Herstellung und Anwendung von Rose Bengal-Chitosan-Films in Laser Tissue Repair

Zusammenfassung

Die Fäden werden in der Regel erforderlich, um Gewebe während chirurgischer Eingriffe zu reparieren. Jedoch kann ihre Anwendung als problematisch, da sie invasiv sind und kann Gewebe beschädigen. Die Herstellung und Anwendung Methoden einer neuartigen Gewebekleber werden hier berichtet. Diese Klebefolie wird lasersensitiven aktiviert und erfordert nicht die Verwendung von Nähten.

Zusammenfassung

Photochemischen Gewebe Bonden (PTB) eine Technik zum nahtlosen Gewebereparatur, die durch Aufbringen einer Lösung von Bengalrosa (RB) zwischen zwei Gewebekanten ^1,2 erreicht wird. Diese werden dann durch einen Laser, der selektiv von der RB absorbiert bestrahlt. Die daraus resultierenden photochemische Reaktionen vermeintlich vernetzen die Kollagenfasern im Gewebe mit minimalen Wärmeerzeugung ^3. In diesem Bericht hat RB in dünnen Chitosanfilme eingebaut worden, um einen Roman Gewebekleber, die Laser-aktiviert ist herzustellen. Klebschichten auf Chitosan und enthaltend ~ 0,1 Gew.% bezogen RB, hergestellt sind und mit diesen verbunden Kälberdarm und Ratte tibialis von einem Festkörperlaser (λ = 532 nm, Fluence ~ 110 J / cm ^2, Spotgröße ~ 0,5 cm) . Eine einzelne Spalten Tensiometer, eine Schnittstelle mit einem Personal-Computer verwendet wird, um die Bindungsstärke zu testen. Die RB-Chitosan Klebeverbindungen fest mit dem Darm mit einer Stärke von 15 ± 6 kPa, (n = 30). Die Haftfestigkeit fällt nach 2 ± 2 kPa (n = 30), wenn der Laser nicht auf den Klebstoff aufgetragen. Die Anastomose tibialis kann auch ohne die Verwendung von Nähten abgeschlossen sein. Eine neuartige Chitosan Kleber hergestellt worden ist, dass photochemisch Bindungen an Gewebe und erfordert keine Nähte.

Protokoll

Ein. Chitosan Klebstoffzubereitung

1. Die Chitosanpulver ist löslich in Essigsäure-Lösung, zur Herstellung einer Stammlösung von Essigsäure (2% v / v), 10 ml Eisessig zu 490 ml deionisiertem Wasser (DI-H ₂ O).
2. Zur Herstellung einer Stammlösung von Bengalrosa (RB) (0,01% w / v) in Essigsäure, 5 mg wiegen RB in einer Phiole mit Alufolie eingewickelt, um zu vermeiden Photobleichen. 0,5 ml DI-H ₂ O, um das Pulver dann auflösen hinzuzufügen 49,5 ml der Essigsäure Stammlösung (beschrieben in Abschnitt 1.1).
3. Zur Herstellung von Chitosan-Lösung (1,7% w / v), wiegen 0,85 g Chitosan Pulver (mittlere MW, 85% Acetylierungsgrad) und in den 50 ml RB Essigsäurelösung. Die Kontrolle wurde durch Lösen des Chitosan in Essigsäure-Lösung ohne RB hergestellt.
4. Hinzufügen eines Magnetrührers dem Chitosan Mischung zugegeben und bei Raumtemperatur. Um eine vollständige Auflösung der Komponenten zu gewährleisten, rühren das Chitosanin Essigsäure + RB für zwei Wochen und dem Chitosan in Essigsäure für 5 Tage (Kontrolle). Wenn Chitosan gelöst wird, erhöht sich der pH der Lösung von 2,6 bis ~ ~ 3,9. Beachten Sie, dass RB schlecht löslich in sauren pH-Wert ist, und es erfordert eine Erhöhung des pH der Lösung und einer ausgefahrenen Rührzeit sich aufzulösen.
5. Zentrifugieren der Lösungen bei 3270 × g für 1 Stunde und den Überstand unter Verwendung von zum Beispiel eine sterile 10-ml-Spritze. Achten Sie darauf, um die Verunreinigung Pellet stören. Während dieses Schrittes wird die Lösung von makroskopischen Verunreinigungen und Unlösliches gereinigt.
6. Spritzen Sie die (zentrifugiert) Chitosanlösung auf einer ebenen Acrylglasstreifen Platte mit einer sterilen Spritze. Die Dicke des getrockneten Films hängt von dem Verhältnis zwischen der abgegebenen Menge der Lösung und der Oberfläche, über die die Lösung verteilt. Stellen Sie sicher, dass die Lösung frei von Luftblasen ist und gleichmäßig auf der Platte verteilt. Um dünne Filme mit ~ 13 um Dicke zu erhalten, injizieren ~ 1 ml Lösung über 12 cm ² Fläche(Maße ~ 3x4 cm, Abb. 1A).
7. Decken Sie die Plexiglas Platte mit einem Bildschirm, der Aluminiumfolie zum Beispiel aus, um zu verhindern Ausbleichen der Lösung. Sicherzustellen, dass genügend Luft Belüftung gewährleistet ist, um die Lösung unter dem Bildschirm trocknen.
8. Lassen Sie die Lösung bei Raumtemperatur (25 ° C) und Druck (1 atm), bis der resultierende Film ist unlöslich in Wasser und nicht aufquellen makroskopisch trocken. Dies wird typischerweise in 2 Wochen erreicht.
9. Trennen der Folien vorsichtig mit einem dünnen und flachen Spatel: diese Folien können leicht vom Perspex Bramme werden ohne sie zu beschädigen abgeschält.
10. Die Dicke der Filme mit einem Mikrometer.
11. Schneiden Sie den Kleber in rechteckigen Streifen mit einem sauberen scharfen Schere und legen Sie sie zwischen sterilen Glasplättchen ihre flache Form zu bewahren. Wickeln Sie die Folien in Aluminiumfolie für Lichtabschirmung und speichern Sie sie bei Raumtemperatur. Beschriften Sie die Klebstoffe mit oder ohne RB als "stieg Kleber" oder "Chitosan ADHESive "bezeichnet.
12. Die erhöhte Klebefilme können sterilisiert unter Verwendung von Ethanol (90%) oder mit Gammastrahlung (0,1 kGy / h für 24 Std.) ^4,5 ist.

2. Adhesive optische Dämpfung

1. Befestigen Sie die Rose Klebstoff in einer Quarzküvette.
2. Aufzeichnen ihrer abgeschwächte Spektrum im Bereich von 400 - 800 nm unter Verwendung eines Zweistrahl-Spektralphotometer ^4.
3. Unter der Annahme der Gültigkeit der Beerschen Gesetz berechnet die mittlere freie Weglänge des Klebstoffs wie folgt: I = I ₀ ^e-Ax wobei I ₀ die Intensität einfallenden Strahls, 1 / A ist die mittlere freie Weglänge, und x ist die Filmdicke.
4. Wiederholen Schritte 2.1 bis 2.3 für den Klebstoff auf Chitosan als Kontrolle zu dienen.

3 In-Vitro-Anwendung:. Laser Tissue Bonding am Darm

1. Ernte Kälberdarm unmittelbar nach Tier Euthanasie und bei -80 ° C.
2. Vor Gebrauch auftauen und Hydrat der tissue durch Eintauchen in DI-H ₂ O für 10 min.
3. Halbieren des Gewebes in Abschnitte (2 x 1 cm) unter Verwendung eines # 10 Klinge unter einem Operationsmikroskop (x10). Halten Sie die Abschnitte feuchte mit DI-H ₂ O.
4. Bringen Sie die Inzision Baumstümpfe nahe beieinander (Ende zu Ende). Wischen Sie überschüssiges Wasser von der Oberfläche mit Wattestäbchen.
5. Legen Sie eine Rose Klebestreifen (10 x 6 mm) über dem Einschnitt auf der Serosa Schicht mit Mikropinzetten Gewährleistung der vollen Kontakt mit dem Darm (Abbildung 2).
6. Die Gewebeklebung der Rose Kleber wird von einem diodengepumpten Festkörperlaser, die zu einer optischen Mehrmodenfaser (Kerndurchmesser 200 um) ⁴ gekoppelt wird aktiviert.
7. Setzen des Leistungspegels des Lasers bis 180 mW und bestrahlen den Klebstoff für ~ 6 min mit einer Strahlpunktgröße ~ 5 mm, über die Parameter in Tabelle 1 aufgelistet. Auftropfen bestrahlen der Kleber sichergestellt wird, dass jeder Punkt für ~ 5 Sekunden vor dem Bewegen des Strahls mit dem benachbarten Fleck bestrahlt. TVerfahren garantiert sein, dass der Laserstrahl die gesamte Oberfläche der Klebstoff mehrere Male scannt.
8. Um das Gewebe Bindungsfestigkeit beurteilen, Verriegeln einer Probe auf einem kalibrierten Einzelsäule Tensiometer (Instron, MA, USA) unter Verwendung von mechanischen Griffe. Bewegen Sie die Griffe bei 22 mm / min bis die beiden Gewebe Baumstümpfe separate ^4.
9. Legen Sie eine Rose Kleber auf das Gewebe, wie in Schritt 3.5 beschrieben. Nicht bestrahlen die Probe und messen Sie das Gewebe Haftfestigkeit wie in Schritt 3.8 beschrieben. Dieses Beispiel dient als Kontrolle.

4 In Vivo Anwendung:. Nervus tibialis Anastomose

1. Sedate der Wistar-Ratte mit Isofluran / O _2-Gemisch (4% während der Induktion, 2% danach) ^5. Subkutan injizieren Buprenex (0,03 mg / kg), um intra-operative analgetische Wirkung bereitzustellen und zu lindern mögliche Schmerzen oder Unbehagen.
2. Das folgende operative Verfahren sollte unter einem Operationsmikroskop (x10) durchgeführt werden. Stellen Sie eine schräge HautSchnitt etwa 3 cm lang in der dorso-lateralen Teil des rechten Oberschenkels und setzen die tibialis mit einem Muskel-Splitting Ansatz durch die Gesäßmuskulatur ^2.
3. Teilweise sezieren und schneiden Sie die Adventitia des Nervus tibialis mit geraden Mikro-Schere und absorbieren überschüssiges Wasser mit einer sterilen Gaze oder Wattestäbchen.
4. Schneiden Sie den Nervus tibialis mit Mikro-Schere.
5. Positionieren Sie eine sterile Chitosan Streifen (Abmessungen 5 x 4 mm) unterhalb des Nervus tibialis mit Mikro-Pinzette.
6. Angleichung der Nervenstümpfe end-to-end mit Mikro-Pinzette über die Rose Klebestreifen.
7. Der Streifen vollständig haftet an dem Nerv Ausbilden einer Manschette, die mit der Drehung des Nervs während der Laserbestrahlung des Bandes unterstützen.
8. Aktivieren der Rose Klebstoff mit dem Laser wie in den Schritten 3.6 beschrieben) und 3.7).
9. Schneiden Sie die redundante stieg Kleber aus dem Kragen des operierten Nerven.
10. Schließen Sie die Muskeln und die Haut mit fünf 3-0 Nähte ^5.
11. Post-operative Beitreibungsverfahren sollten einschließlich der täglichen Inspektion für Dehiszenz oder Eiterbildung und analgetische Verwaltung gefolgt werden, falls erforderlich.

5. Repräsentative Ergebnisse

Die Folien, die erhalten sind hell stieg in Farbe, dünn und haben eine glatte Oberfläche (Abbildung 1). Sie sind auch flexibel und kann in Röhren mit geringem Durchmesser ohne daß Risse oder sonstige Beschädigungen scheinbaren (1B) gerollt werden. Die Rosette Klebstoff hat zwei Absorptionsspitzen bei 530 und 562 nm; der grüne Laser ist also stark von dem Klebstoff und dem entsprechenden Dämpfung Länge bei 532 nm absorbiert ist ~ 12 um (Abb. 3). Dagegen dämpft Chitosanfilme ohne RB schwach des Lasers (1 / A ~ 162 Mikrometer), wahrscheinlich aufgrund von Streuung. Es scheint aus den Spektren Grundstück, dass keine signifikante Aggregation von RB in den Filmen auftritt.

Die Rose Klebeverbindungen festin den Darm auf Laserbestrahlung (Abbildung 2) erreicht einen typischen maximalen Last bei Ausfall von 0,9 ± 0,4 N (n = 30). Die Haftfestigkeit wurde als die maximale Last durch die Klebefläche, nämlich ± 6 15 unterteilt kPa (n = 30) geschätzt. Die nicht bestrahlten Rose Klebstoff erheblich weniger an Gewebe gebunden (2 ± 2 kPa, n = 30, ungepaarten t-Test p <10 ^6). Das in-vivo Anastomose der tibialis wurde erfolgreich nach dem Aufbringen und Verbinden der Rose Klebstoff in Verbindung mit dem grünen Laser erreicht. Eine Woche nach der Operation war die betätigte Nerv in Kontinuität und Festigkeit der Reparatur betrug 17 ± 9 kPa (n = 10).

Abbildung 1. A) Der RB-Chitosan-Lösung wird auf einer flachen Plexiglas Platte (Deckenstärke ~ 5 mm) gegossen. Graph Papier unter der Decke platziert, um die dry-Besetzung Schritt zu erleichtern. Das wasserunlösliche film wird zwei Wochen nach dem Gießen erhalten. B) Die Rose Klebstoff ist flexibel und kann in einem kleinen Zylinder gerollt werden.

Abbildung 2. Die Rose Klebstoff wird auf Kälberdarm nach Laserbestrahlung gebunden. Gleichmäßige Bestrahlung erfolgt auf der RB Klebstoff während gewebespezifischen Bonden aufgebracht, doch ausgewählten Flecken sind in dieser Abbildung gezeigt, um die Photo-Bleichwirkung des Lasers auf dem Klebstoff zeigen.

Abbildung 3. Das Absorptionsspektrum (in willkürlichen Einheiten) der Rose Klebstoff zeigt zwei Peaks bei 530 und 562 nm liegt. Der grüne Laser (λ = 532 nm) ist daher stark durch den Klebstoff während der Laserbelichtung absorbiert. Das Chitosan Klebstoff ohne RB absorbiert schlecht des Laserstrahls.

	n	Area (mm 2)	Leistung (W)	Zeit (s)	Fluenz (J / cm 2)	I (W / cm 2)	Max Load / Area (kPa)
Adhesive + Laser	30	60 ± 10	0,18 ± 0,03	365 ± 5	~ 110	~ 0,9	15 ± 1
Klebstoff	30	60 ± 10	NA	NA	NA	NA	2 ± 2

Tabelle 1. Legend. n, Probennummer; Gebiet, eine Oberfläche von der Rose Klebstoff (Mittelwert ± maximalen Fehler), Power, Laserleistung (Mittelwert ± maximalen Fehler); Zeit, Bestrahlungszeit (Mittelwert ± maximalen Fehler); Fluence, durchschnittlich Laserfluenz; I, geschätzten irradiance; Zuladung / Gebiet, maximaler Last bei Ausfall des reparierten Gewebe durch die Klebefläche unterteilt, (Mittelwert ± SE).

Diskussion

Der Klebstoff stieg Fertigung auf einfache chemische Gießverfahren basiert, wenn die Auflösung der RB in sauren pH erfordert verlängert Rühren der Chitosanlösung. Es ist wichtig, damit die Lösung trocknet, bis es einen wasserunlöslichen Film wird. Dies geschieht, wenn das Gewicht Wassergehalt beträgt ~ 10% im getrockneten Films ^6. Unlösliche Filme sind in der Regel 2 Wochen nach Trocken-Casting bei Standardbedingungen von Temperatur und Druck (~ 25 ° C und ca. 1 atm) erhalten. Der Mechanismus von Gewebe Bindu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	632-69-9
Chitosan (medium MW)	Sigma-Aldrich	10318AJ
Eisessig	Sigma-Aldrich	08050051	2% v / v in DI-Wasser
Magnetrührer	Heidolph	MR Hei-Mix S
Zentrifugieren	Beckman Coulter	Allegra X-12R
Spektrophotometer	Varian	Cary 4000 UV-Visible
Laser	CNI Laser	MGL-532
Mikrometer	Mitutoyo	Serie 227
Operationsmikroskop	Zeiss	OPMI