen und RNase-frei Hybridisierung Kammern mit DEPC-Wasser aufgefüllt ersetzt werden.
Immersionsöl UV transparent fluoreszenzfrei	Sigma	10.976-1EA
Immunfluoreszenz oder Konfokalmikroskop	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nagellack	Erhältlich in der Apotheke
PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionisiertem H 2 O			Ajust pH auf 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehyd 4%	Fluka / Chemika	76240	4 g PFA in 80 ml PBS / DEPC. Wärme auf 65 ° C, bis die PFA auflöst. 20 ml PBS, dass die Lösung abkühlen. Den pH-Wert auf 7,4. Filtern. Store in Aliquots bei -20 ° C.
Paraformaldehyd 4% / Acid Essigsäure 5%			950 ul Paraformaldehyd + 50 ul Essigsäure
Pepsin	Sigma / Aldrich	P7000
Peroxidase-konjugiertes anti-Biotin	Calbiochem	203206
RBC-wash Medien: RPMI 1640 Glutamin-Lösung	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640-Lösung 5 ml Glutamin
RBC-wash Medien: Gentamycin-Sulfat	Lonza	BE02-012E	2,5 ml Gentamicinsulfat
RNase	Sigma / Aldrich		Machen Sie eine 10 mg / ml Stammlösung.
RNase freies 1,5 ml Tube	Ambion	AM12450
RNase Zap	Ambion	AM9780
Gleitet 4 Vertiefungen 11mm	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3-Citrat x H 2 O (88 g / l) auf pH 7,0 einstellen mit 1M HCl
SSC 20x: Natriumcitrat Dihydrat	Sigma / Aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3-Citrat x H 2 O (88 g / l) auf pH 7,0 einstellen mit 1M HCl
SSPE 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	175,3 g NaCl
SSPE 20x: NaH 2 PO 4	Sigma / Aldrich	S0751	27,6 g NaH 2 PO 4.
SSPE 20x: 4 EDTA-Pulver			9,4 g EDTA-Pulver Fügen DEPC Wasser, pH-Einstellung 7,4. Autospaltete für 20 min
TNB-Puffer: TNT-Puffer			10 ml TNT-Puffer
TNB-Puffer: Blockierungsreagenz			0.05g Blockierungsreagenz Um das Blockierungsreagenz aufzulösen, erhitzen der Lösung auf 60 ° C für eine Stunde unter Rühren. Lagerung bei -20 ° C. (Abgeleitet von der Firma Perkin Elmer TSA-Protokoll.)
TNT-Puffer: Tris / HCl	Sigma	T1503	1 M Tris / HCl, pH 8,0
TNT-Puffer: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT Puffer: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml PH-Wert auf 7,5 bei Raumtemperatur. (Abgeleitet von der Firma Perkin Elmer TSA-Protokoll.)
TSA sowie Cyanine3 / Fluorescein-System	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Lesen Sie das Protokoll aus der TSA Plus-Fluoreszenz Palette Systems sorgfältig durch, bevor das Experiment.
Tubes 14 ml sterile	Almeco - CM LAB Aps	91016