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Mikrofluidische Verkapselungsmethoden wurden zuvor verwendet, um Zellen in wässrigen, monodispersen Tropfen im Pikolitermaßstab einzufangen und so den Einschluss von einer Bulk-Fluid-Umgebung mit Anwendungen im Hochdurchsatz-Screening, in der Zytometrie und Massenspektrometrie zu ermöglichen. Wir beschreiben eine Methode, um nicht nur einzelne Zellen zu verkapseln, sondern wiederholt eine bestimmte Anzahl von Zellen zu erfassen (hier demonstrieren wir die Ein- und Zweizellverkapselung), um sowohl die Isolierung als auch die Wechselwirkungen zwischen Zellen in Gruppen kontrollierter Größe zu untersuchen. Durch die Kombination von Tropfenerzeugungstechniken mit Zell- und Partikelordnung demonstrieren wir die kontrollierte Verkapselung von zellgroßen Partikeln für eine effiziente, kontinuierliche Verkapselung. Unter Verwendung einer wässrigen Partikelsuspension und nicht mischbarem Fluorkohlenwasserstofföl erzeugen wir mit einer Strömungsfokussierungsdüse wässrige Tropfen im Öl. Die wässrige Durchflussrate ist ausreichend hoch, um eine Ordnung der Partikel zu erzeugen, die die Düse mit ganzzahligen Mehrfachfrequenzen der Tropfenerzeugungsfrequenz erreichen, wobei eine kontrollierte Anzahl von Zellen in jedem Tropfen eingeschlossen wird. Für repräsentative Ergebnisse werden 9,9 μm Polystyrolpartikel als Zellsurrogate verwendet. Diese Studie zeigt einen Einzelpartikel-Verkapselungswirkungsgrad Pk=1 von 83,7 % und einen Doppelpartikel-Verkapselungsgrad Pk=2 von 79,5 % im Vergleich zu ihren jeweiligen Poisson-Wirkungsgraden von 39,3 % bzw. 33,3 %. Es wurde gezeigt, dass der Effekt einer konsistenten Zell- und Partikelkonzentration für eine effiziente Verkapselung von großer Bedeutung ist, und auch die Übergänge vom Tropfen zum Strahlen werden berücksichtigt.
Einführung
Kontinuierliche Medien wässrige Zellsuspensionen haben eine gemeinsame flüssige Umgebung, die es den Zellen ermöglicht, parallel zu interagieren und auch die Effekte bestimmter Zellen bei Messungen aus dem Medium homogenisiert. Die Hochdurchsatz-Verkapselung von Zellen in Tropfen im Pikoliter-Maßstab schließt die Proben ein, um die Tropfen vor Kreuzkontamination zu schützen, ein Maß für die zelluläre Vielfalt innerhalb der Proben zu ermöglichen, die Verdünnung von Reagenzien und exprimierten Biomarkern zu verhindern und Signale von Bioreaktorprodukten zu verstärken. Tropfen bieten auch die Möglichkeit, Tropfen in größeren wässrigen Proben oder mit anderen Tropfen für interzelluläre Signalstudien wieder zusammenzuführen. 1,2 Die Verringerung der Verdünnung impliziert stärkere Detektionssignale für Messungen mit höherer Genauigkeit sowie die Möglichkeit, potenziell kostspielige Proben- und Reagenzienvolumina zu reduzieren. 3 Die Verkapselung von Zellen in Tropfen wurde verwendet, um den Nachweis der Proteinexpression4, der Antikörper, 5,6 Enzyme7 und der Stoffwechselaktivität8 für das Hochdurchsatz-Screening zu verbessern, und könnte zur Verbesserung der Hochdurchsatz-Zytometrie verwendet werden. 9 Weitere Studien stellen Anwendungen im Bio-Elektrospraying von zellhaltigen Tropfen für die Massenspektrometrie10 und gezielte Oberflächenzellbeschichtungen vor. 11 Einige Anwendungen wurden jedoch durch die mangelnde Fähigkeit eingeschränkt, die Anzahl der in Tropfen eingekapselten Zellen zu kontrollieren. Hier stellen wir ein Verfahren der geordneten Verkapselung12 vor, das die demonstrierten Verkapselungseffizienzen für eine und zwei Zellen erhöht und für die Verkapselung einer größeren Anzahl von Zellen extrapoliert werden kann.
Um eine monodisperse Tropfenerzeugung zu erreichen, ermöglicht die mikrofluidische "Strömungsfokussierung" die Erzeugung von Tropfen in kontrollierbarer Größe einer Flüssigkeit (einer wässrigen Zellmischung) in einer anderen (einer kontinuierlichen Ölphase) durch die Verwendung einer Düse, an der die Ströme zusammenlaufen. 13 Für eine gegebene Düsengeometrie können die Tropfenerzeugungsfrequenz f und die Tropfengröße durch Einstellen der Öl- und wässrigen Durchflussraten Qoil und Qaq geändert werden. Mit zunehmender Durchflussrate können die Strömungen von der Tropfenerzeugung zum instabilen Strahlen von wässriger Flüssigkeit aus der Düse übergehen. 14
Wenn die wässrige Lösung Schwebstoffe enthält, werden die Partikel an der Düse eingekapselt und voneinander isoliert. Für die Tropfenerzeugung mit einer zufällig verteilten wässrigen Zellsuspension wird der durchschnittliche Anteil der Tropfen Dk, die k Zellen enthalten, durch die Poisson-Statistik diktiert, wobei Dk = λk exp(-λ)/(k!) und λ die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Tropfen ist. Der Anteil der Zellen, die in den "korrekt" verkapselten Tropfen landen, wird mit Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk') berechnet. Der feine Unterschied zwischen den beiden Metriken besteht darin, dass sich Dk auf die Verwertung der wässrigen Flüssigkeit und die Menge der Tropfensortierung bezieht, die nach der Verkapselung abgeschlossen werden muss, und Pk sich auf die Verwertung der Zellprobe bezieht. Als Beispiel könnte man eine verdünnte Zellsuspension (niedriges λ) verwenden, um Tropfen zu verkapseln, wobei die meisten Tropfen, die Zellen enthalten, nur eine Zelle enthalten würden. Während die Effizienzmetrik Pk hoch wäre, wäre die Mehrheit der Tropfen leer (niedrig Dk), so dass ein Sortiermechanismus erforderlich wäre, um leere Tropfen zu entfernen, was auch den Durchsatz verringert. Nr. 15
Die Kombination von Tropfengenerierung und Inertialordnung bietet die Möglichkeit, Tropfen mit einer vorhersagbareren Anzahl von Zellen pro Tropfen und höheren Durchsätzen als bei zufälliger Kapselung zu kapseln. Die Trägheitsfokussierung wurde erstmals von Segre und Silberberg16 entdeckt und bezieht sich auf die Tendenz endlicher Teilchen, in der Kanalströmung in laterale Gleichgewichtspositionen zu wandern. Die Trägheitsordnung bezieht sich auf die Tendenz der Teilchen und Zellen, sich passiv in gleichmäßig verteilten, gestaffelten Zügen mit konstanter Geschwindigkeit zu organisieren. Sowohl die Fokussierung als auch die Anordnung erfordern ausreichend hohe Durchflussraten (hohe Reynoldszahl) und Partikelgrößen (hohe Partikel-Reynolds-Zahl). 17,18 Hier ist die Reynoldszahl Re =uDh/ν und die Teilchen-Reynoldszahl Rep =Re(a/Dh)2, wobei u eine charakteristische Strömungsgeschwindigkeit ist, Dh [=2wh/(w+h)] der hydraulische Durchmesser, ν die kinematische Viskosität, a der Teilchendurchmesser, w die Kanalbreite und h die Kanalhöhe ist. Empirisch gesehen nimmt die Länge, die erforderlich ist, um vollständig geordnete Züge zu erreichen, mit zunehmendem Re und Rep ab. Es ist zu beachten, dass die hohen Anforderungen an Re und Rep (für diese Studie in der Größenordnung von 5 bzw. 0,5) mit der Notwendigkeit in Konflikt geraten können, die wässrigen Durchflussraten niedrig zu halten, um ein Strahlen an der Tropfenerzeugungsdüse zu vermeiden. Darüber hinaus führen hohe Flussraten zu höheren Scherspannungen an den Zellen, die in diesem Protokoll nicht behandelt werden. Die vorangegangene Studie zur geordneten Verkapselung zeigte, dass über 90 % der einfach verkapselten HL60-Zellen unter ähnlichen Strömungsbedingungen wie in dieser Studie die Integrität der Zellmembran beibehielten. 12 Der Einfluss der Größenordnung und der Zeitskalen von Scherspannungen muss jedoch bei der Extrapolation auf verschiedene Zelltypen und Strömungsparameter sorgfältig berücksichtigt werden. Die Überlappung der Einschränkungen der Zellreihenfolge, der Tropfenerzeugung und der Zellviabilität bei der wässrigen Flussrate bietet ein ideales Betriebsregime für die kontrollierte Verkapselung von Einzel- und Mehrfachzellen.
Da sich nur sehr wenige Studien mit dem Zugabstand zwischen den Partikeln befassen,19,20 ist die Bestimmung des Abstands empirisch am einfachsten durchzuführen und hängt von der Kanalgeometrie, der Durchflussrate, der Partikelgröße und der Partikelkonzentration ab. Nichtsdestotrotz impliziert der gleiche laterale Abstand zwischen den Zügen, dass die Zellen in vorhersehbaren, konsistenten Zeitintervallen ankommen. Wenn die Tropfenerzeugung mit der gleichen Geschwindigkeit erfolgt, mit der geordnete Zellen an der Düse ankommen, werden die Zellen auf kontrollierte Weise im Tropfen eingekapselt. Diese Technik wurde verwendet, um einzelne Zellen mit Durchsätzen in der Größenordnung von 15 kHz zu verkapseln,12 eine signifikante Verbesserung gegenüber früheren Studien, die über Verkapselungsraten in der Größenordnung von 60-160 Hz berichteten.4,15 Bei der kontrollierten Verkapselung enthielten über 80 % der Tropfen eine und nur eine Zelle, eine signifikante Effizienzverbesserung gegenüber der Poisson-Statistik (Zufallsstatistik). was einen Wirkungsgrad von durchschnittlich weniger als 40 % vorhersagt. 12
In früheren kontrollierten Verkapselungsarbeiten12 wurde die durchschnittliche Anzahl von Partikeln pro Tropfen λ abgestimmt, um eine Einzelzellverkapselung zu ermöglichen. Wir stellen die Hypothese auf, dass wir durch die Abstimmung der Flussraten eine beliebige Anzahl von Zellen pro Tropfen effizient einkapseln können, wenn λ gleich oder nahe der gewünschten Anzahl von Zellen pro Tropfen ist. Während die Einzelzellverkapselung wertvoll ist, um die Reaktionen einzelner Zellen auf Reize zu bestimmen, liefert die Mehrzellverkapselung Informationen über das Zusammenspiel von kontrollierter Anzahl und Art von Zellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, repräsentative Ergebnisse mit Polystyrol-Mikrosphären und eine Diskussion über die kontrollierte Verkapselung mehrerer Zellen unter Verwendung eines passiven Inertialordnungskanals und einer Tropfenerzeugungsdüse.