Eine niedrige Sterblichkeit Rattenmodell Verzögerte zerebralen Vasospasmus nach experimenteller Subarachnoidalblutung beurteilen

Zusammenfassung

Aneurysmal Subarachnoidalblutung (SAB) blutet, das auftritt, in den Subarachnoidalraum, wenn ein Aneurysma platzt. Während die Morbidität und Mortalität von dieser Veranstaltung wurde auf einen Rückgang aufgrund der verbesserten Behandlungsansätze, die Gefahr des Vasospasmus wurde nach Subarachnoidalblutung weiterhin die gleichen wie noch vor einigen Jahren war. Die Bedeutung der Schaffung eines umfassenden und reproduzierbare Tiermodell, um auslösende Ereignisse des zerebralen Vasospasmus zu identifizieren hat sich der Schwerpunkt der Forschung seit dem ersten Einsatz von Ratten in einem experimentellen Vasospasmus-Modell 1979 von Barry Et al. Frühe Arbeiten bei Ratten gezeigt, dass eine einzige Injektion von Eigenblut in die Cisterna magna zu akuten geführt (in Minuten), aber nicht verzögert zerebralen Vasospasmus ^{3, 6, 14}. Hier charakterisieren wir eine niedrige Sterblichkeit SAH Rattenmodell, dass die Ergebnisse reproduzierbar verzögerte Vasospasmus.

Zusammenfassung

Zielsetzung: charakterisieren und festzustellen, die ein reproduzierbares Modell verzögert zerebralen Vasospasmus nach aneurysmatischer veranschaulicht Subarachnoidalblutung (SAB) bei Ratten, um die auslösenden Ereignissen, pathophysiologische Veränderungen und potentielle Ziele für die Behandlung zu identifizieren.

Methoden: Achtundzwanzig männliche Sprague-Dawley-Ratten (250 - 300 g) - SAH oder Kochsalzlösung Kontrolle wurden willkürlich einer von zwei Gruppen zugeordnet. Rat Subarachnoidalblutung in der SAH-Gruppe (n = 15) wurde durch doppelte Injektion von Eigenblut induziert, 48 hr auseinander, in die Cisterna magna. Ähnlich normaler Kochsalzlösung (n = 13) wurde in die Zisterne magna der Salzlösungs-Kontrollgruppe injiziert. Die Ratten wurden am Tag fünf nach dem zweiten Blut-Injektion getötet und die Gehirne wurden für die histologische Analyse aufbewahrt. Der Grad der Vasospasmus wurde unter Verwendung Abschnitten der Arteria basilaris, durch Messung der internen luminale Querschnittsfläche mit NIH Image Software-J. Die Bedeutung wargetestet Tukey / Kramer 's statistische Analyse.

Ergebnisse: Nach der Analyse von histologischen Schnitten, waren basilaris luminale Querschnittsfläche kleiner in der SAH als in der Kochsalz-Gruppe, die mit zerebralen Vasospasmus in der ersten Gruppe. Im SAH Gruppe waren basilaris Innenraum (0,056 um ± 3) deutlich kleiner ab Vasospasmus fünf Tage nach der zweiten Injektion Blut (sieben Tage nach der ersten Injektion Blut), verglichen mit der Kontrollgruppe, die mit Kochsalzlösung Innenraum (0,069 ± 3, p = 0,004). Es gab keine Todesfälle von zerebralen Vasospasmus.

Fazit: Die Ratte Doppel SAH-Modell führt zu einem milden, überlebensfähige, Basilararterie Vasospasmus, die verwendet werden, um die pathophysiologischen Mechanismen der zerebralen Vasospasmus in einem kleinen Tiermodell studieren können. Eine niedrige und akzeptablen Mortalitätsrate ist ein wesentliches Kriterium für eine ideale SAH Tiermodell befriedigt werden, so dass die Mechanismen des Vasospasmus kann elucidated ^{7, 8.} Weitere Modifikationen des Modells können, um für erhöhte Schwere Vasospasmus und neurologischen Untersuchungen einzustellen.

Protokoll

Ein. Rat Chirurgie für SAH Betreff Mit 0,15 ml Autologe arterielle Blut injiziert

1. Die Ratte ist betäubt mit 0,1 mg / kg Ketamin / Xylazin Nager Cocktail und darf für 5 min zu sitzen.
2. Eine adäquate Anästhesie wird durch Reduktion in Hinterbein reflex bestätigt.
3. Mit Hilfe eines elektronischen Rasierer a Hals Bereich der Haare rund um die sub-Okzipitalregion Nase ist rasiert.
4. Das Tier wird in Rückenlage auf dem OP-Tisch gelegt und der Schwanz ist mit betadine abgetupft, um eine sterile Schnitt zu gewährleisten.
5. Ein gerader 1 cm Inzision auf der ventralen Seite des Schwanzes ergriffen
6. Die Präparation wird verlängert, bis der Schwanzarterie wird identifiziert und isoliert.
7. Verwendung einer sterilen 26-Gauge-Katheters wird der Schwanzarterie kanüliert und 0,15 ml arterielle Blut wird in eine Spritze gezogen.
8. Eine sterile Gaze gehüllt um den Einschnitt, um Hämostase vor dem Aufbringen der vetbond den Einschnitt abzudichten gewährleisten.
9. TEr rat eingeschaltet ist bäuchlings auf dem Tisch und dem rasierten Bereich über dem Sub-okzipitalen Region mit betadine abgetupft.
10. Verwendung einer vertikalen Mittellinieneinschnitt Zugang wird dem cisterna magna gewonnen.
11. Sobald sie identifiziert sind eine 25 Gauge-Nadel in die Zisterne magna eingefügt und 0,15 ml CSF wird in eine Spritze zu einer erhöhten intrakraniellen Druck mit Injektion von Eigenblut Volumen vermeiden zurückgezogen.
12. Nun wird das 0,15 ml Blut aus der Schwanzarterie entnommen langsam in die Zisterne magna injiziert.
13. Die Nadel wird in für 30 sec bleiben, um sicherzustellen Gerinnungszeit im Subarachnoidalraum und dann vorsichtig abgezogen.
14. Hämostase gewährleistet ist und der Einschnitt wird geschlossen mit einer Heftvorrichtung.
15. Das Tier ist nun platziert neigen mit 20 ° Kopf Position für 20 min auf einer Erwärmung Oberfläche Blut zu ermöglichen, in den Zisternen um die basilaris erstarren.
16. Schritte 1.1 bis 1,15 sind während der zweiten Operation 48 hr voneinander wiederholt.

2. Rat Chirurgie für SAH Betreff mit 0,15 ml Kochsalzlösung injiziert

1. Die Ratte ist betäubt mit 0,1 mg / kg Ketamin / Xylazin Nager Cocktail und darf für 5 min zu sitzen.
2. Eine adäquate Anästhesie wird durch Reduktion in Hinterbein reflex bestätigt.
3. Mit Hilfe eines elektronischen Rasierer a Hals Bereich der Haare rund um die sub-Okzipitalregion Nase ist rasiert.
4. Das Tier wird in Rückenlage auf dem OP-Tisch gelegt und der Schwanz ist mit betadine abgetupft, um eine sterile Schnitt zu gewährleisten.
5. Ein gerader 1 cm Inzision auf der ventralen Seite des Schwanzes ergriffen
6. Die Präparation wird verlängert, bis der Schwanzarterie wird identifiziert und isoliert.
7. Verwendung einer sterilen 26-Gauge-Katheters wird der Schwanzarterie kanüliert und 0,15 ml arterielle Blut wird in eine Spritze gezogen.
8. Eine sterile Gaze gehüllt um den Einschnitt, um Hämostase vor dem Aufbringen der vetbond den Einschnitt abzudichten gewährleisten.
9. Die rat eingeschaltet ist auf dem Tisch und dem rasierten Gebiet anfällig ist mit betadine übermalt Sub-okzipitalen Region.
10. Verwendung einer vertikalen Mittellinieneinschnitt Zugang wird dem cisterna magna gewonnen.
11. Sobald sie identifiziert sind eine 25 Gauge-Nadel in die Zisterne magna eingefügt und 0,15 ml CSF wird in eine Spritze aufgezogen und die Probe wird gespeichert.
12. Nun wird das 0,15 ml physiologischer Kochsalzlösung (37 ° C) langsam in die Zisterne magna injiziert.
13. Die Nadel wird in für 30 sec links und vorsichtig abgezogen.
14. Hämostase gewährleistet ist und der Einschnitt wird geschlossen mit einer Heftvorrichtung.
15. Das Tier ist nun platziert neigen mit 20 ° Kopf Position für 20 min auf einer Erwärmung Oberfläche.
16. Schritte 2,1-2,15 werden während der zweiten Operation 48 hr voneinander wiederholt.

3. Rat Sacrifice

1. Am Tag 5 nach der zweiten Operation werden die Ratten durch kardiale Perfusion geopfert.
2. Die Ratte wird eine tödliche Dosis (0 gegeben0,2 ml / kg) von Fatal Plus (Vortech PHARMACEUTICALS LTD., Dearborn, MI)
3. Mit einer vertikalen Inzision wird die Bauchhöhle näherte und das Peritoneum eröffnet.
4. Eine anteriore Thorakotomie durchgeführt wird und das Herz freigelegt ist.
5. Verwendung einer 26-Gauge-Katheter mit einer Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4 und bei 37 °) wird das Tier von Blut entleert und danach mit 4% Paraformaldehyd perfundiert.
6. Nach Sicherstellung einer angemessenen Perfusion wird die Perfusion gestoppt und die Ratte wird über die Enthauptung Tisch gebracht.
7. Nach Enthauptung, ist ein Knochen Rongeur verwendet werden, um den Schädel für Gehirn Entfernen entfernen.
8. Das Gehirn und Hirnstamm werden sorgfältig aus der Schädelhöhle extrahiert und in eine 4% Paraformaldehyd-Lösung und bei 4 ° C für 48 Stunden.

4. Erstellen von Abschnitten, um Vasospasmus beurteilen

1. Die Rattengehirn, die nun in 30% Saccharose wurde für 4 Tage eingetaucht ist, um th gebrachte Kryostat zum Schneiden.
2. Sobald cryoprotected, 12 uM Abschnitte werden mit dem Kryostaten mit dem Anterior Inferior Kleinhirnarterie (AICA) als Ausgangspunkt, um inter-subject Konsistenz zu gewährleisten.
3. 20 Abschnitten werden für jedes Tier geschaffen, endend bei dem Superior Kleinhirnarterie (SCA).
4. Die Schnitte werden auf einen Objektträger platziert und auf eine mögliche Verwendung von histologischen Vasospasmus Methodik

Ergebnisse

Innerhalb der Protokolle oben beschrieben, gibt es mehrere Schritte, die wir glauben erfordern eine bessere Charakterisierung des Modells als das, was zuvor in der Literatur beschrieben. Hier haben wir auf den Stufen, die notwendig sind, um eine reproduzierbare niedrige Sterblichkeit zerebralen Vasospasmus kleinen Tiermodell zu erreichen und vermeiden potenzielle Fallstricke bei diesem Modell verbunden, wenn nicht richtig gemacht zu konzentrieren.

Ein. Eigenblut Draw aus dem Schwanzarterie:

Diskussion

Primaten, eine weitere ähnliche genetische Zusammensetzung und anatomischen Merkmalen der Mensch, genauer nachahmen die Ereignisse des verzögerten zerebralen Vasospasmus und kann leichter zu unterziehen nicht-invasive Bildgebung (MRI und Angiographie), um arterielle Veränderungen, als Nagetiere ⁸ überwachen. Allerdings sind Primatenmodelle kostspielig und mit komplexer Pflege und ethische Fragen, als kleine Tiermodellen. Kleintier-SAH Modelle, die entwickelt wurden vorher für drei Methoden zur Induktion SAH k...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name der Ausrüstung / Reagenz	Firma	Katalog-Nummer
Männliche SD-Ratten (250-300 g)	Taconic	SD-M
26 G Katheter	Webster	8416683
25 G Nadeln	Büffel	305122
1 cc Spritzen	Central speichert	54245
Ketamin / Xylazin-Cocktail	Animal Care (SUNY) *	-
Betadine	Central speichert	51458
Saccharose	Sigma	S9378-1 kg
Paraformaldehyd	Sigma	P6148-500G
Phosphatpufferlösung	Fischer	BP-399-4
OP-Tisch	Harvard	PY2 72-2590
Oktober Compound (Kryokonservierung)	VWR	25608-930
Superfrost Slides	Fischer	12-550-15

* Bei Department of Laboratory Animal Care, SUNY Upstate Medical University synthetisiert. Fügen Sie 1 cc [100 mg / ml] von Xylazin bis 10 ml [100 mg / ml] von Ketamin.