Profiling Veränderungen in Rezeptor Tyrosin Kinase-Phosphorylierung mit Antikörper Arrays - Werbung

Summary

Proteome Profiler Antikörper-Arrays sind eine bequeme und kostengünstige Möglichkeit zum Screening auf Veränderungen in Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) Phosphorylierung ohne Durchführung zahlreicher Immunpräzipitation (IP) Westerns. Die ARY001 Menschliche RTK-Reihe läßt zur qualitativen Messung mehrerer RTKs in einer einzelnen Probe unter Verwendung von Chemilumineszenz-Detektion.

Abstract

Die Fehlregulation von Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) Expression und Phosphorylierung wird häufig mit der Entwicklung und Metastasierung von Krebszellen assoziiert. ^1-3 erhebliche Anstrengungen auf die Entwicklung von Inhibitoren konzentriert auf bestimmte RTKs gezielt unterbrechen die aberrante Signalwege mit der Krankheit assoziierten Staaten . ^4-7 Der Zweck dieser Studie war es, die Auswirkungen einer ausgewählten Anzahl von Inhibitoren auf RTK Phosphorylierung messen. In dieser Studie wurden die Human Phospho-RTK-Array, das eine Membran basierten Sandwich-Immunoassay Erhöhungen oder Verminderungen der Phosphorylierung für zahlreiche RTKs gleichzeitig überwachen in einer einzigen Probe ist. In diesem Assay präsentieren beide phosphorylierten und unphosphorylierten RTKs in einem Lysat Probe werden durch diskrete Antikörpern in Doppelbestimmung über eine Nitrocellulosemembran der Größe eines Mikroskop-Objektträger gedruckt eingefangen. Nach dem Waschen werden die Arrays mit Anti-Phospho-Tyrosin-Meerrettichperoxidase (HRP) inkubiert,die Sandwiches mit phosphorylierten RTKs auf dem Array erfasst. Nach einer zweiten Waschschritt werden die Arrays mit chemilumineszierenden Reagenzien inkubiert. Signal an jedem Array-Spot erzeugt wird, proportional zu der Menge an Phospho-Proteins durch jedes Fangantikörper gebunden. In diesen Experimenten wurden Arrays verwendet, um Erhöhungen der Phosphorylierung nach Ligandenstimulation von entweder MDA-MB-453 Brustkrebs oder KATO III Magenkarzinomzellen sowie zur Abnahme der Phosphorylierung bei der Behandlung von Zellen mit Inhibitoren selektiv gegenüber ErbB zugeordnet charakterisieren messen oder FGF R Familienmitglieder.

Protocol

Ein. Probenvorbereitung

1. Sammle Lysaten aus unbehandelten, Ligand behandelt, oder Inhibitor und Ligand behandelten Zellen nach den Richtlinien im Human Phospho-RTK Array Datenblatt. Der Lysepuffer hat für dieses Kit optimiert. Die Substitution von anderen Lysepuffern kann sich auf die endgültige Leistung des Arrays. Einen proteolytischen Abbau Probe zu verhindern, fügt 10 ug / ml Aprotinin, 10 ug / ml Leupeptin und 10 ug / ml Pepstatin A zum Volumen Lysepuffer für jede Zelle Lysat-Zubereitung frischer für jede Anwendung nicht erforderlich.
2. Lysat Konzentration sollte unter Verwendung eines Bicinchoninsäure (BCA)-Assay werden. Probenkonzentration kann empirisch für eine optimale Empfindlichkeit und einen niedrigen Hintergrund eingestellt werden. Ein Bereich von 100-300 ug Lysat wird als eine anfängliche Startpunkt empfohlen.
3. Einfrieren / Auftauen der Proben sollte vermieden werden und fachgerechte Lagerung von Lysaten wird für eine optimale Leistung benötigt. Eingefrorene Lysatproben auf Eis.

1. Bringen Sie alle Kit-Komponenten auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch. Um Verunreinigungen zu vermeiden, tragen Sie Handschuhe während der Durchführung der Verfahren.
2. Pipette 2,0 ml Array Buffer 1 in jedes Well der 4-Well Multi-Teller verwendet werden. Array Puffer 1 dient als Blockpuffer.
3. Mit Flachbild-Spitze Pinzette jede Membran aus zwischen den Schutzfolien und in einen Brunnen der 4-Well Multi-Gericht verwendet werden. Die Array-Nummer muss nach oben zeigen.
4. Beim Kontakt mit Array Puffer 1 wird der blaue Farbstoff aus den Flecken verschwinden, aber die die Fang-Antikörper in ihrem spezifischen Stellen beibehalten.
5. Inkubieren für 1 Stunde auf einem schaukelnden Plattform. Richten Sie das Fach, so dass jedes Array rocks Ende in seiner gut enden. Die Oberfläche des Array sollte vollständig benetzt werden und fallen unter Blockpuffer.
6. Während die Membranen sperren, verdünnte die gewünschte Menge des zellulären Lysats auf ein Endvolumen von 1,5 ml mit Puffer 1 Array.
<li> Aspirate Array Buffer 1 aus den Brunnen der 4-Well Multi-Schüssel und fügen verdünnten Lysats Lösungen. Setzen Sie den Deckel auf dem 4-Well Multi-Gericht.
7. Inkubieren über Nacht bei 2-8 ° C auf einem Schüttler Plattform. Eine kürzere Inkubationszeit kann verwendet werden, wenn eine optimale Empfindlichkeit nicht erforderlich ist.
8. Entfernen Sie vorsichtig jede Membran aus dem 4-Well Multi-Teller und Ort in einzelne Kunststoff-Behälter mit 20 ml 1X Waschpuffer. Das 4-Well Multi-Gericht kann nicht verwendet werden, um Waschschritte abzuschließen. Spülen Sie das 4-Well Multi-Schale mit destilliertem Wasser und trocknen.
9. Waschen Sie jede Membran mit 1X Waschpuffer für 10 min auf einem Wippschüttler Shaker. Wiederholen Sie zwei Mal für insgesamt 3 Wäschen.
10. Verdünnen Sie die Anti-Phospho-Tyrosin-Meerrettichperoxidase (HRP) Detektionspuffer in 1X Array Buffer 2 mit dem Verdünnungsfaktor auf dem Flaschenetikett. Pipette 2,0 ml der verdünnten Lösung in jede Vertiefung der 4-Well Multi-Gericht.
11. Entfernen Sie vorsichtig jede Membran aus ihrer Wäsche-Container.Überschüssige Puffer von der Membran abtropfen und gibt die Membran an der 4-Well Multi-Schale mit der verdünnten Anti-Phospho-Tyrosin-HRP. Die Vertiefungen mit dem Deckel.
12. Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem schaukelnden Plattform.
13. Waschen jedes Array wie zuvor beschrieben.
14. Führen Sie die verbleibenden Schritte ohne Unterbrechung. Entfernen Sie vorsichtig jede Membran aus ihrer Wäsche-Container. Überschüssige Puffer aus der Membran durch Blotten der unteren Kante auf Saugpapier abzulassen. Platzieren Sie jede Membran auf eine Plastikfolie Protektor mit der Identifikationsnummer nach oben.
15. Je 1 ml der vorbereiteten Chemi Reagenzienmix gleichmäßig auf jeder Membran. Verwendung von weniger als 1 ml Reagenz Chemi-Mischung pro Membran kann zu einer unvollständigen Membran Deckung kommen. Substitution einiger hoher Intensität Chemilumineszenz Reagenzien für Chemi Reagenzien 1 und 2 kann entweder erhöht Hintergrund oder verminderten Abhängigkeit von dem Reagenz.
16. Vorsichtig mit einer KunststoffabdeckungKlarsichthülle. Gently glätten alle Luftblasen und sicherzustellen, Chemi Reagent Mix gleichmäßig in alle Ecken jeder Membran verteilt. Inkubation für 1 min.
17. Position Papierhandtücher auf der Oberseite und Seiten aus Kunststoff Klarsichthülle mit den Membranen und sorgfältig auspressen Chemi Reagent Mix.
18. Entfernen Sie die obere Plastikfolie Beschützer und legen Sie es vorsichtig eine absorbierende lab on top der Membranen abtupfen alle verbleibenden Chemi Reagent Mix wischen.
19. Verlassen Membranen auf der Unterseite Plastikfolie Beschützer, decken die Membranen mit Plastikfolie kümmert sanft glätten alle Luftblasen. Wickeln des überschüssigen Plastikfolie um die Rückseite des Blattes, so daß die Schutzfolie Membranen und Klarsichthülle vollständig umwickelt.
20. Platzieren Sie die Membranen mit den Identifikationsnummern nach oben, in einer Autoradiographie Filmkassette, die nicht mit radioaktiven Isotop Detektion verwendet wird.
21. Aussetzen Kodak BioMax Light Film für 1-10 min. Mehrfachbelichtungen sind empfbeendet. Alternativ können die Bilder gesammelt, indem ein Chemilumineszenz kompatibel Imager wie die Carestream Health werden Image Station 4000mm PRO.

3. Data Analysis

1. Positive Signale zur entwickelten Film gesehen kann schnell, indem die Transparenz Überlagerung auf dem Array Bild und dass es in die Paare von Referenzspots in den Ecken zu diesem Zweck bedruckt identifiziert werden. Die abgestempelte Identifikationsnummer auf dem Array sollte auf der linken hatten platziert werden. Die Lage der Kontrollen und Fänger-Antikörper befindet sich im Anhang des Human Phospho-RTK Array Datenblatt aufgeführt.
2. Pixel Dichten auf entwickelten Film können mithilfe einer Übertragung-mode-Scanner wie dem Epson Perfection V750 PRO werden.
3. Erstellen Sie eine Vorlage zur Pixeldichte in jedem Punkt des Arrays unter Verwendung eines geeigneten Bildanalyse-Software-Programm zu analysieren. Kompatiblen Programmen gehören ImageQuant oder ArrayVision Software von GE, Western Vision software mit Vorlagen spezifische Profiler Arrays, BioRad Quantity One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ und Protein Einfache AlphaView Proteome.
4. Exportieren Signalwerte eine Spreadsheet-Datei für die Manipulation in einem Programm wie Microsoft Excel.
5. Ermitteln der durchschnittlichen Signalleistung (Pixeldichte) des Paares von doppelten Spots Darstellen jedes RTK.
6. Subtrahieren einer gemittelten Signal von jedem Ort. Verwenden eines Signals von einer freien Fläche des Arrays oder negative Kontrolle Spots als Hintergrund-Wert.
7. Vergleichen entsprechender Signale auf unterschiedlichen Arrays, um die relative Änderung der RTK Phosphorylierung Ebenen zwischen den Proben zu bestimmen.

4. Repräsentative Ergebnisse

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie das Human Phospho-RTK-Array verwendet werden, um die Wirkungen von Ligand Stimulation und Inhibitoren auf RTK Phosphorylierung screenen. In Abbildung 1 sind die Daten für MDA-MB-453-Zellen, die unbehandelt gezeigt, mit 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) für 5 min, oder mit bekannten ErbB-Familie Inhibitoren ^8-11 vor HRGβ1 Behandlung vorbehandelt werden. Für Inhibitor Experimente wurden die Zellen mit 1 uM HDS 029, 200 nM PD 153.035 oder 158.780 PD 200 nM in SFM für drei Stunden inkubiert. Jedes Array wurde mit 100 ug Lysat inkubiert. Eine Zunahme der Phosphorylierung ist für ErbB2, ErbB3 beobachtet und ErbB4 Capture Flecken beim Vergleich mit unbehandelten Zellen HRG-β1 behandelt MDA-MB-453-Zellen. Die Behandlung der Zellen mit allen drei ErbB-Familie selektive Inhibitoren vor HRG-β1 Inkubation verursachte Verringerung der ErbB2, ErbB3, ErbB4 und Phosphorylierung.

In Abbildung 2 sind die Daten für Kato III-Zellen bekannt, die RTK FGF R2 überexprimieren gezeigt. In diesem Satz von Experimenten waren Kato III-Zellen unbehandelte, mit 100 ng / ml rhFGF sauer (FGF) und 1 ug / ml Heparin, oder vorbehandelt mit FGF R selektive Inhibitoren ^12-15 vor der Behandlung mitFGF und Heparin. Die Inhibitoren PD173074, PD 161.570, 166.285 und PD wurden bei einer Konzentration von 1 uM verwendet und inkubiert mit den Kato III-Zellen für 3 h in serumfreiem Medium. Während es konstitutiven Phosphorylierung von sowohl EGF und FGF R R2 in unbehandelten KATO III-Zellen, einem Anstieg der FGF R2 Phosphorylierung wurde auf FGF Behandlung beobachtet. Inkubieren der Zellen mit PD 173.074 ergab PD 161.570 oder 166.285 PD einer verringerten FGF R2 und EGF R Phosphorylierung. Obwohl diese bekannten Inhibitoren auf die Phosphorylierung von FGF R Familienmitglieder zeigen diese Ergebnisse, die Nützlichkeit des Human Phospho-RTK-Array für das Überwachen der Wirkung einer bestimmten Konzentration des Inhibitors auf andere RTKs, wie EGF R in diesem Fall haben kann.

Abbildung 1. Induktion und Hemmung der Rezeptorentor Tyrosin-Kinase-Phosphorylierung in Brustkrebszellen. Array Bilder von Proteome Profiler Menschliche Phospho-RTK-Arrays sowie die entsprechenden Histogramm Profilen gezeigt. MDA-MB-453-Zellen waren unbehandelt oder mit Inhibitoren RTK gefolgt von Behandlung mit NRG-β1/HRG-β1. Das Array wurde verwendet, um die Auswirkungen der Inhibitoren auf die Kinase-Phosphorylierung in MDA-MB-453-Zellen zu überwachen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 2. Induktion und Hemmung der Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Phosphorylierung in Magenkarzinomzellen. Array von Bildern von einem Proteome Profiler Menschliche Phospho-RTK-Array und den entsprechenden Histogramm-Profile angezeigt. Kato III-Zellen waren untreated oder behandelt mit RTK-Inhibitoren durch Behandlung mit FGF saurer und Heparin gefolgt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Discussion

The Human Phospho-RTK ist eine kostengünstige und schnelle Alternative zu traditionellen Methoden wie Immunpräzipitation (IP) Western für das Screening Veränderungen im RTK-Phosphorylierung. Mit dieser Methode wurden die relativen Spiegel von 42 phospho-RTKs gleichzeitig unter Verwendung einer einzelnen Probe von MDA-MB-453 oder Kato III Zelllysat gescreent. Darüber hinaus benötigt dieses Array Assay 2,5 h hands-on Zeit, so dass diese Methode viel mehr Zeit-wirksamer als die Durchführung mehrerer IP-Westerns. Durch Verwendung eines Chemilumineszenz Nachweisverfahrens, wurde keine spezielle Ausrüstung hinaus, was in der Regel verwendet, um Daten zu sammeln westlichen erforderlich. Arrays sind empfindlich und können verwendet werden, um Änderungen in der Phosphorylierung von beiden Ligand und Inhibitor Behandlung verursacht vergleichen. Diese Methode ermöglicht auch die Auswertung der Inhibitor Selektivität vorbei RTKs. Positive Ergebnisse kann weiter ausgewertet werden unter Verwendung eines quantitativen Assays wie ELISA.

Um effektiv arbeiten Arrays zur Früherkennung vonin der Phosphorylierung, sollten einige wichtige experimentelle Richtlinien befolgt werden. Zunächst sollten Experimente umfassen geeignete Kontrollproben. Zum Beispiel wird in diesen Experimenten wurde die Wirkung von Inhibitoren auf MDA-MB-453 oder Kato III Lysate wurden auf Lysatproben am selben Tag hergestellt gemessen. Nur Arraydaten, die innerhalb des gleichen Experiment gesammelt wird untersucht, um zu Variationen der Signalstärke aufgrund von Unterschieden bei der Probenhandhabung, Inkubationszeit Pipette Technik oder Wash-Technik zu minimieren. Vergleichen Signalintensitäten zwischen zwei Analyten auf der gleichen Membran ist nicht zu empfehlen, da Fängerantikörpern nicht ausgewählt wurden, um parallele Affinitäten aufweisen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.