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Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

DOI:

10.3791/4159

July 25th, 2012

In This Article

Summary

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Interstitielle Fluidstrom wird in soliden Tumoren erhöht und modulieren kann Tumorzellinvasion. Hier beschreiben wir eine Technik, um interstitielle Flüssigkeit fließen, um Zellen in einer Matrix eingebettet zu bringen und dann die seine Auswirkungen auf Zellinvasion. Diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Systeme zu studieren.

Abstract

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Das Wachstum und die Progression der meisten soliden Tumoren sind abhängig von der anfänglichen Transformation der Krebszellen und ihre Reaktion auf Stroma-assoziierten Signalmoleküle in der Tumor-Mikroumgebung 1. Bisher hat die Forschung auf die Tumor-Mikroumgebung in erster Linie auf die Tumor-Stroma-Interaktionen 2.1 konzentriert. Allerdings ist die Tumor-Mikroumgebung auch eine Vielzahl von biophysikalischen Kräfte, deren Wirkungen noch wenig verstanden. Diese Kräfte sind biomechanischen Folgen des Tumorwachstums, die zu Veränderungen in der Genexpression, Zellteilung, Differenzierung und Invasion 3 führen. Dichte-Matrix 4, Steifigkeit 5-6, 6-7 und Struktur, interstitielle Flüssigkeitsdruck 8, und der interstitiellen Flüssigkeit fließen 8 sind alle während der Tumorprogression verändert.

Interstitielle Fluidströmung insbesondere eine höhere Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe 8-10. Die geschätzte interstitiellen Flüssigkeit flow Geschwindigkeiten wurden gemessen und in dem Bereich von 0,1-3 um s -1, je nach Größe des Tumors und Differenzierung 9, 11. Dies ist aufgrund des erhöhten interstitiellen Druckes mit Tumor-induzierte Angiogenese und erhöhte Gefäßpermeabilität 12 hervorgerufen wird. Interstitielle Fluidströmung hat sich gezeigt, um das Eindringen von Krebszellen 13-14, vaskulären Fibroblasten und glatten Muskelzellen 15 erhöht wird. Dieses Eindringen kann auf autologen chemotaktische Gradienten um Zellen in 3-D 16 erzeugt oder erhöht Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Expression 15, Chemokin Sekretion und Expression Zelladhäsionsmolekül 17. Jedoch ist der Mechanismus, durch den Zellen zu erfassen Fluidströmung nicht gut verstanden. Zusätzlich zu verändern Tumorzelle Verhalten moduliert interstitiellen Flüssigkeit fließen die Aktivität anderer Zellen in der Tumor-Mikroumgebung. Es ist mit (a) Fahren Differenzierung von Fibroblasten in tumorpromovierenden myofibr verbundenoblasts 18, (b) Transportieren von Antigenen und anderen löslichen Faktoren in Lymphknoten 19, und (c) Modulieren lymphatischen Endothelzellen Morphogenese 20.

Die hier vorgestellte Technik auferlegt interstitiellen Flüssigkeit fließen auf Zellen in vitro und quantifiziert deren Auswirkungen auf Invasion (Abbildung 1). Diese Methode wurde in mehreren Studien veröffentlicht worden, um die Auswirkungen der Strömung auf Stroma und die Invasion von Krebszellen 13-15, 17 zu messen. Durch Ändern der Matrix-Zusammensetzung, dem Zelltyp, und Zellkonzentration, kann dieses Verfahren auf andere Krankheiten und physiologische Systeme angewendet werden, um die Auswirkungen der interstitiellen Strömung auf zellulärer Prozesse, wie Invasion, Differenzierung, Proliferation und die Genexpression zu untersuchen.

Protocol

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1. Assay Set-up

  1. Auftauen einer kleinen aliquoten (<500 ul) von Matrigel auf Eis bei 4 ° C (etwa 2 Stunden).
  2. Bereiten Sie Gel-Rezeptur (siehe Beispiel Volumina in Tabelle unten): 10x PBS (1x im Gesamtvolumen), 1 N Natronlauge (entspricht 0,023 Bände hinzugefügt Kollagen, respektive dem Kollagen den Empfehlungen des Herstellers, soweit erforderlich), geben Sie Matrigel und Kollagen I zu Endkonzentrationen von 1 mg / ml und 1,3 mg / ml (andere Matrix-Formulierungen verwendet werden, je nach Zelltyp und Experiment werden).

Beispiel Gel-Rezeptur

Komponent....

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Discussion

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Hier haben wir eine Methodik zur Quantifizierung der Wirkung der Strömung auf interstitielle Tumorzellinvasion, unter Verwendung von Zellen in einem 3-D-Matrix in einer Zellkultureinsatzes eingebetteten beschrieben. Diese und ähnliche Verfahren sind verwendet worden, um die Wirkung der interstitiellen Strömung auf einer Vielzahl von Zelltypen 13-15, 17 studierst. Unser Ansatz teilweise imitiert die Matrix Mikroumgebung des Tumors mit Kollagen Typ I und Matrigel, die Proteine ​​in der Basalmembran von Epithelg.......

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Disclosures

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
Collagen (Rattenschwanz) BD 354236 Halten sterilen
Millicell Zellkultureinsatzes Millipore PI8P01250 8 mu m Porendurchmesser, Polycarbonat-Membran
Matrigel BD 354234 Halten sterilen
PBS Sigma Aldrich 100M-8202 10x für die Vorbereitung Gel-Lösung, 1x für Waschschritte
Natriumhydroxid, 1,0 N-Lösung Sigma Aldrich S2770 Halten sterilen
DMEM 1X CellGro 10 bis 013-CV Halten sterilen
Fötalem Rinderserum Atlanta Biologicals 511150 Halten sterilen
Penicillin Streptomycin CellGro 30002CI Halten sterilen
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-500 ml 0,5% in PBS
Paraformaldehyd Fisher Scientific 04042-500 4% in PBS
Deionisiertes Wasser Halten sterilen
4 ',6-diaminido-2-phenylindol (DAPI) MP Biomedicals 0215757401 1 mg / ml Stammlösung
Montage-Lösung Thermo Scientific TA-030-FM
Trypsin-EDTA CellGro 25-052-CI Halten sterilen

References

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  1. Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
  2. Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell....

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Tags

Interstitial Fluid FlowTumor Cell Invasion3D Cell CultureCollagen Matrigel GelTranswell AssayStatic Flow ConditionsCell Migration AnalysisMDA MB 435 CellsFluorescent StainingInvasion Quantification

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