Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung

18K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/4096

⸱

15. Juni 2012

 , 
1Department of Mechanical Engineering, Vanderbilt University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Kombinieren der monodispersen Tropfenerzeugung mit Beschleunigungssensoren Anordnung von Zellen und Partikeln, beschreiben wir ein Verfahren, um eine gewünschte Anzahl von Zellen oder Teilchen in einem einzelnen Tropfen mit kHz Preise zu kapseln. Wir demonstrieren die Effizienz zweimal höher sind als die von ungeordneten Kapselung für Single-und Double-Teilchen-Tropfen.

Zusammenfassung

Mikrofluidische Einschließungsmethoden wurden bereits früher genutzt, um Zellen in wässrigen, monodispersen Tröpfchen im Pikoliterbereich einzukapseln, wodurch eine Isolation von der Gesamtflüssigkeitsumgebung erreicht wird, was Anwendungen in der Hochdurchsatz-Screening, Zytometrie und Massenspektrometrie ermöglicht. Wir beschreiben eine Methode, die nicht nur die Einschließung einzelner Zellen ermöglicht, sondern auch die wiederholte Erfassung einer definierten Anzahl von Zellen (hier demonstrieren wir die Einschließung von einer und zwei Zellen), um sowohl die Isolation als auch die Wechselwirkungen zwischen Zellen in Gruppen kontrollierter Größe zu untersuchen. Durch die Kombination von Tröpfchengenerierungstechniken mit der Ordnung von Zellen und Partikeln zeigen wir eine gezielte Einschließung zellgroßer Partikel für eine effiziente, kontinuierliche Kapselung. Unter Verwendung einer wässrigen Partikelsuspension und einer nicht mischbaren Fluorkohlenstoff-Ölphase erzeugen wir wässrige Tröpfchen in Öl mittels einer Strömungsfokussierdüse. Die wässrige Durchflussrate ist ausreichend hoch, um eine Ordnung der Partikel zu erzeugen, die die Düse mit ganzzahligen Vielfachen der Tröpfchengenerierungsfrequenz erreichen, wodurch eine kontrollierte Anzahl von Zellen in jedem Tröpfchen eingeschlossen wird. Als repräsentative Ergebnisse werden 9,9-μm-Polystyrol-Partikel als Zellmodelle verwendet. Diese Studie zeigt eine Einschließungseffizienz für einzelne Partikel Pk=1 von 83,7 % und eine Doppel-Partikel-Einschließungseffizienz Pk=2 von 79,5 % im Vergleich zu den jeweiligen Poisson-Effizienzen von 39,3 % bzw. 33,3 %. Die Bedeutung einer konstanten Zell- und Partikelkonzentration wird als entscheidend für eine effiziente Einschließung herausgestellt, und Übergänge vom Tropfen- zum Strahlmodus (dripping to jetting) werden ebenfalls behandelt.

Einleitung

Kontinuierliche wässrige Zellsuspensionen in Medium teilen sich eine gemeinsame Flüssigumgebung, die parallele Zellinteraktionen ermöglicht und zudem die Effekte einzelner Zellen in Messungen des Mediums homogenisiert. Die Hochdurchsatz-Einschließung von Zellen in Tropfen im Pikoliter-Maßstab begrenzt die Proben, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, ermöglicht die Erfassung zellulärer Diversität innerhalb der Proben, verhindert die Verdünnung von Reagenzien und exprimierten Biomarkern und verstärkt Signale aus Bioreaktor-Produkten. Die Tropfen erlauben außerdem, sie anschließend wieder zu größeren wässrigen Proben oder mit anderen Tropfen zusammenzuführen, um interzelluläre Signalübertragungsprozesse zu untersuchen.1,2 Die verminderte Verdünnung bedeutet stärkere Nachweissignale für genauere Messungen sowie die Möglichkeit, potenziell kostspielige Probenvolumina und Reagenzienmengen zu reduzieren.3 Die Einschließung von Zellen in Tropfen wurde bereits genutzt, um den Nachweis von Proteinausprägung,4 Antikörpern,5,6 Enzymen,7 und metabolischer Aktivität8 für Hochdurchsatz-Screenings zu verbessern, und könnte ebenfalls zur Verbesserung der Hochdurchsatz-Zytometrie eingesetzt werden.9 Weitere Studien zeigen Anwendungen im Bereich des Bio-Elektrosprayens von zellhaltigen Tropfen für die Massenspektrometrie10 und der gezielten Beschichtung von Oberflächen mit Zellen.11 Einige Anwendungen waren jedoch durch die fehlende Möglichkeit eingeschränkt, die Anzahl der in Tropfen eingeschlossenen Zellen gezielt zu steuern. Hier stellen wir eine Methode der geordneten Einschließung12 vor, die die nachgewiesenen Einschließungseffizienzen für eine und zwei Zellen erhöht und möglicherweise auf die Einschließung einer größeren Anzahl von Zellen übertragen werden kann.

Um eine monodisperse Tropfenbildung zu erreichen, ermöglicht die mikrofluidische „Flussfokussierung“ die Erzeugung von Tropfen kontrollierbarer Größe einer Flüssigkeit (einer wässrigen Zellmischung) in einer anderen (einer kontinuierlichen Ölphase) mithilfe einer Düse, an der sich die Ströme vereinigen.13 Bei einer gegebenen Düsengeometrie können die Tropfenbildungsrate f und die Tropfengröße durch Anpassung der Öl- und wässrigen Durchflussraten Qoil und Qaq verändert werden. Wenn die Durchflussraten steigen, kann der Übergang von der Tropfenbildung zur instabilen Ausbildung eines wässrigen Strahls (Jetting) an der Düse erfolgen.14

Wenn die wässrige Lösung suspendierte Partikel enthält, werden die Partikel an der Düse eingeschlossen und voneinander isoliert. Für die Tropfenbildung unter Verwendung einer zufällig verteilten wässrigen Zellsuspension beträgt der durchschnittliche Anteil an Tropfen Dk enthaltend k Zellen wird durch die Poisson-Statistik bestimmt, wobei Dk = λk exp(-λ)/(k!) und λ ist die durchschnittliche Anzahl von Zellen pro Tropfen. Der Bruchteil von Zellen die in den „korrekt“ verkapselten Tropfen enden, wird berechnet mithilfe von Pk = (k × Dk)/Σ(k' × Dk'). Der subtile Unterschied zwischen den beiden Metriken besteht darin, dass Dk bezieht sich auf die Nutzung von wässrigem Fluid und die Menge an Tropfen-Sortierung, die nach der Einschließung durchgeführt werden muss, und Pk bezieht sich auf die Nutzung der Zellprobe. Beispielsweise könnte man eine verdünnte Zellsuspension (niedriges λ) verwenden, um Tropfen zu kapseln, wobei die meisten Tropfen, die Zellen enthalten, jeweils nur eine einzige Zelle enthalten würden. Während die Effizienzmetrik Pk wäre hoch, der Großteil der Tropfen wäre leer (niedrig Dk), wodurch ein Sortiermechanismus zur Entfernung leerer Tropfen erforderlich ist, was ebenfalls die Durchsatzrate verringert.15

Die Kombination von Tropfenerzeugung mit trägheitsbedingter Ordnung ermöglicht die Einschließung von Tropfen mit vorhersagbarerer Anzahl an Zellen pro Tropfen und höheren Durchsätzen im Vergleich zur zufälligen Einschließung. Die trägeheitsbedingte Fokussierung wurde erstmals von Segre und Silberberg16 entdeckt und beschreibt die Tendenz von Partikeln endlicher Größe, sich in Strömungskanälen in laterale Gleichgewichtspositionen einzustellen. Trägeheitsordnung bezeichnet die Neigung von Partikeln und Zellen, sich passiv in gleichmäßig beabstandete, versetzte Züge mit konstanter Geschwindigkeit anzuordnen. Sowohl Fokussierung als auch Ordnung erfordern ausreichend hohe Strömungsgeschwindigkeiten (hohe Reynolds-Zahl) und Partikelgrößen (hohe Partikel-Reynolds-Zahl).17,18 Hier gilt: Reynolds-Zahl Re =uDh/ν und Partikel-Reynolds-Zahl Rep =Re(a/Dh)2, wobei u eine charakteristische Strömungsgeschwindigkeit, Dh [=2wh/(w+h)] der hydraulische Durchmesser, ν die kinematische Viskosität, a der Partikeldurchmesser, w die Kanalbreite und h die Kanalhöhe ist. Empirisch nimmt die Länge, die zur Erzeugung vollständig geordneter Züge erforderlich ist, mit steigendem Re und Rep ab. Beachten Sie, dass die hohen Anforderungen an Re und Rep (in dieser Studie in der Größenordnung von 5 bzw. 0,5) mit der Notwendigkeit kollidieren können, die wässrigen Durchflussraten niedrig zu halten, um ein Ausströmen in Form eines Strahls („jetting“) an der Tropfenerzeugungsdüse zu vermeiden. Zudem führen hohe Durchflussraten zu höheren Scherspannungen auf die Zellen, die in diesem Protokoll nicht berücksichtigt werden. In der vorherigen Studie zur geordneten Einschließung wurde gezeigt, dass über 90 % der einzeln eingeschlossenen HL60-Zellen unter ähnlichen Strömungsbedingungen wie in dieser Studie die Integrität ihrer Zellmembran beibehielten.12 Der Einfluss der Größenordnung und der zeitlichen Skalen der Scherspannungen muss jedoch sorgfältig bewertet werden, wenn die Ergebnisse auf andere Zelltypen und Strömungsparameter übertragen werden sollen. Die Überschneidung der Anforderungen an die Zellordnung, Tropfenerzeugung und die lebensfähige wässrige Durchflussrate ergibt einen idealen Betriebsbereich für die kontrollierte Einschließung einzelner und mehrerer Zellen.

Da nur sehr wenige Studien den Abstand zwischen Partikelzügen untersuchen,19,20 lässt sich dieser am einfachsten empirisch bestimmen, wobei er von der Kanalgeometrie, der Durchflussrate, der Partikelgröße und der Partikelkonzentration abhängt. Dennoch bedeutet der gleichmäßige seitliche Abstand zwischen den Zügen, dass die Zellen in vorhersagbaren, konstanten Zeitabständen eintreffen. Wenn die Tropfenbildung mit derselben Rate erfolgt, mit der geordnete Zellen an der Düse eintreffen, werden die Zellen kontrolliert in die Tropfen eingeschlossen. Diese Technik wurde bereits verwendet, um Einzelzellen mit Durchsätzen im Bereich von 15 kHz einzuschließen,12 eine deutliche Verbesserung gegenüber früheren Studien, die Einschlussraten im Bereich von 60–160 Hz berichteten.4,15 Bei der kontrollierten Einschließung enthielten über 80 % der Tropfen genau eine einzige Zelle, was eine erhebliche Effizienzsteigerung gegenüber der Poisson- (zufälligen) Statistik darstellt, die im Durchschnitt eine Effizienz von weniger als 40 % vorhersagt.12

In früheren Arbeiten zur kontrollierten Verkapselung12 wurde die durchschnittliche Anzahl an Partikeln pro Tropfen λ so eingestellt, dass die Einzelzell-Verkapselung erreicht wurde. Wir vermuten, dass durch die gezielte Anpassung der Strömungsgeschwindigkeiten eine effiziente Verkapselung beliebiger Zellzahlen pro Tropfen erreicht werden kann, wenn λ gleich oder nahe der gewünschten Anzahl an Zellen pro Tropfen ist. Während die Einzelzell-Verkapselung wertvolle Informationen über individuelle Zellreaktionen auf Reize liefert, ermöglicht die Mehrfachzell-Verkapselung Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen definierten Zellzahlen und Zelltypen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von Polystyrol-Mikrokugeln sowie eine Diskussion zur kontrollierten Verkapselung mehrerer Zellen mittels eines passiven, trägheitsbasierten Ordnungskanals und einer Tropfen erzeugenden Düse.

Protokoll

Die Protokolle in diesem Abschnitt beschreiben die Materialien und Ausrüstungen, die speziell auf die experimentellen Ergebnisse präsentiert bekommen genutzt. Beachten Sie, dass andere Anbieter für Chemikalien und Ausrüstung verwendet werden kann.

1. Bauelementherstellung und Softlithographie

Standard-Soft-Lithographie-Techniken, 21 von denen einige in früheren JOVE Artikel wurden oft vorgestellten wurden 22 für die Erstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrokanal Netzwerke gebunden an Glassubstraten verwendet. Abgesehen von Masterreproduktion Formenbau von SU-8 Photolithographie können die Prozesse außerhalb von einem Reinraum oder sauberen Abzug durchgeführt werden, jedoch Staub und Partikel sollten noch minimiert werden, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.

  1. Entwerfen Sie ein Mikro-Kanal-Muster wie in Abbildung 1 in AutoCAD (Autodesk Inc.) gezeigt. Von einem Dritten Herstellers (Fineline Imaging Inc.), um eine hohe Auflösung (50.000 dpi) trans druckenTransparenz-Maske auf Mylar-Folie oder Quarz, wo Kanäle sind transparent auf einem dunklen Hintergrund.
  2. Erstellen Sie eine Silizium-und SU-8 Fotolack-Master für Replik Guß. Kurz gesagt, spinnen SU-8-2050 (MicroChem) negativer Photoresist mit vom Hersteller empfohlenen rpm auf einem Spin-Coater, eine 52 um dicke Schicht auf ein sauberes 7,5 cm oder 10 cm Silizium-Wafer zu erzeugen. Nach Weichbacken, Randentlackung, UV-Belichtung durch eine Maske Kontakt, Post-Exposure Bake, Entwicklung und Flutbelichtung, messen die tatsächliche Dicke des SU-8-Schicht mit Hilfe eines Dektak Profilometer (Veeco). Band der Master-Form auf den Boden eines 4 "oder 5" Petrischale für PDMS Replikat Formen herzustellen.
  3. Mix PDMS-Elastomer-Basis mit Elastomer Härtungsmittel (Dow Corning) in einem Verhältnis von 10:1 w / w Basis zu Härter. Gießen Sie gut gemischten PDMS-Vorläufer auf den Silizium-Master eine 2-3 mm endgültige Dicke Schicht schaffen. Eine Mischung aus 20 g Elastomer-Basis mit 2 g Härtungsmittel ausreichend ist, um ein 4 "Durchmesser bedecken.
  4. Legen Sie die Master Schimmel und PDMS im Vakuumexsikkator (Jencons) zu de-Gas nicht ausgehärteten PDMS. Verwendung eines Druckreglers (Cole Parmer), langsam abnehmen die Kammer Überdruck von 0 "Hg bis -27" Hg innerhalb von 20 Minuten, um ein übermäßiges Schäumen zu vermeiden. Lassen Vorrichtung in der Vakuumkammer bei -27 "Hg für 30 Minuten oder bis Luftblasen verschwinden.
  5. Lassen Vakuum bewegen und Master-Form und PDMS zu einem 65 ° C Ofen (Thermo Scientific) bei einem Mindestaufenthalt von vier Stunden. Die Vorrichtung kann in den Ofen über Nacht Härten zu verbessern gelassen werden.
  6. Entfernen Sie das Gerät aus dem Ofen nehmen und abkühlen lassen. Schneiden Sie vorsichtig PDMS um kreisförmige Scheibe mit einer Präzisions-Messer schälen und aus PDMS. Ausschneiden Vorrichtung Form wie in 1 gezeigt, mit einem Skalpell.
  7. Stanz fluidische Anschlüsse (drei pro Gerät) in den drei Regionen jähriger in 1 gezeigt unter Verwendung eines Biopsiestanze. Für dieses Gerät mit einem 0,75 mm Außendurchmesser Stempel (Harris).
  8. Beachten Tesafilm auf das strukturierte Seite des PDMS und einem Peeling entfernenStaub. Als kostengünstige, aber lebensfähige Alternative zu herkömmlichen Sauerstoff-Plasma-Geräte, Plasma-Behandlung 21,22 mit der strukturierten Seite des PDMS und einem sauberen 3 "x 1" Glas-Objektträger mit einem Handheld-Labor Corona Anlage (Electro-Technic Products Inc .). 23. Hinweis, dass dieses Gerät in einem Abzug oder gut belüfteten Raum durch Ozon Entladung verwendet werden sollte, und alle Uhren und Handys sollte mindestens drei Meter entfernt gehalten werden. Passen Sie die Corona-Entladung, um eine stabile Korona mit minimaler Funkenbildung zu erreichen. Langsam schwenken die Elektrode etwa 1/4 "über jeder Fläche für etwa 20 Sekunden und dann sofort bringen die behandelten Oberflächen in Kontakt, um eine starke dauerhafte Verbindung bilden, bevor die PDMS-Oberflächen in ihre Heimat zurückzukehren.
  9. Stellen Sie das Gerät auf einer Metallplatte, in einem kalten Ofen, stellen Sie den Backofen auf 120 ° C und über Nacht backen, um die Bindung zu vervollständigen und die PDMS zu seiner ursprünglichen hydrophoben Zustand. Zurück 24 Während dieser hohen Temperatur backen, ter Glasoberfläche des Kanals auch hydrophob aufgrund der Ablagerung von einer dünnen hydrophoben Schicht auf dem Glas werden. Alternativ kann hydrophoben Beschichtungen, wie Aquapel (PPG Industries) in die fluidischen Anschlüsse unter Verwendung einer 1 ml Spritze und einer Nadel Spritze injiziert werden. 12 sorgfältig aber fest injizieren Aquapel von Spülluft in die fluidischen Anschlüsse ohne die PDMS auf Glas-Bindung gefolgt . Aggressiv wiederholen Sie die Entlüftung auf allen Einlass-und Auslasskanäle, während Wischen Sie überschüssiges Aquapel, um eventuelle Ablagerungen, die die Kanäle verstopfen können nach dem Trocknen zu vermeiden.

2. Probenvorbereitung

  1. Bereiten Sie eine Zellkultur nach festgelegten Verfahren für Ihr ausgewähltes Zelltyp. Für das spezielle Gerät in dieser Studie verwendet wird, sollte 8-15 um Teilchen oder Zellen adäquat für die Verkapselung zu bestellen. Kleinere oder größere Zelltypen, die Änderung der Abmessungen der Fokussierung Kanal, um eine angemessene Re p erreichen. Für die mirThSB Demonstration Ergebnisse in dieser Arbeit gezeigt, werden um 9,9 Polystyrol-Mikrosphären (G1000, Thermo Scientific) als Surrogate Zelle genutzt.
  2. Bereiten Sie die wässrige Partikel-oder Zellsuspension durch vorsichtiges Mischen. Bei der Verwendung von Zellen oder Polystyrol-Teilchen, ist die Kontrolle, Konzentration (siehe Abbildung 4), um ideale bestellt Kapselung zu erzielen. Mit bisherigen Daten 12 als Leitfaden, berechnen Sie die gewünschte Zelle oder Partikelkonzentration von der bestellten Zug Abstand und Mikro-Kanal-Größe basiert wie: eine Zelle oder ein Teilchen pro erwarteten Längs-Zug mal Abstand die Fokussierung Kanal Querschnittsfläche. Wenn die Stoffkonzentration (1% w / w) nicht ausreichend ist, Erhöhung der Konzentration (hier 1,5% w / w) durch leichtes Zentrifugieren der Probe Lager, überstehende Flüssigkeit entfernt, und Resuspendieren der Teilchen durch Vortex-Mischen, Mischen oder sanfteren bei der Verwendung von Zellen. Vorbereitung eines angemessenen Volumens zu berücksichtigen gewünschte Sammelvolumen und für Laufzeit mit fl verbundenow-Tuning.
  3. Beide Zellen und Polystyrol-Partikel ein spezifisches Gewicht größer als eins. Obwohl es in diesem Protokoll gezeigt, für Langzeit-Experimenten Dauer in der Größenordnung von mehreren Minuten bis zu Stunden, einverstanden Auftrieb die Lösung durch Zugabe eines gelösten Stoffes wie CaCl 2 für Partikel oder Optiprep (Sigma-Aldrich) für Zellen.
  4. Eine 10 ml Probe des kontinuierlichen Fluorkohlenstoffphase Ölphase durch Mischen des Fluorkohlenstofföl FC-40 (3M) und PFPE-PEG-Block-Copolymer-Tensid 25 (2,5% w / w) (RainDance Technologies) in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Alternativ kann leichtes Mineralöl (PTI Verfahren Chemicals) mit ABIL-EM 90 Tensid (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation) verwendet werden.

3. Experimenteller Aufbau

  1. Schalten Sie den invertierten optischen Mikroskop (Axio Observer, Zeiss) und High-Speed-Kamera (Phantom V310, Vision Research). Konzentrieren Sie und prüfen Sie die Kanäle für Clogs und Schutt durch entweder manuell das Gerät bewegen odermit einem motorisierten Mikroskop Bühne. Einige kleine Trümmer heraus geschoben werden kann, wenn Flüssigkeit durchströmt. Für große Trümmer oder offensichtliche Clogs, wählen Sie einen anderen Kanal auf dem Gerät als Fremdkörper in der Fokussierung Kanal kann degradieren Bestellung Qualität erheblich. Beachten Sie, dass Clogs können oft unter Strom, indem Sie fest auf dem PDMS-Oberfläche über der betroffenen Region mit stumpfen Pinzette entfernt werden.
  2. Schneiden drei Längen von PVC-Schläuchen (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) für die wässrige Einlaß, Öleinlass und Auslaß Emulsion. Um Totvolumen zu minimieren, gerade genug, um Schläuche von den Spritzenpumpen auf dem Mikroskoptisch erreichen geschnitten. Schneiden Sie Rohrenden in einem 45 ° Winkel zum Einsetzen in fluidischen Anschlüsse zu erleichtern.
  3. Sie mit einer Pinzette drücken passen die Rohrenden in die fluidischen Anschlüsse in Schritt 1 gestanzt und drücken Sie dann passen zwei 30-Gauge-Blunt-Spitze aus Edelstahl Kanülen (Kleinteile) in die freien Enden der jeweiligen wässrigen und öligen Einlaßrohren (kein Klebstoff erforderlich) . Setzen Sie den Ablaufschlauch in einen Abfallbehälter reservoir. Dieser Schlauch wird später in einen Sammelbehälter bewegt werden.
  4. Bewegen Sie das Gerät und die angeschlossenen Schlauch mit dem Mikroskoptisch, ausrichten und konzentrieren sich auf die Düse mit einem Gerät zur Verfügung Objektiv (20x wurde für dieses Experiment verwendet wird). Passen Sie für K hler Beleuchtung und andere Einstellungen als Mikroskop für eine optimale Aufnahme erforderlich.
  5. In eine 1 ml-Spritze (BD) mit der gut gemischten wässrigen Phase und einer 3 ml Spritze (BD) mit der Ölphase Lösung in Schritt 2 hergestellt. Beachten Sie, dass alle Spritzen nach einem der Volumen verwendet werden können, sollten sorgfältig ausgewählt werden je nach den gewünschten Laufzeiten und Minimierung jeglicher Pulsatilität. Neigen Sie eine Spritze vertikal und Flick, um Luftblasen an die Spritzenauslaßstück bewegen. Drücken Sie langsam genug, um die Kolben Luft zu der Kanüle zu schieben. Halten der Spritze vertikal, verbinden die Spritzen mit der entsprechenden Spritze Nadel bereits auf das Gerät in Schritt 3.3 befestigt. Drücken Kolben, um die Luft durch die Spritzennadel Totvolumen zwingen, bis die Flüssigkeit pushed durch den Schlauch fast an das Gerät. Befestigen Sie die Spritze zu einer Spritzenpumpe (Nexus 3000, Chemyx) und den Kolben in Eingriff Block. Wiederholen Sie die Anschlüsse für die zweite Spritze und montieren Sie an einen zweiten Spritzenpumpe.
  6. Leistung auf jeder Spritzenpumpe und Programm unter Verwendung der Pumpe Herstellers Protokolle. Stellen Sie die ersten Flussraten bis Q = Öl 50 &mgr; l / min und Q AQ = 5 &mgr; l / min für die Öl-Phase und der wässrigen Phase, beziehungsweise. Starten Sie die Pumpen.
  7. Warten Sie für jede Flüssigkeit in das Gerät eindringen und füllen Sie die Kanäle, Ausschieben verbleibende tote Luft. Dies kann einige Minuten dauern. Wenn es eine große Menge an Luft in dem Einlassschlauch, vorübergehend zu erhöhen, jedes Strömungsrate, bis die Luft ausgestoßen wird. Erhöhen Sie nicht die Durchflussmengen so hoch, dass große Belastungen treten in den Kanal, was möglicherweise zu PDMS-Glas-Bindung Misserfolg.
  8. Mit den ersten Flussraten, beobachten die Bildung von Tropfen an der Düse (hier gezeigten Ergebnisse: 20x magnification, 21005 fps Bildrate, Belichtung 3 us). Reduzieren Sie die Kamera Sichtfeld nur die Düse, um die Frame-Rate zu maximieren und die Speicheranforderungen, wenn möglich. Nehmen Sie Videos und Probe bestätigen, dass die Abtastrate ausreichend, um Aliasing zu vermeiden ist.
  9. Zur Vermeidung von Strahlen (siehe Abbildung 2), mit niedrigen Flussraten wässrigen starten. Langsam erhöhen wäßrigen Strömungsrate zu beobachten Reihenfolge der Partikel in der wässrigen Lösung langen Kanal, wenn die Strömungsrate zunimmt.
  10. Ist die Partikelkonzentration ist zu niedrig, um Züge mit relativ wenigen "fehlenden" Partikel und die Probe wurde nicht abgestimmt Auftrieb geben, körperlich kippen Sie die Spritzenpumpe in Richtung der Spritzenauslaßstück zu bieten allmählichen Absetzen der Teilchen in Richtung der Spritze Steckdose. Dieses Verfahren ist in dem Video-Protokoll gezeigt. In regelmäßigen Abständen Drehen der Spritze entlang ihrer Achse kann auch reduzieren unerwünschte Besiedlung.
  11. Sobald eine angemessene Ordnung auftritt, stellen Sie die Ölmenge, die Generierung Frequenz abzustimmen undGröße der Tropfen. Die mittlere Tropfenvolumen kann mit Hilfe der wässrigen Durchfluss durch den Rückgang Generation Frequenz wie von Video-Capture gemessen aufgeteilt werden. Iterativ anpassen beide Volumenströme zu wünschen Kapselung Preise und Tropfenvolumen zu erreichen.
  12. Sobald stabile bestellt Kapselung bestätigt wird, bewegen Sie den Ablaufschlauch aus dem Abfall Reservoir in einen Sammelbehälter oder speisen ihn in ein anderes Gerät für die anschließende Prüfung.
  13. Bestimmen Sie die Sammlung auf Zeit gewünschte Anzahl von Tröpfchen und der berechneten Frequenz-Generation basiert.
  14. Datensatz der Anteil von Tropfen, die 0, 1, 2, ..., N Teilchen, um die Effizienz Quantifizierung unter Verwendung von entweder Tropfenerzeugung Video Ergebnisse oder durch Pipettieren einer Probe der gesammelten Emulsion zur Inspektion.

4. Repräsentative Ergebnisse

Die Ergebnisse werden präsentiert, die sowohl zu erreichen kontrollierte Ein-Teilchen und kontrollierten Doppelblind-Teilchen-Verkapselung (Abbildung 3). Durch das Schneidendie FC-40 Ölmenge in der Hälfte, wird Einteilchen-Verkapselung Zwei-Teilchen-Kapselung. Umgekehrt könnte man die wässrige Durchfluss, um Partikel zu der Düse schneller liefern erhöht haben, aber wir würden auch das Risiko von Strahlen von dem wässrigen Strom erhöht haben. Histogramme in Abbildung 3 präsentieren die gebrochene Zahl der Teilchen pro Tropfen für die beiden Fälle zusammen mit Vergleiche mit Poisson-Statistik. Die gelegentlichen Tropfen mit Null Teilchen sind in erster Linie die "fehlenden" Teilchen in den bestellten Züge, während die Fälle, in denen es mehr als gewünscht eingekapselten Teilchen Folge lokal hohen Partikelkonzentrationen und Partikel, die manchmal zu einem der zwei vertikalen Fokuspositionen zu migrieren. Beachten Sie, dass Auftrieb passend wie in Abschnitt 2 beschrieben wurde nicht genutzt. Stattdessen wurde die Spritzenpumpe physikalisch gekippt, damit Absetzen der Partikel in Richtung der Spritze Auslaß, was zu einer hohen Konzentration von Partikeln während des Laufs.

Ein experimenteller Sicht, welche die Notwendigkeit einer angemessenen Partikel-und Zell-Konzentrationen ist in Abbildung 4 dargestellt. Ohne vollständige Bestellung, werden lokalisierte Gruppen von Teilchen Ordnung und gekapselt, aber viele Tropfen sind ohne Partikel. Ein Histogramm zeigt die verminderte Verkapselungseffizienz für die gewünschte Partikelgröße zwei Kapselung.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Encapsulation Gerät. a) Gesamt-Gerät mit Buchten, Steckdose und lange Bestellweg. Das Gerät beträgt 52 um und die Bestellung von Kanalbreite beträgt 27 um. b) Sowohl wässrigen und öligen Einlässe große Trümmer Filter mit Lücken in der Größenordnung von der Bestellung Kanalbreite für die vergrößerte Ansicht des Öleinlasses. c) Die vergrößerte Ansicht zeigt Düse gleich Kanalweiten 27 um den wässrigen und öligen Kanälen, durch die Kontraktion der Düse 22 um und plötzliche Ausdehnung einer breiteren Kanal 61 um folgt.Beachten Sie, dass die Abmessungen der hier gezeigten Vorrichtung überprüft wurden mit einem Profilometer nach Mikrofabrikation und unterscheiden sich geringfügig von den Nennweiten auf der Maske. Ein wahres Bild des Bestellers Kanal und Düse sind online verfügbar als Supplemental Abbildung 1 . Die AutoCAD-Datei Maske wurde ebenfalls eingeschlossen Online als Ergänzung zu diesem Manuskript.

figure-protocol-2
Abbildung 2. Hysterese eines tropfenden zu Jetting Übergang mit einem größeren Gerät (80 x 22 um breit um hoch). a) Bei konstanten FC-40 Durchfluss (Q Öl = 45 ul / min), tritt stetigen Tropfenbildung bei 10 kHz mit einer wässrigen Volumenstrom Q AQ = 8 ul / min. Als die wässrige Strömungsrate wird langsam auf 10 m erhöht undu, L / min, Ausstoßen der wässrigen Fluidstrom ausgelöst wird. b) Wenn die Durchflussrate ist auf 8 ul / min Jetting weiter zurück. Beachten Sie, dass stetige Tropfenbildung kann durch kurzes Anhalten der wässrigen Strömungspumpe (a 1 Sekunde Pause ist typisch) wieder hergestellt werden.

figure-protocol-3
Abbildung 3. Einzel-und Doppel-Teilchen-Kapselung. A) Tropfenbildung mit einer Zelle pro Tropfen (Öl Q = 60 ul / min, Q aq = 9 ul / min) mit einem Tropfen Generation von 6,1 kHz, mittlere Tropfengröße von 24,4 pL, und ein Single-Cell-Abscheidung Wirkungsgrade D k = 79,5% und P k = 83,7% (λ = 0,95) für eine Stichprobengröße von n d = 517 Tropfen und n p = 491 Teilchen. b) Drop-Formation mit zwei Zellen pro Tropfen wird einfach durch eine Verringerung der FC-40 Öl-Fördermenge Q bis 30 μ erreichtL / min. Die größere (39,8 pL) Tropfen werden mit einer Rate von 3,8 kHz mit einer Zwei-Zell-Capture-Effizienz ausgebildet D k = 71,5% und P k = 79,5% (λ = 1,80) für eine Probe von n d = 383 und n Tropfen p = 689 Teilchen. cd) Zwei Histogramme vergleichen Sie die Drop-Kapselung Partikel Wirkungsgrade D k der bestellten Single-und Double-Teilchen-Verkapselung mit Poisson-Statistik (random Kapselung). Beachten Sie, dass in beiden Fällen, Partikel Abstand in Strömungsrichtung um etwa 17-18 für vollständig geordneten abwechselnd Teilchen ist. Zusätzliche Videos zeigen sowohl Single-und Double-Teilchen-Kapselung sind online verfügbar. Klicken Sie hier um Supplemental Film 3a anzuzeigen . Klicken Sie hier um Supplemental Film 3b sehen .

figure-protocol-4
Abbildung 4. Konzentration stark beeinflusst Verkapselungseffizienz. A) Als die Konzentration nimmt ab, voller Ordnung findet nicht statt, und damit "Löcher" in den Zügen entstehen, so dass einige Tropfen mit weniger als erwarteten Partikel. B) Das Histogramm zeigt die verringerte Effizienz ( D k = 55,9%, P k = 70,9%) für Zwei-Teilchen durch Einkapselung auf einen niedrigeren Wert von λ = 1,57, wo es annähernd so viele Einzelpartikel-abfällt, da Doppel-Teilchen Tropfen. Dieser Angabe liegt Q Öl = 30 ul / min und Q AQ = 9 ul / min, die gleichen Bedingungen wie für die Flow Abbildung 3b. Ein Vertreter ergänzende Video ist online verfügbar. Klicken Sie hier um Supplemental Movie 4 sehen .

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Trotz der relativ hohen Grad der Bestellung werden nicht alle Tropfen enthalten die richtige Anzahl von Partikeln oder Zellen. Verkapselungseffizienz kann als die Anzahl von Zellen oder Partikeln, die in Tropfen mit der gewünschten Belegung durch die Gesamtzahl unterteilt eingekapselt geworden berechnet werden. Diese Rohdaten können entweder von einem automatisierten High-Speed-Video-Algorithmus oder aus einer Stichprobe von Imaging gesammelt Emulsion erhalten werden. Dies kann zu der Fraktion von Teilchen P k<...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

JE ist ein Erfinder auf einen anhängigen Patent auf die Technologie in diesem Manuskript verwendet basiert.

Danksagungen

Wir danken RainDance Technologies für die Probe von PFPE-PEG-Tensid in dieser Studie verwendeten, und wir danken den BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, Regisseur) für die Silizium-Wafer verwendet werden, um Schimmel PDMS-Kanal Repliken zu erstellen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
AutoCAD AutoDesk
Transparenz-Maske Fineline Imaging Inc.
SU-8 Fotolack MicroChem 2050
Dektak Profilometer Veeco
Petrischale BD Falcon 351058
PDMS-Silikon-Elastomer-Kit Dow Corning Corp Sylgard 184, Werkstoff-Nummer (240) 4019862
Vakuumexsikkator Jencons 250-030
Vakuumpumpe Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vakuumregler Cole-Parmer EW-00910-10
Backofen Thermo Scientific Lindberg Blue M, OV800F
Biopsiestanze, 0,75 mm Harris Uni-Core-15072
Labor Corona Anlage Electro-Technic Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Glas-Folien Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternative Strategie
Polystyrol-Mikrokügelchen, um 9,9 Thermo G1000
Optiprep Sigma-Aldrich D1556 Nicht nachgewiesen
Luer-Lok Spritzen BD 1 ml: 309628
3 ml: 309585
FC-40 Fluorkohlenstofföl 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluortensid RainDance Technologies
Leichtes Mineralöl PTI Process Chemicals 08042-47-5 Alternative Strategie
Mineral-Öl-Tensid Evonik Goldschmidt GmbH Abil EM 90 Alternative Strategie
Tygon Schlauch aus PVC Kleinteile TGY-010
30-Gauge-Luer-Lok Spritzennadel, 1/2 " Kleinteile NE-301PL-C
Inverses Mikroskop Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed ​​Kamera Vision Research Phantom V310
Spritzenpumpen (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Silikonöl Dow Corning 200 Fluid, 10 cSt Optional für Storage-Emulsion

Referenzen

  1. Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. , 1218-1220 (2007).
  5. Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001(2010).
  12. Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364(2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
  15. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
  19. Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703(2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413(2010).
  21. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319(2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. , 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).
  29. Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Mikrofluidische VerkapselungFlow-Focusing-DüseTrägheitsordnungEinzelzellverkapselungDoppelzellverkapselungPartikel-SurrogateTropfenerzeugungsratewässrige FlussrateÖlflussratekontrollierte Verkapselung
High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.