Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von intakten Legionellen-Haltigen Vakuolen (leichte Nutzfahrzeuge) von Amöben und Makrophagen. Das Zwei-Schritt-Protokoll umfasst LCV Anreicherung mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein bakterielles LCV-Marker und weitere Reinigung durch Dichtegradientenzentrifugation.
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die opportunistischen Erreger Legionella pneumophila ist eine Amöbe-resistentes Bakterium, das auch den Wiederholungen in Alveolarmakrophagen wodurch die schweren Lungenentzündung "Legionärskrankheit" ein. In Protozoen-und Säugetier-Phagozyten, L. pneumophila beschäftigt konservierten Mechanismus, um eine bestimmte, Replikations-permissive Fach, die "Legionellen-enthaltenden Vakuolen" (LCV) zu bilden. LCV Bildung erfordert die bakterielle Icm / Dot-Typ IV-Sekretionssystem (T4SS), was so viel wie 275 "Effektor" transloziert Proteine in Wirtszellen. Die Effektoren manipulieren Host-Proteinen sowie Lipide und kommunizieren mit sekretorischen, endosomalen Organellen und Mitochondrien-04.02.
Die Bildung von leichten Nutzfahrzeugen stellt eine komplexe, robuste und redundante Prozess, der nur schwer in einer reduktionistischen Weise zu erfassen ist. Ein integrativer Ansatz ist erforderlich, um umfassend zu verstehen LCV Bildung, einschließlich einer globalen Analyse Wegogen-Host-Faktor-Wechselwirkungen und ihre zeitliche und räumliche Dynamik. Als ein erster Schritt zu diesem Ziel werden intakte leichte Nutzfahrzeuge gereinigt und analysiert durch Proteomik und Lipidomik.
Die Zusammensetzung und die Bildung von Erreger-enthaltenden Vakuolen durch Proteom-Analyse durch Flüssigkeitschromatographie oder 2-D Gelelektrophorese gekoppelt Massenspektrometrie untersucht. Vakuolen entweder von der sozialen Amöbe Dictyostelium discoideum Boden oder Säugetier-Phagozyten isoliert hegte Leishmania 5, Listeria 6, 7 Mycobacterium, Rhodococcus 8, 9 oder Salmonella Legionella spp. 10. Allerdings sind die Aufreinigungsprotokolle in diesen Studien beschäftigt zeitraubend und langweilig, wie sie z. B. Elektronenmikroskopie zu LCV Morphologie, Integrität und Reinheit zu analysieren erfordern. Darüber hinaus müssen diese Protokolle nicht ausnutzen Besonderheiten des Erregers Vakuole für dereicherung.
Die hier vorgestellte Methode überwindet diese Einschränkungen durch den Einsatz von D. discoideum Herstellung eines fluoreszierenden Marker und LCV durch Targeting des bakteriellen Effektorprotein SidC, die selektiv Anker auf die LCV Membran durch Bindung an Phosphatidylinositol-4-phosphat (PtdIns (4) P) 3,11. LCV in einem ersten Schritt mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines affinitätsgereinigten primären Antikörper gegen SidC und einen sekundären Antikörper an magnetische Beads gekoppelt ist, in einem zweiten Schritt durch eine klassische Histodenz Dichtegradientenzentrifugation 12,13 (Abb. 1), gefolgt angereichert .
Ein Proteom-Studie von isolierten leichte Nutzfahrzeuge aus D. discoideum ergab mehr als 560 Wirtszellproteinen, einschließlich Proteine mit phagozytischen Vesikel, Mitochondrien, ER und Golgi, sowie mehrere GTPasen, die nicht in LCV Bildung wurden vor dem 13. beteiligt zugeordnet. LCV angereichert und gereinigt mit derProtokoll hier skizzierten kann durch Mikroskopie (Immunfluoreszenz, Elektronenmikroskopie), biochemischen Methoden (Western Blot) und Proteomik oder der Lipid Ansätze analysiert werden.
Protokoll
1. Die Vorbereitungen für LCV Isolation
- Streak aus Legionella pneumophila Herstellung DsRed-Express 13,14 Aktien aus Glycerin auf CYE-Agar-Platten mit 5 ug / ml Chloramphenicol (Cam) vier Tage vor LCV Isolation. Inkubieren der Bakterien bei 37 ° C
- Seed aus 1 x 10 7 D. discoideum Herstellung GFP-Calnexin oder RAW264.7 murinen Makrophagen in 75 cm 2 Zellkulturflaschen einen Tag vor Infektion. Verwenden Sie 10 ml HL5 Medium mit 20 ug / mL G418 für D. discoideum und inkubieren Sie die Amöben bei 23 ° C. Für RAW264.7 Makrophagen verwendet 10 ml RPMI 1640 Medium mit 10% FCS (hitze-inaktiviert)....
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Diskussion
Im Gegensatz zu früher veröffentlichten Verfahren wird dieses Protokoll auf zwei Schritten, zuerst die Trennung von leichten Nutzfahrzeugen mit einem Immuno-magnetische Ansatz und zweiten, die Reinigung von leichten Nutzfahrzeugen durch Dichtegradientenzentrifugation bezogen. Die LCV Trennung kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie, wenn entweder fluoreszenzmarkierten Bakterien und GFP-produzierenden Zellen oder Antikörper-Färbung verwendet wird, gefolgt werden. Das hier beschriebene Protokoll ist eine einfache, unkomplizier.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Forschung in unserem Labor wurde von der Max von Pettenkofer-Institut, Ludwig-Maximilians-Universität München, der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HALLO 1511/3-1) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Medical Infektion Genomics"-Initiative unterstützt ( 0315834C).
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Referenzen
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Do....
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Nachdrucke und Genehmigungen
