Summary
Electrospun stillasene kan behandles etter produksjon for tissue engineering applikasjoner. Her beskriver vi metoder for å spinne komplekse stillasene (med påfølgende sentrifugering), for å lage tykkere stillasene (av multi-lagene ved hjelp av varme eller damp annealing), for å oppnå sterilitet (aseptisk produksjon eller sterilisering post produksjon) og for å oppnå hensiktsmessige biomekaniske egenskaper.
Abstract
Electrospinning er et vanlig og allsidig metode for å produsere stillaser (ofte nedbrytbart) for 3D tissue engineering. 1, 2, 3 Mange vev in vivo gjennomgå toaksiale distensjon i varierende grad for eksempel hud, blære, bekkenbunnen og selv den harde gane som barn vokse. I produsere stillasene for disse formålene er det behov for å utvikle stillasene av hensiktsmessige biomekaniske egenskaper (enten oppnås uten eller med celler) og som er sterile for klinisk bruk. Fokuset i denne artikkelen er ikke hvordan å etablere grunnleggende electrospinning parametre (som det er omfattende litteratur om electrospinning), men på hvordan du endrer spunnet stillasene post produksjon slik at de passer for tissue engineering formål - her tykkelse, mekaniske egenskaper og sterilisering (kreves for klinisk bruk) er vurdert og vi også beskrive hvordan celler kan dyrkes på stillasene og utsatt for toaksiale påkjenning å betingelse dem for spesifikke applikasjoner.
Electrospinning tendens til å produsere tynne ark, som electrospinning kollektoren blir belagt med isolerende fiber blir det en fattig dirigent slik at fibrene ikke lenger innskudd på den. Derfor vi beskriver tilnærminger til å produsere tykkere konstruksjoner av varme eller damp annealing øke styrken stillasene, men ikke nødvendigvis den elastisitet. Sekvensielle spinning av stillasene av ulike polymerer for å oppnå komplekse Stillasene er også beskrevet. Sterilisering metoder kan påvirke styrke og elastisitet av stillaser. Vi sammenligner tre metoder for deres virkninger på de biomekaniske egenskapene på electrospun stillasene av poly melkesyre-co-glykolsyre (PLGA).
Imaging av celler på stillasene og vurdering av produksjon av ekstracellulær matrix (ECM) proteiner i celler på stillasene er beskrevet. Dyrkning celler på stillasene in vitro kan forbedre stillas styrke og elastisitet, men tissue engineering literature viser at cellene ofte ikke klarer å produsere passende ECM når dyrket under statiske betingelser. Det er få kommersielle systemer tilgjengelig tillate at en til kultur celler på stillasene under dynamiske condition regimer -. Ett eksempel er det Bose Electroforce 3100 som kan brukes til å utøve en condition program på celler i stillasene holdt ved hjelp av mekaniske grep i løpet av noen media fylt kammer 4 En tilnærming til et budsjett cellekultur bioreaktor for kontrollert forvrengning i 2 dimensjoner er beskrevet. Vi viser at cellene kan bli overtalt til å produsere elastin under disse forholdene. Endelig vurdering av de biomekaniske egenskapene til bearbeidede stillasene dyrket med eller uten celler er beskrevet.
Protocol
1. Electrospinning av tilfeldige og alliansefrie Fibre
Electrospinning skaper gode fibrøse nettverk ved hjelp av elektrisk potensial til å tegne en polymer løsning mot jordet oppsamler. Samlere kan være i svært mange former og kan være statisk eller, mer vanlig, roterende. Løsningsmiddelet fordamper før løsningen kommer til solfangeren og jet stivner i en fiber.
Hver polymer krever sitt eget sett av betingelser for å produsere en gitt type fiber. Konsentrasjonen av polymer, løsemiddelet, avstanden mellom pumpet løsningen og jordet samleren, den potensielle forskjellen mellom de to, vil hastigheten av roterende solfangeren, strømningshastigheten, temperatur og luftfuktighet hele påvirke electrospinning. Det er mange studier som beskriver valg av electrospinning parametere og hvordan disse påvirker stillasene produsert (f.eks fiber diameter, morfologi, og orientering). 5, 6, 7, 8I disse eksperimentene stillasene ble skilt basert på betingelser som er valgt i våre tidligere studier. 2, 9
Følgende metoder er egnet for produksjon av electrospun stillasene fra PLGA, poly melkesyre (PLA), poly ε-caprolactone (PCL) og poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate (PHBV) ved hjelp av en roterende solfangeren som vist i Figur 1. Gjennom løsemiddel diklormetan (DCM) brukes. Metoden her produserer microfibrous PLGA, PLA og PCL og nanofibrous PHBV stillas med mikro-sized perler ('perlekjede' morfologi).
- Smør roterende spindel kollektoren med aluminiumsfolie, med polerte / blanke siden vendt utover. Vår dor var 20 cm bred, og 10 cm i diameter.
- Forbered polymer-løsninger; PLA, PCL og PHBV er laget som en 10 vekt% løsning i DCM. PLGA består som en 20 vekt% løsning i DCM.
- Place 4 sprøyter av 5 ml volum på en sprøytepumpe. Sprøyter er lastet til contain 5 ml av polymer hver, noe som gir 20 ml totalt.
- For PLA, PCL og PHBV bruke en strømningsrate på 40 μLmin -1 per sprøyte.
- For PLGA bruke en strømningsrate på 30 μLmin -1 per sprøyte.
- For PLA, PCL og PLGA bruke en fungerende avstand på 17 cm fra nålespissen til dor.
- For PHBV bruke en arbeidsavstand på 10 cm fra nålespissen til dor.
- Lad sprøyten nåler til 17000 V (73 030 P, Genvolt, Shropshire, Storbritannia) og electrospin fra den riktige avstanden på aluminiumsfolie belagt dor.
- For tilfeldige fibre roter dor ved 200 rpm.
- For justert fibre roter dor ved 1000 rpm.
- Stillasene kan lagres på aluminiumsfolie under tørre forhold. Anbefalt lagringstemperatur er i en lukket beholder ved 4 ° C i nærvær av tørkemiddel. Vår erfaring stillasene være stabilt i minst 4 måneder (muligens mye lenger) under disse forholdene (vi er ikke klar over noen pukaster av studier på langsiktige lagringsforhold for stillasene).
2. Produksjon av komplekse Stillaser ved sekvensielle Spinning
Sekvensielle spinnende gir en metode for å kombinere egenskapene til ulike materialer for å lage et materiale som har det beste av begge eiendommene. PHBV produserer en flat, tett, sprøtt ark mens PLA eller PCL spinnende produserer lav tetthet elastiske ark. Begge materialene støtte celle vedlegg. Fortløpende spinne materialene resulterer i en tett celle-ugjennomtrengelig hinne som er elastisk.
- Sett opp electrospinning riggen som per § 1, med PHBV spinnende forhold.
- Electrospin PHBV som ovenfor.
- Uten å endre aluminiumsfolie, electrospin en andre polymer on-top med parameterne og normale betingelser for at polymer (f.eks 17 cm trommel til p, 17000 V, 200 rpm for PLA). Denne additiv prosess bygger opp et dobbelt lag av stillas produsere en bilayer.
3. Produksjon av mangefargede Stillaser ved annealing Flere lag sammen
- Stillasene kan flere lag gjennom bruk av varme annealing. For å gjøre dette 4 ark med PLGA plasseres oppå hverandre og deretter varme glødet ved 60 ° C i 3 timer.
- Stillasene kan også glødet av damp annealing. Her 4 ark med PLGA plasseres oppå hverandre og suspendert 2 cm over en pool av DCM (10 ml) i 1 time. Dette gjøres i en lukket beholder ved romtemperatur.
4. Aseptisk Produksjon og Postproduction Sterilisering av Electrospun Stillaser
- Aseptisk stillas produksjon kan oppnås ved electrospinning i en aseptisk miljø med en laminær hette inne i et rent rom miljø. For å gjøre dette enten sterile polymerer av medisinsk karakter eller polymerer sterilisert ved inkubasjon i DCM kan brukes. Når oppløst, er polymerer electrospun på sterile folie surret rundt somterilised dor. Stillasene er så håndteres aseptisk. Sterilitet er bekreftet av inkubere prøver av stillaset i antibiotika-frie vekstmedier for den aktuelle perioden.
- For etanol desinfeksjon (dette er i bruk eksperimentelt, men er ikke en anerkjent metode for sterilisering, som kunne tas til klinikken) Stillasene er plassert kort (15 min) i en 70% v / v løsning av etanol i destillert vann. For praktiske eksperimentelle formål dette er vanligvis tilstrekkelig for å desinfisere stillaser slik at de deretter kan kombineres med hell med dyrkede celler.
- For pereddiksyre sterilisering Stillasene er nedsenket i pereddiksyre (0,1% v / v i fosfatbufret saltvann (PBS)) og inkubert i 3 timer ved romtemperatur som beskrevet i Selim et al. 9
- For gamma sterilisering Stillasene er bestrålt med en dose på 3 kGy bruke et cesium kilde som beskrevet i Selim et al. 9
5. Biomekanisk Testing av Stillaser
- Stillasene er kuttet i firkanter 5 mm x 20 mm, målt for tykkelse ved hjelp av en mikrometer, og plasseres i en Bose Electroforce 3100 instrument. Denne maskinen bruker en kraft på 0-22 N opp til en forskyvning av 6mm og plotter last vs forskyvning som en stress / belastning kurve. Dette gjør at Youngs modulus og elastisitet skal beregnes.
6. Visualisering Celler på Stillaser og vurdering ECM Produksjon
Celler kan farges med vitale fluorescerende fargestoffer som brukes til å se cellene på stillasene som de fester, vandrer og sprer. Post kulturen tilstedeværelse av celler på stillasene kan bestemmes ved farging for cellekjerner med 4 ',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Produksjonen av ECM av celler på stillaset kan vurderes ved farging celler for en rekke ECM proteiner inkludert elastin, som vist i dette eksemplet. Alle stillaser som brukes ble målt til å ha entykkelse på minst 0,2 mm og skjær i firkanter 1,5 cm x 1,5 cm før såing.
I disse studiene menneskelige dermale fibroblaster er brukt gjennom på grunn av den rollen de spiller i bløtvevet gjenoppbygging som er vårt laboratorium primære forskningsinteresse.
Cellene er hentet fra huden prøver fra pasienter som gjennomgår elektiv kirurgi for brystreduksjon eller mageplastikk (samtykke ble gitt for vev deres skal brukes til forskningsformål). Vev samles inn og brukes anonymt under Forskning Tissue Bank Licence 12179. Vev er vasket med PBS som inneholder streptomycin (0,1 mg / ml) og penicillin (100 IE / ml) og amfotericin B (0,5 mikrogram / ml). Vevsprøver inkuberes i 0,1% w / v trypsin og 0,1% glukose i PBS (12-18 timer, 4 ° C). Dermis er skrellet av, hakket fint og inkubert med 10 ml collagenase (0,5% w / v i DMEM og 10% FCS, 37 ° C i 18 timer). Sentrifugering av de resulterende cellen suspension (400 g for 10 minutter), produserer en pellet av celler som kan dyrkes og subcultured i DMEM supplert med kalvefoster serum (FCS, 10% v / v), streptomycin (0,1 mg / ml), penicillin (100 IE / ml) og amfotericin B (0,5 mikrogram / ml). Bare fibroblaster av passasje 4-9 brukes i forsøk.
- Menneskelige dermale fibroblaster, gang konfluent i en T75 (EasyFlask, Nunc, New York, USA) er seedet ved å legge trypsin / EDTA (5 ml, 5 mg / ml trypsin, 2 mg / ml EDTA i saltvann), ruger i 5 minutter ved 37 ° C. Suspensjonen sentrifugeres i 10 minutter (150 g). Cellene er resuspendert i 5 ml DMEM (supplert med FCS (10% v / v), streptomycin (0,1 mg / ml), penicillin (100 IE / ml) og amfotericin B (0,5 mikrogram / ml)), og regnet med en haemocytometer, og konsentrasjonen er justert for seeding. Cellene blir normalt seedet på 50.000 celler per brønn.
- Om nødvendig, før såing celler på stillaset, kan cellene være pre-merket ved hjelp CellTracker rød eller grønn. Cellens er vasket med 3 x 5 ml PBS. En løsning av 10 mM CellTracker i serum gratis, celle-passende, medium (10 ml) tilsettes og cellene blir inkubert i 45 minutter ved 37 ° C. Etter inkubasjon, blir cellene vasket i 3 x 5 ml PBS følgende som de er seedet på stillasene. Etter denne overflaten av stillasene kan avbildes i en Axon ImageExpress mikroskop (molekylære enheter, Sunnyvale, USA) ved 570 nm λex - 620 nm λem (CellTracker rød) og 480 nm λex - 533 nm λem (CellTracker grønn). For å undersøke utbredelsen av cellene dypere inn i stillasene en multiphoton confocal mikroskop kan brukes. Dette kan oppnå rundt 200 micron penetrasjon inn i de fleste stillasene med eller uten celler.
- Poste kultur prøvene er løst i 1 ml 3,7% formaldehyd i PBS ved 37 ° C i 20 minutter og deretter vasket med 3 x 1 ml PBS.
- 200 mL av elastin primære antistoffer blir lagt til hver prøve (5% v / v i PBS, kanin anti-humane alfa Elastinn, AbDserotec, Kidlington, Storbritannia) og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
- Prøver er vasket med 3 x 1 ml PBS og deretter inkubert i en løsning av sekundær antistoff (0,5% v / v geit anti-kanin IgG (FC): FITC) i PBS som inneholder DAPI (1 mikrogram / ml) i 30 minutter.
- Etter denne prøvene er vasket med 3 x 1 ml PBS.
- DAPI og sekundære antistoff farget prøvene blir så fotografert på en Axon ImageExpress fluorescerende mikroskop, 365 nm λex - 460 nm λem for DAPI og 480 nm λex - 533 nm λem for den sekundære antistoff. DAPI flekker kjernene og gjør det interessant å se fordelingen av celler i løpet av fibrene veldig lett.
7. Underkaste Celler på Stillaser til Biaxial Dynamic Conditioning
For å undersøke effekten av dynamiske condition på fibroblast ECM produksjonen vi utviklet en enkel proof-of-concept bioreaktor å utforske dette.
- Monter ballong og flytregulering apparater og forberede systemet slik at det lett kan plasseres inn i et sterilt fartøy egnet for cellekultur når den er belagt.
- Autoklaver apparatet inkludert ballong (122 ° C, 220 mBar for 1 time). Vi kan bekrefte at ballonger overleve autoklavering uten negativ innvirkning deres funksjon ved å blåse og slippe ut luft dem gjentatte ganger.
- I et rent rom, pakker ut apparatet i en laminær hette i posisjon til å være electrospun på.
- Blås opp ballongen til ønsket areal (husk ballongen fortsatt behov for å passe inn i kulturen fartøy) med fosfatbufret saltvann og koble PBS til en elektrisk jord på et punkt i apparatet som ikke trenger å være steril (grenrør på 3-veis kran).
- Electrospin ønsket polymer på ballongen ved hjelp av vanlige roterende forhold, med en arbeidsavstand på 10 cm. La stillaset tørke i en time. De «våt» fibrene er "sticky" nok til å forholde seg til surfess av ballongen uten senere demontering.
- Plasser ballong inn i en steril fartøy og transportere den til en laminær hette egnet for cellekultur.
- Fjern ballongen fra fartøyet og sted på en steril overflate (petriskål) og gjentatte ganger (hvert 20. sekund) pipetter en celle suspensjon (1 x 10 6 celler i 5 ml DMEM) på den belagte ballongen i 20 minutter for å forsøke å distribuere cellene jevnt over overflaten.
- Plasser ballong inn i kulturen fartøy, og legg forvarmet media egnede til celletype.
- Koble inflasjon apparat til sprøytepumpe (Kent Scientific, Genie Plus, Connecticut, USA) og blås / deflatere ballongen som kreves for å gi toaksiale distensjon. En datastyrt sprøytepumpe kan brukes til å oppnå en mer kompleks distensjon regime.
8. Representative Resultater
Følgende tall er representative resultater som kan forventesDersom de ovennevnte metodene blir fulgt.
Electrospinning kan utnyttes til å skape stillasene med tilfeldige og ordnet arkitekturer (figur 1), er dette repeterbare og fibrene er uniform. Mange typer polymerer kan electrospun med kjennetegn som kan variere betydelig, som vist i figur 2 for PHBV, PLA eller PCL. Electrospinning kan produsere lys fluffy stillasene eller tette celle ugjennomtrengelige membraner (se figur 3). Alle stillasene vist her tilrettelagt celle vedlegg og spredning. Tidligere arbeid har vist at cellene kan migrere gjennom disse stillasene opp til en dybde på minst 500-600 mikrometer 9 For PLA gjennomsnittet fiber diameter er 3 mikrometer,. For PHBV er det 0.3μm med perler som spenner fra 5-20 mikrometer, for PCL er det tre mikrometer, og for PLGA er det 11 mikrometer. Andre studier med andre løsemiddel systemer rapporterer at PHBV kan være electrospun som fibre uten perler eller polymer perler. 10,11
<p class = "jove_content"> Hvis tykkere Stillasene er nødvendig damp og varme annealing kan benyttes til anneal lag av stillasene sammen (se figur 4). Disse stillaset lagene ikke delaminate og det kan være svært vanskelig å finne krysset mellom lagene.Vi viser at bilayer membraner kan gjøres hvor cellene A og B kan hvert dyrkes på en egen membran uten intermingling som vist i figur 5. Her har vi demonstrere dette ved hjelp av menneskelige dermale fibroblaster farget med to ulike fluorescerende celle tracker fargestoffer. En slik bilayer membran vil være nyttig når dyrking celler til å danne en hardt vev som bein eller brusk på den ene siden skilles fra celler designet for å danne en myk (og vanligvis raskere voksende) vev på den andre siden som ganespalte reparasjon eller rekonstruktiv periodontal kirurgi. 12, 13
Med hensyn til virkningen av sterilisering på electrospun stillasene vi hartidligere rapportert at steriliseringsmetode virkninger på stillaset og påfølgende cellekultur. 9 Dette er illustrert i figur 6 som viser effektene av pereddiksyre, gammastråling og etanol på fiber diameter og ultimate strekkstyrke og Youngs modulus av en PLGA stillas .
Gammastråling har ingen signifikant effekt på fiber diameter mens pereddiksyre og etanol redusere fiber diameter med ca 50%. Med hensyn til endelig strekkfasthet hver av metodene for sterilisering endret ultimate strekkstyrke og elastisitet av stillaser. Kultur av celler på disse stillasene ytterligere redusert ultimate strekkspenninger, men økt elastisitet.
Endelig er en metode for å teste effekten av dynamiske toaksiale distensjon på celler dyrket på electrospun stillasene presentert. Dette proof-of-concept tilnærming viser at cellene forblir levedyktig under dynamiskdistensjon men også produserer økte mengder av elastin under disse forholdene. Dette i kontrast til mangelen på elastin når de samme cellene på samme stillaset er opprettholdt under statiske betingelser (se figur 7).
Figur 1. Viser en tegneserie av en electrospinning rigg og spinning av tilfeldige og parallelle fibre og deretter lag av fibre plassert over hverandre. Vinkelrette fiber kan lages ved electrospinning et sett av sammenstilte fibre på aluminiumsfolie, rotere folie med 90 ° og deretter umiddelbart electrospinning et ekstra sett av sammenstilte fibre på toppen av disse.
Figur 2. Viser morfologi av tilfeldige electrospun matter av (A) PLA (skala bar er 100 mikrometer), (B) PHBV (skala bar er 100 mikrometer), (C) PCL (skala bar er 100 mikrometer) og (D) PLGA (skala bar er 200 mikrometer). Vær oppmerksom på at PLA, PCL og PLGA er alle microfibrous ensartede stillaser. PHBV er spunnet som en "perlekjede" med nanofibre forbinder 5-20 mikrometer store perler. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Produksjon av en flerlags stillas. Her Stillasene er opprinnelig spunnet bruker PHBV og deretter sprøyter fylt med PLA eller PCL brukes. Disse er spunnet på toppen av PHBV stillaset. Figuren viser utseendet av disse mangefargede stillasene, (A) En enkelt PHBV lag, (B) et tverrsnitt av en PHBV-PLA bilayer, viser den tette nanofibrous, "perlekjede" PHBV lag (til venstre) og mer åpen microfibrous PLA lag (til høyre) og (C) En enkelt PLA lag.nk "> Klikk her for å se større figur.
Figur 4. Tykkere stillasene kan produseres av varme annealing og damp annealing. (A) og (B) viser en snitt gjennom en damp annealed PLA stillas der innledende fibrøse stillasene på ca 150 mikrometer er blitt plassert sammen og diklormetan damp brukes til å lage mye tykkere stillasene opp til 500 mikrometer. I (C) og (D) kan man se at stillaset består av lag med mye tykkere fibre ispedd lag av tynnere fibre laget av varmen annealing lag av tynne og tykke fibre sammen. Denne tilnærmingen kan brukes til å produsere stillasene av komplekse mekaniske egenskaper. Klikk her for å se større figur .
Fi Gure 5. Utseende av celler i et bilayer stillas. I alle tilfeller cellene til stede er menneskelige dermale fibroblaster. (A) Fibroblaster på electrospun PLA, der cellene er løst og farget med DAPI. (B) DAPI fargede celler på PHBV. I (C) de fibroblaster er pre-beiset med en vital fargestoff, CellTracker grønt, og du kan se utseendet av dem på PLA siden av bilayer. (D) En seksjon gjennom bilayer med røde flekker fibroblaster på nedre PHBV overflaten og grønne beisede fibroblaster på øvre PLA overflaten. (E) Fibroblaster pre-beiset med CellTracker rød dyrkes på PHBV overflaten. Bruken av vitale fluorescerende fargestoffer gir en praktisk metode for å se på fordelingen av celler på skafottet, mens cellene vokser fortsatt. Man kan rutinemessig bruke disse fargestoffer i minst 7 dager. Men konsentrasjonen av fargestoff blir fortynnet som cellene deler seg. Skala linjene er lik 0,1 mm.g6.jpg "alt =" Figur 6 "/>
Figur 6. Biomekaniske egenskaper electrospun stillaset blir innhentet ved hjelp av et Bose Electroforce tensiometer enhet (A). (B) stress / påkjenning kurvene i PLGA stillasene sterilisert med gammastråling, alkohol, pereddiksyre, eller aseptisk produsert. Tre målinger kan fås fra et slikt diagram: den ultimate strekkspenninger (UTS) som fiber kan bli utsatt før den bryter, den ultimate strekk belastning og Youngs modulus. Sistnevnte gir en indikasjon på elastisitet av stillaset. (C) Virkningen av hver steriliseringsmetode på PLGA fiber diameter i mikrometer. Hver sterilisering metodikk redusert UTS. Både pereddiksyre og gammastråling redusere Youngs modulus gir en mer elastisk stillas, gjør alkohol stillaset spesielt sprø. Klikk her for å se større figur .Figur 7. Denne figuren viser bruken av en enkel ballong for å gi en toaksiale bioreaktor som stillasene (og celler som vokser innenfor stillasene) kan bli utsatt for toaksiale distensjon i perioder. (A) En deflatert ballong inn som electrospun fiber, PHBV, er blitt deponert. På dette stadiet ballongen er delvis dekket med fibre. (B) En ballong fullt belagt med PHBV og PLA fibre. (C) En cellesuspensjon er gjentatte ganger pipetteres på ballongen. (D) En ballong plassert i en flaske av sterile medier hvor ballongen er koblet til en sprøyte pumpe og PBS (brukt som en ledende elektrolytt) brukes for å forsiktig blåse og tillate deflasjon av ballongen mot en programmert tidsplan. (E) Celler på stillasene blir fjernet fra ballongen på slutten av eksperimentet og analyse foretatt for celleviabilitet vist i (F) hvor levedyktige celler utvikle en mørk blå farge ved hjelp av metabolsk indicator 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide. (G) viser at celler (blå) dyrkes på denne ballongen og underlagt toaksiale distensjon utvikle elastin fiber (grønn, beiset med elastin spesifikke antistoffer), mens de samme cellene på en identisk stillas (H) dyrkes under statiske betingelser ha ubetydelig elastin produksjon . Skala linjene er lik 0,025 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electrospinning er en meget populær teknikk for å produsere stillasene for tissue engineering. 14, 15, 16 mens det er relativt enkelt å produsere grunnleggende electrospun stillasene for eksperimentell bruk teknikken er også komplekse og mangefasetterte med mange variabler. 6 Det er mange studier som beskriver hvordan electrospinning parametre bestemme stillaset produsert. I denne studien er fokus på det betydelige utfordringer innlegget produksjonen å gjøre stillasene av hensiktsmessige arkitekturer og mekaniske egenskaper og for å oppmuntre celler i dem å gjøre ekstracellulære proteiner for å oppnå vev passform for implantasjon i mennesket.
Vårt mål i denne artikkelen er å beskrive metoder for å utruste leserne til å utforme og karakterisere stillasene for et bredt spekter av formål. I denne artikkelen beskriver vi metoder for å lage komplekse og tykkere stillasene og å sterilisere stillaser for eksperimentell og klinisk bruk. Vi har også beskrive avbildning calen på stillaser og induksjon av elastin fiber produksjonen ved å utsette cellene for å toaksiale distensjon.
Mange av de ønskede funksjonene i stillasene kan oppnås post-produksjon (for eksempel annealing flere lag) og sterilisering. Men disse i sin tur vil påvirke de mekaniske egenskapene til stillasene. Vi rapporterer at sterilisering metoder alle en tendens til å forandre ultimate strekkstyrke og Youngs modul i varierende grad. En fersk studie fra vår gruppe sammenlignet gammastråling, pereddiksyre og etanol for deres effekter som potensielle sterilisering regimer for PLGA stillasene 9 Den uheldige virkninger av sterilisering teknikker kan unngås ved å produsere stillaser under aseptiske forhold -. Sistnevnte krever bruk av et renrom . Ulike brukere kan velge ulike metoder, men alle bør være klar over at dagens sterilisering metoder vil virke negativt på egenskapene til stillasene.
C ulture av celler på stillasene påvirker også stillaser 'Choice mekaniske egenskaper. Induksjon av ECM produksjon ved å utsette cellene på stillasene til toaksiale distensjon kan brukes til å påvirke de mekaniske egenskapene.
Metodikken med å spinne en stillas over en annen til å gjøre en bilayer membran er lett forståelig og vi beskrive bilayer stillasene som tåler to ulike populasjoner av celler illustrert i denne artikkel av pre-merking celler med to vitale celle tracker fargestoffer. Disse ble brukt til å illustrere at bilayer membranen oppnådd sin oppgitte formål.
Endelig budsjett toaksiale distensjon rigg beskrevet i denne studien kan brukes til å levere en rekke regimer. Syklisk, lineær, og tilfeldige regimer kan lett programmeres og brukes. Denne allsidigheten vil tillate at systemet skal benyttes for mange av de problemene i tissue engineering for eksempel, ganespalte, bekkenbunn, blære, og hud.
"> I tissue engineering litteratur bruk av enaksede testsystemer for dyrking celler på stillasene er rapportert. 4 Men vi kunne ikke finne noen publisert litteratur om hvordan myke vev reagerer på toaksiale distensjon. Denne enkle tilnærmingen viser at cellene reagerer på toaksiale distensjon med produksjon av elastin -. en nøkkelkomponent i ekstracellulær matrix som gir myke vevet elastisk rekyl Dette gir en klar indikasjon på hvordan condition bløtvev som de vokser i laboratoriet tilbyr en rute til å produsere vev egnet for implantasjon for områder kroppen der de innfødte vev har egenverdi elastisitet. Dette er et område hvor videre utvikling vil helt klart bli fortjente av tissue engineering samfunnet og bioreaktor produsenter.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker BBSRC for finansiere en doktorgrad for Mr. Frazer Bye.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly lactic-co-glycolic acid | Sigma Aldrich | ||
| Poly lactic acid | Sigma Aldrich | 81273 | Inherent viscosity ~2.0dl/g |
| Poly ε-caprolactone | Sigma Aldrich | ||
| Poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate 12:1 | Goodfellow | 578-446-59 | PHB88/PHV12 |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich or Fisher | 270997 or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150ppm amylene stabiliser |
| 50 multi coloured balloons | Wilkinson’s Hardware Stores Ltd. | 0105790 | |
| Goat anti-rabbit IgG (FC):FITC | AbDserotec | STAR121F | |
| Rabbit anti-human alpha elastin | AbDserotec | 4060-1060 | |
| Screw Cap GL45 PP 2 Port, pk/2 | SLS | 1129750 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma Aldrich | 32670 | |
| CellTracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| CellTracker red CMTX | Invitrogen | C34552 |
References
- Canton, I., McKean, R., Charnley, M., Blackwood, K., Fiorica, C., Ryan, A., MacNeil, S. Development of an Ibuprofen-releasing biodegradable PLA/PGA electrospun scaffold for tissue regeneration. Biotechnology and bioengineering. 105, 396-408 (2010).
- Blackwood, K., McKean, R., Canton, I., Freeman, C., Franklin, K., Cole, A., Brook, I., Farthing, P., Rimmer, S., Haycock, J., Ryan, A., MacNeil, S. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
- Yang, F., Maurugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).
- Sittichokechaiwut, A., Edwards, J. H., Scutt, A. M., Reilly, G. C. Short bouts of mechanical loading are as effective as dexamethasone at inducing matrix production by human bone marrow mesenchymal stem cell. Eur. Cell Mater. 20, 45-57 (2010).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Deitzel, J., Kleinmeyer, J., Harris, D., Beck Tan, N. C. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer. 42, 261-272 (2001).
- Fridrikh, S., Yu, J., Brenner, M., Rutledge, G. Controlling the fiber diameter during electrospinning. Physical review letters. 90, 1-4 (2003).
- Fong, H., Chun, I., Reneker, D. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40 (16), 4585-4592 (1999).
- Selim, M., Bullock, A. J., Blackwood, K. A., Chapple, C. R., MacNeil, S. Developing biodegradable scaffolds for tissue engineering of the urethra. BJU Int. 107 (2), 296-302 (2010).
- Tong, H. -W., Wang, M. An investigation into the influence of electrospinning parameters on the diameter and alignment of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibers. Journal of Applied Polymer Science. 120 (3), 1694-1706 (2011).
- Tong, H. -W., Wang, M. Electrospinning of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibrous tissue engineering scaffolds in two different electric fields. Polymer Engineering & Science. 51 (7), 1325-1338 (2011).
- Retzepi, M., Donos, N. Guided Bone Regeneration: biological principle and therapeutic applications. Clinical oral implants research. 21, 567-576 (2010).
- Moreau, J., Caccamese, J., Coletti, D., Sauk, J., Fisher, J. Tissue engineering solutions for cleft palates. Journal of oral maxillofacial. 65, 2503-2511 (2007).
- Yang, F., Both, S., Yang, X., Walboomers, X., Jansen, J. Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application. Acta biomaterialia. 5, 3295-3304 (2009).
- Yoshimoto, H., Shin, Y., Terai, H., Vacanti, J. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Telemeco, T., Ayres, C., Bowlin, G., Wnek, G., Boland, E., Cohen, N., Baumgarten, C., Mathews, J., Simpson, D. Regulation of cellular infiltration into tissue engineering scaffolds composed of submicron diameter fibrils produced by electrospinning. Acta biomaterialia. 1, 377-385 (2005).
