Summary
Electrospun ställningar kan bearbetas postproduktion för applikationer vävnadsteknik. Här beskriver vi metoder för spinning komplexa ställningar (med följd spinning), för att göra tjockare ställningar (med flera lager med värme eller ånga glödgning), för att uppnå sterilitet (aseptisk produktion eller sterilisering postproduktion) och för att uppnå lämpliga biomekaniska egenskaper.
Abstract
Electrospinning är en vanligen använd och mångsidigt förfarande för framställning av byggnadsställningar (ofta nedbrytbara) för 3D vävnadsteknik. 1, 2, 3 Många vävnader in vivo genomgå biaxiell utspändhet i varierande grad såsom hud, urinblåsa, bäckenbotten och även den hårda gommen som barn växa. Vid framställning av byggnadsställningar för dessa ändamål finns det ett behov av att utveckla ställningar på lämpliga biomekaniska egenskaper (även uppnås utan eller med celler) och som är sterila för klinisk användning. Fokus för denna uppsats är inte hur man införa grundläggande electrospinning parametrar (som det finns omfattande litteratur om electrospinning) utan på hur du ändrar spunna ställningar postproduktion för att göra dem lämpliga för ändamål vävnadstekniska - här tjocklek, mekaniska egenskaper och sterilisering (krävs för klinisk användning) anses vi beskriver också hur celler kan odlas på ställningar och utsattes för biaxiell töjning för att konditionera dem för specifika applikationer.
Electrospinning tenderar att producera tunna ark, som electrospinning kollektor blir belagd med isolerande fibrer blir en dålig ledare, så att fibrerna inte längre insättning på den. Därför beskriver vi förhållningssätt för att åstadkomma tjockare strukturer genom värme eller ånga glödgning öka styrkan av byggnadsställningar, men inte nödvändigtvis elasticitet. Sekventiella spinning av byggnadsställningar av olika polymerer för att uppnå komplexa ställningar beskrivs också. Sterilisering metoder kan negativt påverka hållfastheten och elasticiteten av byggnadsställningar. Vi jämför tre metoder för deras effekter på de biomekaniska egenskaperna för electrospun ställningar av poly mjölk-sam-glykolsyra (PLGA).
Avbildning av celler på ställningar och bedömning av produktion av extracellulär matris (ECM)-proteiner från cellerna på ställningar beskrivs. Odling av celler på byggnadsställningar in vitro kan förbättra ställningen styrka och elasticitet, men tissue engineering literatuRe visar att cellerna ofta misslyckas med att generera lämpliga ECM när de odlas under statiska förhållanden. Det finns få kommersiella system tillgängliga som tillåter en att odla celler på ställningar under dynamiska luftkonditionering regimer -. Ett exempel är Bose ElectroForce 3100 som kan användas för att utöva en konditionering program på celler i ställningar som innehas med mekaniska grepp inom media fylld kammare 4 Ett förhållningssätt till en budget cellodling bioreaktor kontrollerad distorsion i 2 dimensioner beskrivs. Vi visar att celler kan induceras till att producera elastin under dessa betingelser. Slutligen bedömning av de biomekaniska egenskaperna hos bearbetade byggnadsställningar odlade med eller utan celler beskrivs.
Protocol
1. Electrospinning av slumpmässiga och Aligned fibrer
Electrospinning skapar fina fibrösa nätverk med elektrisk potential att dra en polymerlösning mot en jordad samlare. Samlare kan vara i många former och kan vara statisk eller, vanligare, att rotera. Lösningsmedlet avdunstar innan lösningen anländer till samlare och strålen stelnar till en fiber.
Varje polymer kräver sin egen uppsättning av betingelser för framställning av en given typ av fiber. Koncentrationen av polymeren, lösningsmedlet, avståndet mellan den pumpade lösning och den jordade kollektor potentialskillnaden mellan de två, kommer hastigheten hos den roterande kollektor, flödeshastigheten, temperaturen och fuktigheten påverkar alla electrospinning. Det finns många studier som beskriver valet av electrospinning parametrar och hur dessa effekter på de producerade ställningar (t.ex. fiberdiameter, morfologi och orientering). 5, 6, 7, 8I dessa försök ställningar spanns baserat på villkor som valts i våra tidigare studier. 2, 9
Följande metoder är lämpliga för framställning av electrospun ställningar från PLGA, polymjölksyra (PLA), poly ε-kaprolakton (PCL) och poly hydroxibutyrat-sam-hydroxivalerat (PHBV) med användning av en roterande kollektor som visas i figur 1. Hela lösningsmedlet diklormetan (DCM) används. Metoden Här producerar mikrofibrösa PLGA, PLA och PCL och nanofibrous PHBV Ställningen med mikro-storlek pärlor ("pärlhalsband" morfologi).
- Belägga roterande dorn kollektor med aluminiumfolie, med den polerade / blank sida som är vänd utåt. Vår dornen var 20 cm brett och 10 cm i diameter.
- Framställa polymerlösningar, PLA-, PCL och PHBV är uppbyggd som en 10 vikt-% lösning i DCM. PLGA är uppbyggd som en 20 vikt-% lösning i DCM.
- Plats 4 sprutor 5 ml volym på en sprutpump. Sprutor laddas till contain 5 ml av polymerlösningen var och en, vilket ger 20 ml totalt.
- För PLA, PCL och PHBV använda en flödeshastighet av 40 μLmin -1 per spruta.
- För PLGA använda en flödeshastighet av 30 μLmin -1 per spruta.
- För PLA, PCL och PLGA använda ett arbetsavstånd av 17 cm från nålspetsen till dornen.
- För PHBV använder en arbetsgrupp avstånd av 10 cm från nålen tips till dom.
- Ladda kanyler till 17.000 V (73.030 P, Genvolt, Shropshire, Storbritannien) och electrospin från lämpligt avstånd på aluminiumfolie belagda dorn.
- För slumpmässiga fibrer rotera dornen vid 200 rpm.
- För inriktade fibrer rotera dornen vid 1000 rpm.
- Byggnadsställningar kan lagras på aluminiumfolien under torra förhållanden. Rekommenderas lagring sker i en sluten behållare vid 4 ° C i närvaro av torkmedel. Enligt vår erfarenhet ställningar förblir stabila i minst 4 månader (eventuellt mycket längre) under dessa förhållanden (vi känner inte till någon published studier på lång sikt lagringsförhållanden för byggnadsställningar).
2. Produktion av komplexa Byggnadsställningar av sekventiella Spinning
Sekventiella spinning erbjuder en metod att kombinera egenskaperna hos olika material för att skapa ett material som har det bästa av båda egenskaperna. PHBV ger en platt, tät, spröda blad medan PLA-eller PCL-spinning ger låg densitet elastiska ark. Båda materialen stödja cellvidhäftning. Följd spinning dessa material resulterar i en tät cell-ogenomträngligt membran som är elastisk.
- Ställ in electrospinning riggen enligt avsnitt 1, med PHBV spinning förhållanden.
- Electrospin PHBV som ovan.
- Utan att ändra aluminiumfolie, electrospin en andra polymer på toppen med hjälp av parametrar och normala villkor för att polymer (t.ex. 17 cm trumma till st, 17000 V, 200 rpm för PLA). Denna tillsats process bygger upp ett dubbelt lager av ställningen producera ett dubbelskikt.
3. Produktion av flerskiktiga Ställningar av Annealing Flera skikt tillsammans
- Ställningar kan vara flerskiktat genom användning av värme glödgning. För att göra detta 4 ark av PLGA är placerade ovanpå varandra och därefter värmebehandlades glödgades vid 60 ° C under 3 timmar.
- Byggnadsställningar kan också glödgas av ånga glödgning. Här 4 ark av PLGA placeras ovanpå varandra och suspenderades 2 cm ovanför en pool av DCM (10 ml) under 1 timme. Detta utförs i en förseglad behållare vid rumstemperatur.
4. Aseptisk produktion och postproduktion Sterilisering av Electrospun Byggnadsställningar
- Aseptisk byggnadsställning produktion kan åstadkommas genom electrospinning i en aseptisk miljö i en huv med laminärt flöde inuti en renrumsmiljö. För att göra detta antingen sterila polymerer av medicinsk kvalitet eller polymerer steriliserats genom inkubering i DCM kan användas. När den väl löst, är polymerer electrospun på steril folie lindad runt såsomterilised dornen. Ställningar därefter hanteras aseptiskt. Sterilitet verifieras genom att inkubera prover av ställningen i antibiotika-fria odlingsmedier för den berörda perioden.
- För etanol desinfektion (detta är till nytta experimentellt men är inte en erkänd metod för sterilisering som kan vidtas för att kliniken) byggnadsställningar placeras kort (15 min) i en 70% v / v lösning av etanol i destillerat vatten. Av praktiska experimentsyfte det är oftast tillräckligt för att desinficera ställningar så att de kan sedan kombineras framgångsrikt med odlade celler.
- För perättiksyra ställningar sura sterilisering är nedsänkta i perättiksyra (0,1% volym / volym i fosfat-buffrad saltlösning (PBS)) och inkuberades under 3 timmar vid rumstemperatur såsom beskrivits i Selim et al. 9
- För gammasterilisering ställningar bestrålas med en dos av 3 kGy med användning av en cesiumkälla såsom beskrivits i Selim et al. 9
5. Biomekaniska Provning av byggnadsställningar
- Byggnadsställningar skärs i rektanglar 5 mm x 20 mm, mätt för tjocklek med hjälp av en mikrometer, och placeras i en Bose ElectroForce 3100 instrument. Denna maskin anbringar en kraft av 0-22 N upp till en förskjutning av 6 mm och plottar den belastning mot förflyttning som en spännings / töjningskurvan. Detta medger att Youngs modul och elasticitet som skall beräknas.
6. Visualisera Celler på Byggnadsställningar och bedömning av ECM produktion
Celler kan färgas med vitala fluorescerande färgämnen vilka tillåter en att se celler på de ställningar som de fäster, migrera och föröka sig. Efter odling av närvaron av celler på ställningar kan bestämmas genom färgning för cellkärnor med 4 ',6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI). Framställning av ECM genom celler på ställningen kan bedömas genom att färga celler för en rad av ECM-proteiner, inklusive elastin, såsom visas i detta exempel. Alla använda ställningar mättes ha entjocklek av åtminstone 0,2 mm och skars till fyrkanter 1,5 cm x 1,5 cm före sådd.
I dessa studier humana hudfibroblaster används i hela grund av den roll de spelar i mjuk vävnad återuppbyggnaden som är vårt laboratorium främsta forskningsintresse.
Celler erhålls från hud prover från patienter som genomgår elektiv kirurgi för bröstförminskning och bukplastik (tillstånd gavs för deras vävnad som skall användas för forskningsändamål). Vävnader samlas in och används anonymt under Forskning vävnadsbanken licens 12.179. Vävnaderna tvättades med PBS innehållande streptomycin (0,1 mg / ml) och penicillin (100 lU / ml) och amfotericin B (0,5 jig / ml). Vävnadsprover inkuberas i 0,1% vikt / vol trypsin och 0,1% glukos i PBS (12-18 timmar, 4 ° C). Dermis skalas av, hackades fint och inkuberades med 10 ml kollagenas (0,5% vikt / volym i DMEM och 10% FCS, 37 ° C under 18 timmar). Centrifugering av de resulterande cell-suspensjon (400 g under 10 min), producerar en pellet av celler som kan odlas och subodlades i DMEM kompletterat med fetalt kalvserum (FCS, 10% vol / vol), streptomycin (0,1 mg / ml), penicillin (100 lU / ml) och amfotericin B (0,5 jig / ml). Endast fibroblaster av passage 4-9 används i experiment.
- Humana dermala fibroblaster, en gång sammanflytande i en T75 (EasyFlask, Nunc, New York, US) sås genom tillsats av trypsin / EDTA (5 ml, 5 mg / ml trypsin, 2 mg / ml EDTA i saltlösning), inkubera i 5 min vid 37 ° C. Suspensionen centrifugeras i 10 minuter (150 g). Cellerna återsuspenderades i 5 ml DMEM (kompletterat med FCS (10% volym / volym), streptomycin (0,1 mg / ml), penicillin (100 lU / ml) och amfotericin B (0,5 | ig / ml)) och räknades med användning av en hemocytometer, och koncentrationen justeras för såning. Cellerna såddes normalt vid 50.000 celler per brunn.
- Om så krävs, innan sådd celler på schavotten, kan celler i förväg märkt med CellTracker rött eller grönt. Cellens tvättas med 3 x 5 ml PBS. En lösning av 10 mM CellTracker i serumfritt, är cell-lämpligt, medel (10 ml) tillsattes och cellerna inkuberas under 45 minuter vid 37 ° C. Efter inkubation, tvättas cellerna i 3 x 5 ml PBS, varefter de ympas på ställningar. Efter denna yta av skeletten kan avbildas i ett Axon ImageExpress mikroskop (Molecular Devices, Sunnyvale, USA) vid 570 nm Xex - 620 nm Xem (CellTracker röd) och 480 nm Xex - 533 nm Xem (CellTracker grönt). För att undersöka penetrering av celler djupare in ställningar en multiphoton konfokalt mikroskop kan användas. Detta kan uppnås cirka 200 micron penetration i de flesta ställningar med eller utan celler.
- Posta odlingsprover är fixerade i 1 ml 3,7% formaldehyd i PBS vid 37 ° C under 20 minuter och tvättades sedan med 3 x 1 ml PBS.
- 200 | il av elastin primära antikroppar tillsätts till varje prov (5% vol / vol i PBS, kanin-anti-human alfa elastomertenn, AbDserotec, Kidlington, Storbritannien) och inkuberades vid 37 ° C under 30 minuter.
- Proverna tvättades med 3 x 1 ml PBS och inkuberades sedan i en lösning av sekundär antikropp (0,5% vol / vol get-anti-kanin-IgG (Fe): FITC) i PBS innehållande DAPI (1 pg / ml) under 30 minuter.
- Efter denna proverna tvättades med 3 x 1 ml PBS.
- DAPI och sekundär antikropp färgade prover därefter avbildas på en Axon ImageExpress fluorescensmikroskop, 365 nm Xex - 460 nm Xem för DAPI och 480 nm Xex - 533 nm Xem för den sekundära antikroppen. DAPI fläckar på kärnor och tillåter en att se fördelningen av cellerna i fibrerna mycket snabbt.
7. Utsätta Celler på Byggnadsställningar till Biaxial Dynamic Conditioning
För att undersöka effekten av dynamiska konditionering av fibroblast ECM produktion har vi utvecklat en enkel proof-of-concept bioreaktor att utforska detta.
- Montera ballong och flödereglering anordning och förbereda systemet så att det lätt kan placeras i ett sterilt kärl lämpligt för cellodling när den är belagd.
- Autoklavera varvid anordningen inkluderar ballongen (122 ° C, 220 mbar under 1 timme). Vi kan bekräfta att ballonger överleva autoklavering utan att negativt påverka deras funktion genom uppblåsning och tömning dem gång på gång.
- I ett rent rum, packar anordningen i en huv med laminärt flöde i position för att vara electrospun på.
- Blåsa upp ballongen till den erforderliga ytarean (kom ihåg att ballongen fortfarande måste passa in i odlingskärlet) med fosfatbuffrad saltlösning och ansluter PBS till en elektrisk jord vid en punkt i den apparat som inte behöver vara steril (grenröret på 3-vägskran).
- Electrospin den erforderliga polymeren på ballongen med hjälp av de normala rotationsbetingelserna, med användning av ett arbetsavstånd av 10 cm. Tillåta ställningen torka i 1 timme. Den "våta" fibrer "klibbiga" nog att följa vågornaess av ballongen utan att därefter lossa.
- Placera ballongen i ett sterilt kärl och transportera det till en huv med laminärt flöde lämplig för cellodling.
- Avlägsna ballongen från kärlet och placera på en steril yta (petriskål) och upprepade gånger (var 20: e sekund) Pipettera en cellsuspension (1 x 10 6 celler i 5 ml DMEM) på den belagda ballongen under 20 minuter för att försöka fördela celler jämnt över ytan.
- Placera ballongen i odlingskärlet, och tillsätt förvärmda material lämpliga för celltypen.
- Anslut inflationen apparaten till en sprutpump (Kent Scientific, Genie Plus, Connecticut, USA) och blåsa / tömma ballongen som krävs för att ge biaxiell uttänjning. En datorstyrd sprutpump kan användas för att uppnå en mer komplex uttänjning regim.
8. Representativa resultat
Följande siffror är representativa resultat som kan förväntasom metoderna ovan följs.
Electrospinning kan utnyttjas för att skapa ställningar med slumpmässiga och ordnad arkitekturer (figur 1), är detta repeterbar och fibrerna är enhetliga. Många typer av polymerer kan electrospun med egenskaper som kan variera avsevärt som visas i figur 2 för PHBV, PLA eller PCL. Electrospinning kan ge ljus fluffiga ställningar eller täta cell ogenomträngliga membran (se figur 3). Alla ställningar som visas här underlättas cellvidhäftning och spridning. Tidigare arbete har visat att celler kan migrera genom dessa ställningar upp till ett djup av minst 500-600 m 9 För PLA den genomsnittliga fiberdiametern är 3 m;. För PHBV det är 0,3 pm med pärlor från 5-20 m, för PCL är 3 m, och för PLGA det är 11 nm. Andra studier med andra lösningsmedelsystem rapporterar att PHBV kan vara electrospun som fibrer utan pärlor eller polymer pärlor. 10,11
<p class = "jove_content"> Om tjockare ställningar krävs ånga och värme glödgning kan användas för att härda lager av byggnadsställningar tillsammans (se figur 4). Dessa byggnadsställning lager inte delaminerar inte och det kan vara mycket svårt att hitta korsningen mellan skikten.Vi visar att tvåskiktsmembran kan göras där cellerna A och B vardera kan odlas på ett separat membran utan sammanblandning, såsom visas i figur 5. Här visar vi detta genom att använda humana hudfibroblaster färgade med två olika fluorescerande färgämnen cell tracker. Sådan tvåskiktsmembran skulle vara användbara när man odlar celler för att bilda en hård vävnad såsom ben eller brosk på ena sidan separeras från cellerna för att bilda en mjuk (och vanligtvis snabbare växande) vävnad på den andra sidan, såsom kluven gom reparation eller rekonstruktiv parodontal kirurgi. 12, 13
När det gäller effekterna av sterilisering på electrospun stödstrukturer har vitidigare rapporterats att den steriliseringsmetod effekter på ställningen och efterföljande cellkultur. 9 Detta illustreras i figur 6 som visar effekterna av perättiksyra, gammastrålning och etanol på fiberdiameter och brottgräns och Youngs modul av en PLGA-ställningen .
Gammastrålning har ingen signifikant effekt på fiberdiameter medan perättiksyra och etanol minskar fiberdiameter med cirka 50%. Med avseende på draghållfasthet var och en av de metoder för sterilisering förändrat brottgräns och elasticiteten av skeletten. Odling av celler i dessa ställningar minskas ytterligare den slutliga drag-påkänning, men ökade elasticiteten.
Slutligen är en metod för att testa effekten av dynamisk biaxiell utspändhet på celler odlade på electrospun ställningar presenteras. Denna proof-of-concept strategi visar att cellerna förblir livskraftiga under dynamiskbuk, men också ge ökade mängder av elastin under dessa förhållanden. Detta står i kontrast markant till avsaknaden av elastin när samma celler på samma ställningen hålls under statiska förhållanden (se figur 7).
Figur 1. Visar en tecknad film av en electrospinning riggen och av de snurrande av slumpmässiga och parallellt fibrer och därefter skikt av fibrer placerade över varandra. Vinkelräta fibrer kan skapas genom electrospinning en uppsättning inriktade fibrer på aluminiumfolie, roterande folien genom 90 ° och sedan omedelbart electrospinning en andra uppsättning inriktade fibrer ovanpå dessa.
Figur 2. Visar morfologi av slumpmässiga electrospun mattor av (A) PLA (skala bar är 100 m), (B) PHBV (skala bar är 100 m), (C) PCL (skala bar är 100 pm) och (D) PLGA (Skalstreck är 200 ^ m). Observera att PLA, PCL och PLGA är alla mikrofibrösa enhetliga ställningar. PHBV är spunnen som ett "pärlhalsband" med nanofibrer anslutande 5-20 um storlek pärlor. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Framställning av en flerskiktad byggnadsställning. Här ställningar initialt spinns använder PHBV och sedan sprutor fyllda med PLA eller PCL används. Dessa centrifugerades på toppen av PHBV ställningen. Figuren visar utseendet av dessa flerskiktade ställningar, (A) En enda PHBV lager, (B) Ett tvärsnitt av en PHBV-PLA biskikt, som visar den täta nanofibrous "pärla halsband" PHBV lager (vänster) och öppnare mikrofibrösa PLA lager (höger) och (C) En enda PLA lager.NK "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Tjockare ställningar kan framställas genom upphettning glödgning och ånga glödgning. (A) och (B) visar en sektion genom en ång glödgat PLA byggnadsställning där de ursprungliga fibrösa ställningar på ca 150 ^ m har placerats tillsammans och diklormetan ånga används för att göra mycket tjockare ställningar på upp till 500 pm. I (C) och (D) kan man se att ställningen består av skikt av mycket tjockare fibrer blandade med skikt av tunnare fibrer som skapas genom upphettning glödgning skikt av tunna och tjocka fibrer. Detta tillvägagångssätt kan användas för att producera ställningar av komplexa mekaniska egenskaper. Klicka här för att visa en större bild .
Fi Gure 5. Utseende av celler på ett dubbelskikt ställningen. I samtliga fall är cellerna närvarande humana dermala fibroblaster. (A) fibroblaster på electrospun PLA, där cellerna fixeras och färgas med DAPI. (B) DAPI-färgade celler på PHBV. I (C) fibroblaster är pre-färgat med ett vitalt färgämne, CellTracker grönt och du kan se utseendet på dem på PLA sidan av dubbelskiktet. (D) En sektion genom dubbelskiktet med rödfärgade fibroblaster på den nedre ytan PHBV och gröna färgade fibroblaster på den övre ytan PLA. (E)-fibroblaster före färgades med CellTracker röd odlas på PHBV yta. Användningen av vitala fluorescerande färgämnen ger en bekväm metod för att titta på fördelningen av cellerna på ställningen medan cellerna fortfarande växer. Man kan rutinmässigt använda dessa färgämnen i minst 7 dagar. Men koncentrationen av färgämnet blir utspätt när cellerna delar sig. Skalstrecken är lika med 0,1 mm.g6.jpg "alt =" Bild 6 "/>
Figur 6. Biomekaniska egenskaperna hos electrospun byggnadsställning erhålles med användning av en Bose-ElectroForce tensiometer anordning (A). (B) spänning / töjning-kurvor av PLGA skelett steriliseras med gammastrålning, alkohol, perättiksyra eller aseptiskt producerad. Tre mätningar kan erhållas från en sådan kurva: den slutliga drag-påkänning (UTS), till vilken fibern kan utsättas innan den går sönder, den ultimata dragpåkänning och Youngs modul. Den senare ger en indikation på elasticiteten hos ställningen. (C) Effekten av varje sterilisering metod på PLGA fiberdiameter i pm. Varje sterilisering metodik minskat UTS. Både perättiksyra och gammastrålning minska Youngs modul ger en mer elastisk byggnadsställning gör alkohol ställningen speciellt sprött. Klicka här för att visa en större bild .Figur 7. Denna figur visar användningen av en enkel ballong för att ge en biaxiell bioreaktor där ställningar (och celler växer inom byggnadsställningar) kan utsättas för biaxiell uttänjning under tidsperioder. (A) En tömd ballong på vilken electrospun fibrer, PHBV, har deponerats. I detta skede ballongen är delvis täckt med fibrer. (B) En ballong belagd helt PHBV och PLA fibrer. (C) En cellsuspension upprepade gånger pipetteras på ballongen. (D) En ballong placeras i en flaska av sterila medier när ballongen är anslutna till en sprutpump och PBS (används som en elektrolyt som leder) används för att försiktigt blåsa upp och tillåter tömning av ballongen mot en programmerad schema. (E) Celler på byggnadsställningar som avlägsnas från ballongen vid slutet av experimentet och analys som genomförts för cellviabilitet visas i (F) där levande celler utvecklar en mörkblå färg med hjälp av metaboliska indicator 3 - (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid. (G) visar att celler (blå) odlas på denna ballong och i enlighet med tvåaxlig uttänjning utveckla elastin fibrer (grön, färgade med elastin specifika antikroppar), medan samma celler på en identisk ställning (H) odlas under statiska förhållanden har försumbar elastin produktionen . Skalstrecken är lika med 0,025 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electrospinning är en mycket populär teknik för att producera byggnadsställningar för tissue engineering. 14, 15, 16 Även om det är relativt enkelt att tillverka grundläggande electrospun ställningar för experimentell använda tekniken är också komplex och mångfacetterad med många variabler. 6 Det finns många studier som beskriver hur electrospinning parametrar bestämmer ställningen produceras. I denna studie ligger fokus på de stora utmaningarna efter produktionen att göra ställningar av lämpliga strukturer och mekaniska egenskaper samt uppmuntra celler inom dem att göra extracellulära proteiner för att nå vävnaden passform för implantation i människan.
Vårt mål i denna artikel är att beskriva metoder för att utrusta läsarna att utforma och karakterisera byggnadsställningar för en lång rad ändamål. I den här artikeln beskriver vi metoder för att göra komplexa och tjockare ställningar och att sterilisera ställningar för experimentell och klinisk användning. Vi beskriver också imaging calnar på stödstrukturema och induktion av elastin fiberproduktionen genom att utsätta cellerna för biaxiell uttänjning.
Många av de önskade egenskaperna hos stödstrukturema kan uppnås efter formningen (såsom glödgning flera skikt) och sterilisering. Men dessa i sin tur kommer att påverka de mekaniska egenskaperna hos byggnadsställningar. Vi rapporterar att sterilisering metoder alla tenderar att ändra brottgräns och Youngs modul i varierande grad. En färsk studie från vår grupp jämfört gammastrålning, perättiksyra och etanol för deras effekter som potentiella sterilisering system för PLGA ställningar 9 De negativa effekterna av steriliseringstekniker kan undvikas genom att producera ställningar under aseptiska förhållanden -. Det senare kräver användning av ett renrum . Olika användare kan välja olika metoder men alla bör vara medvetna om att nuvarande sterilisering metoder kommer att påverka negativt på egenskaperna hos byggnadsställningar.
C ulture av celler på ställningar påverkar också ställningar "mekanisk egenskaper. Induktion av ECM-produktion genom att utsätta cellerna för byggnadsställningar till biaxiell utspändhet kan användas för att påverka de mekaniska egenskaperna.
Metoden för spinning en klätterställning över en annan för att göra en tvåskiktsmembran är lätt att förstå, och vi beskriver dubbelskiktsbrytande ställningar som kan stödja två olika populationer av celler som illustreras i detta dokument genom att pre-märkning celler med två vitala färgämnen cell tracker. Dessa användes för att illustrera att tvåskiktsmembranet uppnått sitt angivna ändamålet.
Slutligen budgeten biaxiella buk riggen som beskrivs i denna studie kan användas för att leverera en rad olika regimer. Cykliska, linjära och slumpmässiga regimer kan lätt programmeras och tillämpas. Denna mångsidighet gör det möjligt för systemet att användas för många av de problem som möter vid vävnadsuppbyggnad, såsom gomspalt, bäckenbotten, urinblåsan, och huden.
"> I tissue engineering litteraturen användning av enaxlade testsystem för odling av celler på byggnadsställningar har rapporterats. 4 Men vi kunde inte hitta någon publicerad litteratur som behandlar hur mjuka vävnader svarar på biaxiell uttänjning. Denna enkla metod visar att celler svarar på biaxial utvidgning med produktionen av elastin -. en nyckelkomponent i den extracellulära matrisen som ger mjuka vävnader elastiska rekylen Detta ger en tydlig indikation på hur luftkonditionering mjukdelar när de växer i laboratoriet erbjuder en väg för att producera vävnader lämpliga för implantation för områden med kroppen där de infödda vävnaderna har inneboende elasticitet. Detta är ett område där ytterligare utveckling kommer helt klart vara berättigad av tissue engineering samhället och tillverkare bioreaktor.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar BBSRC för finansiering doktorsexamen för Mr Frazer Bye.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly lactic-co-glycolic acid | Sigma Aldrich | ||
| Poly lactic acid | Sigma Aldrich | 81273 | Inherent viscosity ~2.0dl/g |
| Poly ε-caprolactone | Sigma Aldrich | ||
| Poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate 12:1 | Goodfellow | 578-446-59 | PHB88/PHV12 |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich or Fisher | 270997 or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150ppm amylene stabiliser |
| 50 multi coloured balloons | Wilkinson’s Hardware Stores Ltd. | 0105790 | |
| Goat anti-rabbit IgG (FC):FITC | AbDserotec | STAR121F | |
| Rabbit anti-human alpha elastin | AbDserotec | 4060-1060 | |
| Screw Cap GL45 PP 2 Port, pk/2 | SLS | 1129750 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma Aldrich | 32670 | |
| CellTracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| CellTracker red CMTX | Invitrogen | C34552 |
References
- Canton, I., McKean, R., Charnley, M., Blackwood, K., Fiorica, C., Ryan, A., MacNeil, S. Development of an Ibuprofen-releasing biodegradable PLA/PGA electrospun scaffold for tissue regeneration. Biotechnology and bioengineering. 105, 396-408 (2010).
- Blackwood, K., McKean, R., Canton, I., Freeman, C., Franklin, K., Cole, A., Brook, I., Farthing, P., Rimmer, S., Haycock, J., Ryan, A., MacNeil, S. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
- Yang, F., Maurugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).
- Sittichokechaiwut, A., Edwards, J. H., Scutt, A. M., Reilly, G. C. Short bouts of mechanical loading are as effective as dexamethasone at inducing matrix production by human bone marrow mesenchymal stem cell. Eur. Cell Mater. 20, 45-57 (2010).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Deitzel, J., Kleinmeyer, J., Harris, D., Beck Tan, N. C. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer. 42, 261-272 (2001).
- Fridrikh, S., Yu, J., Brenner, M., Rutledge, G. Controlling the fiber diameter during electrospinning. Physical review letters. 90, 1-4 (2003).
- Fong, H., Chun, I., Reneker, D. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40 (16), 4585-4592 (1999).
- Selim, M., Bullock, A. J., Blackwood, K. A., Chapple, C. R., MacNeil, S. Developing biodegradable scaffolds for tissue engineering of the urethra. BJU Int. 107 (2), 296-302 (2010).
- Tong, H. -W., Wang, M. An investigation into the influence of electrospinning parameters on the diameter and alignment of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibers. Journal of Applied Polymer Science. 120 (3), 1694-1706 (2011).
- Tong, H. -W., Wang, M. Electrospinning of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibrous tissue engineering scaffolds in two different electric fields. Polymer Engineering & Science. 51 (7), 1325-1338 (2011).
- Retzepi, M., Donos, N. Guided Bone Regeneration: biological principle and therapeutic applications. Clinical oral implants research. 21, 567-576 (2010).
- Moreau, J., Caccamese, J., Coletti, D., Sauk, J., Fisher, J. Tissue engineering solutions for cleft palates. Journal of oral maxillofacial. 65, 2503-2511 (2007).
- Yang, F., Both, S., Yang, X., Walboomers, X., Jansen, J. Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application. Acta biomaterialia. 5, 3295-3304 (2009).
- Yoshimoto, H., Shin, Y., Terai, H., Vacanti, J. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Telemeco, T., Ayres, C., Bowlin, G., Wnek, G., Boland, E., Cohen, N., Baumgarten, C., Mathews, J., Simpson, D. Regulation of cellular infiltration into tissue engineering scaffolds composed of submicron diameter fibrils produced by electrospinning. Acta biomaterialia. 1, 377-385 (2005).
