Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Zusammenfassung

Die Fülle von Neurotransmitter-Rezeptoren an den Synapsen stark beeinflusst geclusterten synaptischen Stärke. Diese Methode quantifiziert fluoreszenzmarkierten Neurotransmitter-Rezeptoren in drei Dimensionen mit Single-Auflösung in Synapsen C elegans, So dass Hunderte von Synapsen zu schnell innerhalb einer einzigen Probe, ohne Verzerrungen, die durch z-Ebene Projektion eingeführt wird.

Zusammenfassung

Synapse Stärke bezieht sich auf die Amplitude des postsynaptischen Antworten auf präsynaptische Freisetzung von Neurotransmittern Ereignisse, und hat einen großen Einfluss auf die Gesamt-neuronalen Schaltkreis-Funktion. Synapse Stärke hängt entscheidend von der Fülle von Neurotransmitter-Rezeptoren an Synapsen auf der postsynaptischen Membran gruppierten. Rezeptor-Ebenen sind entwicklungsgeschichtlich, etabliert und kann durch Rezeptortransport zwischen Oberflächen-lokalisierten, subsynaptischen und intrazellulären Pools, die für wichtige Mechanismen der synaptischen Plastizität und Neuromodulation verändert werden. Rigorosen Methoden zur synaptisch-lokalisierte Neurotransmitter-Rezeptor Fülle quantifizieren sind unerlässlich, um synaptischen Entwicklung und Plastizität zu studieren. Die Fluoreszenzmikroskopie ist optimal, weil es räumliche Information erhält, unterscheiden synaptischen aus nicht-synaptischen Pools und Unterscheiden zwischen Rezeptorpopulationen lokalisiert, um verschiedene Arten von Synapsen. Die genetischen Modellorganismus Caenorhabditis elegans ist besonders gut für diese Studien aufgrund der geringen Größe und der relativen Einfachheit seines Nervensystems, seine Transparenz, und die Verfügbarkeit von leistungsfähigen genetischen Techniken geeignet und ermöglicht Untersuchung der nativen Synapsen in intakten Tieren.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Quantifizierung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Neurotransmitter-Rezeptoren in C. elegans. Sein wesentliches Merkmal ist die automatisierte Identifikation und Analyse einzelner Synapsen in drei Dimensionen in mehreren Ebenen konfokalen Mikroskop Ausgabedateien, Tabellieren Position, Volumen, Intensität der Fluoreszenz, Fluoreszenz und insgesamt für jede Synapse. Dieser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile gegenüber der manuellen Analyse der z-Ebene konfokale Projektionen von Daten. Erstens, weil jede Ebene des konfokalen Datensatz enthalten ist, werden keine Daten über z-Ebene Projektion verloren, in der Regel auf Pixelintensität Durchschnitte oder Maxima basiert. Zweitens Identifizierung von Synapsen automatisiert ist, aber durch die ex überprüft werdenperimenter wie die Datenanalyse geht, so dass eine schnelle und genaue Extrahierung von Daten aus einer großen Anzahl von Synapsen. Hunderte bis Tausende von Synapsen pro Probe leicht erhalten werden, produzieren große Datensätze statistische Energie zu maximieren. Überlegungen zur Vorbereitung C. elegans zur Analyse und Durchführung konfokale Bildgebung an Variabilität zwischen den Tieren innerhalb Behandlungsgruppen zu minimieren werden ebenfalls diskutiert. Zwar entwickelt, um C zu analysieren elegans postsynaptischen Rezeptoren, ist dieses Verfahren im Allgemeinen für jede Art von synaptisch-lokalisierten Protein oder Tat, einem Fluoreszenz-Signal, das diskrete Cluster, Punkte oder Organellen lokalisiert ist nützlich.

Das Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt: 1) Herstellung von Proben, 2) konfokale Abbildung, und 3) Bildanalyse. Schritt 1 und 2 sind spezifisch für C elegans, und Stufe 3 ist allgemein anwendbar auf jede punktförmige Fluoreszenz-Signal in der konfokalen Aufnahmen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Würmer zur Bildgebung

Dieser Abschnitt des Protokolls basiert auf veröffentlichten Kultivierungstechniken für C. elegans^1,2 und ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Züchten Sie die Würmer auf NGM-Agarplatten mit hohem Peptonanteil (10 cm) mit NA22 E. coli-Bakterien, bis sie nahezu verhungert sind. Für Immunfärbungen liefert eine Platte zuverlässig genügend Würmer für eine einzelne Färbung, wobei Verluste im Verlauf und die strengen Kriterien zur Auswahl der für die Bildgebung geeigneten Würmer berücksichtigt werden (siehe Teil 2).
2. Ernten Sie die Würmer, indem Sie einige ml ddH₂O auf die Platte gießen, kurz schwenken und die Flüssigkeit in ein 15-ml-Konischgefäß umgießen (wiederholen Sie dies gegebenenfalls, um die meisten Würmer in das Gefäß zu überführen). Zentrifugieren Sie 3 min bei 1000x g im Klinikzentrifugen. Waschen Sie das Pellet 1–3-mal mit ddH₂O, bis der Überstand klar ist, um restliche Bakterien zu entfernen. Verwenden Sie Polypropylen-Transferpipetten zur Überstandentfernung, da Würmer an Glas haften (ab diesem Schritt ist es entscheidend, die Zeit zwischen den Arbeitsschritten zu minimieren, um Verluste an Eivitalität zu vermeiden).
3. Lösen Sie nach dem letzten Waschschritt das Wurmpellet in 5 ml alkalischer Hypochloritlösung auf, um die Würmer zu lysieren und die Eier freizusetzen. Schwenken Sie vorsichtig und untersuchen Sie die Röhrchen etwa alle Minute unter dem Stereomikroskop. Beenden Sie die Lyse, sobald etwa 50 % der Würmer lysiert sind (sie erscheinen dann gekrümmt und aufgebrochen), indem Sie das Röhrchen bis zum Rand mit Eipuffer auffüllen, mehrmals umdrehen und 3 min bei 1000x g pelletieren. Die Lysezeit darf 5 min nicht überschreiten.
4. Entfernen Sie den Überstand mit der Transferpipette und waschen Sie das Pellet dreimal mit Eipuffer.
5. Um die Eier von Verunreinigungen zu trennen, lassen Sie sie auf einem Kissen aus 30 % Saccharose in ddH₂O schwimmen: Entfernen Sie nach dem letzten Waschschritt (Schritt 1.4) vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml ddH₂O. Geben Sie 5 ml sterile 60 %ige Saccharoslösung in ddH₂O hinzu und mischen Sie gründlich. Zentrifugieren Sie 6 min bei 1000x g im Klinikzentrifugen. Die Eier sammeln sich am Meniskus (sie erscheinen trüb), während die Verunreinigungen pelletieren.
6. Saugen Sie die Eier mit einer Kunststoff-Transferpipette in minimalem Volumen auf und überführen Sie sie auf unbeimpfte NGM-Agarplatten. Eventuell an der Röhrchenwand haftende Eier können vorsichtig angespült und ebenfalls übertragen werden. Eine 10-cm-Platte ohne Inokulation pro analysierter Stamm ist ausreichend.
7. Inkubieren Sie die unbeimpften Platten mit den Eiern über Nacht (~16 h) bei 20 °C. Lüften Sie die Platte in den ersten Stunden, um sie zu trocknen, indem Sie den Deckel leicht geöffnet lassen; stellen Sie jedoch sicher, dass die Platte über Nacht abgedeckt ist.
8. Überführen Sie nach dem Schlüpfen die L1-Larven in ein 15-ml-Konischgefäß mit S-Basal-Medium (geben Sie einige ml S Basal auf die Platte, schwenken Sie und gießen Sie in das Röhrchen). Pelletieren Sie im Klinikzentrifugen (3 min, 1000x g), resuspendieren Sie in minimalem Volumen S Basal und übertragen Sie auf 10-cm-NGM-Agarplatten, die mit NA22-Bakterien beimpft sind. Verwenden Sie hierfür zwei Platten pro ursprünglicher Platte aus Schritt 1.1. Inkubieren Sie, bis die Würmer das gewünschte Alter erreicht haben.
9. Überwachen Sie die Kulturen ein- bis zweimal täglich. Falls Gefahr des Verhungerns besteht, übertragen Sie sie auf frische NA22-Platten. Bei Wildtyp-N2-Würmern geht dem Verhungern die Bildung einer Linie oder Welle von Würmern voraus, die sich über die Platte bewegt, während die Tiere massenhaft aus nährstoffarmen Zonen migrieren. Sobald sich diese Struktur gebildet hat, wird die Nahrung innerhalb weniger Stunden vollständig erschöpft sein.
10. Die Würmer sind nun bereit für Immunfärbungen oder Live-Bildgebung. Die Fixierung und Färbung der Würmer in Suspension ist optimal, da so eine große Anzahl intakter Würmer leicht abgebildet werden kann. Färbeverfahren nach der Finney- und Ruvkun-Methode^3–6 sind den Freeze-Crack-Verfahren vorzuziehen, da für die Bildgebung eine große Anzahl Würmer benötigt wird.

2. Konfokale Bildgebung

1. Befestigen Sie die Würmer auf Objektträgern für die konfokale Bildgebung. Passen Sie die Dichte der Würmer auf einige hundert pro Mikroliter an. Erstellen Sie ein Polster aus 2 % Agarose in S-Basal, das von einem dünnen Ring aus Vaseline umgeben ist, um Verdunstung während der Bildgebung zu verhindern (aufgetragen mittels einer 3-ml-Spritze mit abgeschnittener 25-Gauge-Nadel). Pipettieren Sie einige Mikroliter der Wurmsuspension auf eine Deckglasabdeckung (verwenden Sie ein Anästhetikum, wenn lebende Würmer abgebildet werden), und legen Sie das Agarosepolster vorsichtig auf die Abdeckung, wobei die Würmer gleichmäßig über das Polster verteilt werden.
2. Wählen Sie Würmer für die Bildgebung aus. Selektieren Sie Würmer, bei denen die gewünschten Synapsen in Richtung des Objektivs ausgerichtet sind, mit einer radialen Abweichung von nicht mehr als ±45° (wobei 0° bedeutet, direkt zum Objektiv ausgerichtet). Führen Sie diese Beurteilung schnell durch (innerhalb weniger Sekunden), um Photobleichen zu vermeiden. Die Größe der anfänglichen Kulturen ist so optimiert, dass ausreichend Würmer diese geometrischen Kriterien erfüllen.
3. Schließen Sie die konfokale Bildgebung der Probe ab. Relativ flache Proben, die innerhalb von etwa 14 Schichten mit einer Dicke von jeweils 0,4 μm erfasst werden können, liefern die besten Ergebnisse. Schnelle Aufnahmen mit niedriger Auflösung (512 x 512 Pixel) genügen für eine rasche und präzise Datenerfassung. Vermeiden Sie eine Sättigung des Detektors durch übermäßige Signalstärken, da dies zu einer Unterschätzung der Fluoreszenzsignale führt.

3. Automatische Identifizierung und Analyse einzelner synaptischer Cluster

1. Öffnen Sie die mehrkanaligen TIF-Ausgabedateien des konfokalen Mikroskops mit der Software Volocity 4.0 (oder höher) (PerkinElmer).
2. Beschneiden Sie Bereiche des Bildes, die die Struktur von Interesse nicht enthalten (Bild -> Erweiterte Fokustiefe -> Bereich von Interesse mit dem Werkzeug „Freihand-Auswahl (Freehand ROI)“ auswählen –> Aktionen -> Auf Auswahl zuschneiden; Abbildung 2AHinweis: Die erweiterte Fokussierung erzeugt eine Z-Ebenen-Projektion auf dem Computerbildschirm, um die Analyse zu erleichtern, verändert jedoch nicht die zugrunde liegenden Daten; dies gilt ebenso für Helligkeits- und Kontrastanpassungen, falls erforderlich.
3. Messen Sie die Länge des analysierten Bereichs mithilfe des Linienwerkzeugs. Die Länge der Linie wird berechnet und der Datentabelle hinzugefügt (Abbildung 2B).
4. Identifizieren Sie Objekte mithilfe des Filters „Objekte nach Intensität“ (Messmodus). Legen Sie einen Schwellenwert fest, sodass synaptische Cluster hervorgehoben werden und der nicht-synaptische Hintergrund nicht (Abbildung 2C). Die Einbeziehung eines unabhängigen synaptischen Markers, der mit einer anderen Farbe markiert ist, kann helfen, Synapsen eindeutig zu identifizieren. Typische Synapsen umfassen einige bis einige hundert Voxel. Legen Sie die Schwellenwertgrenze einmalig anhand einer Kontrollprobe fest und verwenden Sie diese für alle nachfolgenden Proben. Eine separate Schwellenwertbestimmung für jede Probe ist nicht zulässig, da sie die Möglichkeit von experimenteller Bias eröffnet. Objekte werden automatisch ausgewählt und tabellarisch erfasst (Abbildung 2D).
5. Ordnen und exportieren Sie die Daten. Entfernen Sie Objekte mit 2 oder weniger Voxel, da es sich dabei in der Regel um Hintergrundartefakte handelt. Diese können durch zusätzliche Filterung oder während der nachfolgenden Analyse eliminiert werden. Um ihre spätere Entfernung zu erleichtern, sortieren Sie die Datendatei nach „Objektgröße“, sodass sie alle zusammengefasst werden. Exportieren Sie die Daten im CSV-Format, das mit Microsoft Excel oder anderen Tabellenkalkulationsprogrammen geöffnet werden kann. Jedes Bild erzeugt eine Ausgabedatei.
6. Falls die Volocity-Software nicht verfügbar ist, können alternative Methoden zur Analyse von Z-Ebenen-Projektionen konfokaler Daten verwendet werden (z. B. Ref. ⁷oder manuelle Analyse mit ImageJ), wobei jedoch die dreidimensionalen Informationen verloren gehen (siehe Diskussion).

4. Repräsentative Ergebnisse

Die dargestellte Quantifizierungsmethode sollte zwischen Clusterpopulationen mit unterschiedlicher Helligkeit und unterschiedlichem Volumen unterscheiden können. Repräsentative Bilder und die entsprechenden quantitativen Daten in Abbildung 3 zeigen Beispiele für eine Differenzierung anhand dieser Parameter. Allgemein sollten die Ergebnisse dem entsprechen, was optisch erkennbar ist. Bei der Immunfärbung der UNC-49-GABA-Rezeptoren im ventralen Nervenstrang von C. elegans erschienen alle Tiere typischerweise sehr ähnlich bezüglich Größe und Reife, und die Werte der gesamten synaptischen Fluoreszenz für eine Gruppe von fünf Würmern (bezogen auf die Länge des analysierten Nervenstrangs) wiesen Standardfehler von etwa 10 % des Mittelwerts auf ⁴. Genetische Mutationen und andere experimentelle Behandlungen (z. B. Exposition gegenüber Wirkstoffen) können nicht nur die Werte für Volumen und Intensität sowie die Häufigkeitsverteilung synaptischer Cluster verändern, sondern möglicherweise auch den Entwicklungsverlauf und die Synchronität der Würmer, was zu einer höheren Variabilität führen kann. Die quantitativen Ergebnisse sollten jedoch stets das widerspiegeln, was visuell erkennbar ist; wenn dies nicht der Fall ist, kann die Überprüfung der Bilder und der von Volocity identifizierten Objekte zeigen, wo der Fehler aufgetreten ist, und Maßnahmen wie eine Neubestimmung der Schwellenwerte oder das Entfernen artefaktischer Objekte nahelegen.

Abbildung 1. Herstellung synchronisierter C. elegans-Kulturen. Synchronisierte Kulturen werden mittels dieses Verfahrens erhalten, da die Entwicklung von C. elegans in der L1-Larvenstufe bei Nahrungsenthaltung zum Stillstand kommt und wieder einsetzt, sobald Nahrung zugeführt wird.

Abbildung 2. Quantifizierung synaptischer Pünktchen.

1. Überflüssige Bildbereiche werden zugeschnitten, um die Dateigrößen zu reduzieren und die Spezifität zu erhöhen. Das linke Feld zeigt das Ausgangsbild, das mittlere Feld den ausgewählten Bereich und das rechte Feld das Bild nach dem Zuschneiden. Das rote Signal zeigt die UNC-49-GABA-Rezeptor-Immunfluoreszenz, das grüne Signal zeigt Synaptobrevin-GFP (einen präsynaptischen Marker), das in präsynaptischen GABA-Neuronen exprimiert wird⁴. Klicken Sie hier, um die Abbildung vergrößert anzuzeigen.
2. Entlang des zu analysierenden Nervenstrangabschnitts wird eine Linie gezogen, deren Länge automatisch in der Ergebnistabelle erfasst wird. Diese Information ist notwendig, um synaptische Daten zu normalisieren, da die Länge des analysierbaren Nervenstrangs um das Mehrfache variieren kann, wenn die Würmer während der Färbung fragmentieren. Klicken Sie hier, um die Abbildung vergrößert anzuzeigen.
3. Ein Schwellenwert wird angewendet, um einzelne synaptische Cluster zu identifizieren. Das linke Feld zeigt das Bild vor der Schwellenwertanwendung; Beispiele unterschiedlicher Schwellenwerte sind in separaten Feldern dargestellt (grünes Signal weggelassen). Jedes identifizierte Objekt wird im Bild als farbige Region dargestellt. Beachten Sie die Übereinstimmung zwischen den visuell erkennbaren synaptischen Clustern im äußersten linken Feld und den farbigen Regionen im äußersten rechten Feld. Klicken Sie hier, um die Abbildung vergrößert anzuzeigen.
4. Jedes identifizierte Objekt wird einzeln in der Ergebnistabelle aufgelistet. Einzelne Objekte können ausgewählt und bei Bedarf im Bild hervorgehoben werden. Beachten Sie, dass die Tabelle Informationen für den roten („Rhodamin“) und den grünen („EGFP“) Kanal enthält; die Informationen des grünen Kanals können irreführend sein, da die Objekte ausschließlich basierend auf der roten Fluoreszenz identifiziert wurden. Diese Analyse kann ebenfalls mit Einzelfarbenbildern durchgeführt werden. Klicken Sie hier, um die Abbildung vergrößert anzuzeigen.

Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse. Repräsentative Mikroaufnahmen von Wildtyp-C. elegans, die für UNC-49-GABA-Rezeptoren gefärbt wurden, vor (A) und nach (B) Behandlung mit Muscimol, einem GABA-Rezeptoragonisten, der nach längerer Exposition eine Downregulation der Rezeptoren bewirkt. Die Darstellungen zeigen zugeschnittene Bilder vor (links) und nach (rechts) Schwellwertbestimmung und Entfernung kleiner Hintergrundflecken. (C) Diagramme quantitativer synaptischer Parameter für die in (A) und (B) gezeigten Proben: Gesamtfluoreszenz, normiert auf die Länge des Nervenstrangs (links), sowie kumulative Wahrscheinlichkeits-Histogramme des Fluoreszenzgehalts einzelner Synapsen (Mitte) und des Synapsenvolumens (rechts), die eine statistisch signifikante Verringerung des synaptischen Gehalts und Volumens nach Agonistenexposition zeigen (n = 60 Synapsen für unbehandelt, n = 115 Synapsen für mit Muscimol behandelte; p < 0,001, Kolmogorov-Smirnov-Test http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html).

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode wurde entwickelt, um quantitative Multi-Parameter-Daten für große Populationen von Synapsen in C extrahieren elegans, bei gleichzeitiger Maximierung der Konsistenz innerhalb Behandlungsgruppen. Drei Merkmale tragen zu diesen Zielen. Zunächst wird Immunfärbung auf synchrone Wurm Populationen durchgeführt, um sicherzustellen, dass alle Tiere gleich alt sind. Dieser Schritt ist wichtig, weil Entwicklungs-Regulierung der Expression Effekte der experimentellen Behandlung zu ver...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name der Software	Firma		Kommentare (optional)
Endgeschwindigkeit, v4.0 oder höher	PerkinElmer / Improvision		Überprüfen Sie Ihre lokalen Imaging Core Facility für den Zugang zu dieser Software. Demo-Software ist auf der Website von PerkinElmer zur Verfügung. Diese Methode erfordert nur die Quantifizierung des Moduls Endgeschwindigkeit.
			Tabelle 2. Spezifischen Reagenzien und Geräte.
			Egg-Puffer NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 HEPES (Den pH-Wert 7,3) 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM Alkalischem Hypochlorit (für 5 ml) Frische Haushaltsbleiche (verwerfen Flasche 30 Tage nach dem Öffnen) 10 N NaOH ddH 2 O 1,0 ml 0,25 ml 3,75 ml
			Tabelle 1. Solutions.