Profilering Förändringar i receptortyrosinkinas Fosforylering med Antibody Arrays - Reklam

Summary

Proteome Profiler antikroppar arrayer är ett bekvämt och kostnadseffektivt sätt att screena för förändringar i receptorer (RTK) fosforylering utan att utföra många immunoutfällning (IP) Westerns. Den ARY001 Humant RTK matris möjliggör kvalitativ mätning av flera RTK i ett enda prov med kemiluminiscens detektion.

Abstract

Den dysreglering av receptor (RTK) uttryck och fosforylering är ofta förenat med utveckling och metastatisk spridning av cancerceller. Har fokuserat på att utveckla inhibitorer för att rikta specifika RTK och avbryta avvikande signalvägar associerade med sjukdomstillstånd ^1-3 betydande ansträngning . ^4-7 Syftet med denna studie var att mäta effekterna av ett begränsat antal hämmare på RTK fosforylering. Denna studie använde Human Phospho-RTK matris, vilket är ett membran baserad sandwich-immunoanalys för att övervaka ökningar eller minskningar i fosforylering för många RTK samtidigt i ett enda prov. I denna analys, både fosforylerade och ofosforylerade RTK närvarande i ett lysat prov fångas av diskreta antikroppar tryckta i duplikat över ett nitrocellulosamembran storleken på ett objektglas. Efter tvättning uppsättningarna inkuberas med anti-fosfo-tyrosin-pepparrotsperoxidas (HRP),som smörgåsar med fosforylerade RTK tagna på matrisen. Efter ett andra tvättningssteg, är uppsättningarna inkuberas med kemiluminiscenta reagens. Alstras vid varje uppsättning plats är proportionell mot mängden fosfo-protein bundet av varje infångningsantikropp. I dessa experiment, var arrayer för att mäta ökningar i fosforylering efter ligandstimulering av antingen MDA-MB-453 bröstcancer eller KATO III gastriska karcinomceller, liksom att karakterisera minskningar i fosforylering samband med behandling av celler med inhibitorer selektiva mot ErbB eller FGF R familjemedlemmar.

Protocol

1. Provberedning

1. Samla lysat från obehandlade, ligand behandlas eller hämmare och liganden behandlade celler efter riktlinjerna i den mänskliga Phospho-RTK array datablad. Den lyseringsbuffert har optimerats för detta kit. Substitutionen av andra lysis buffertar kan påverka den slutliga prestandan av arrayen. För att förhindra proteolytisk nedbrytning prov, tillsätt 10 | ig / ml aprotinin, 10 | ig / ml leupeptin, och 10 | ig / ml pepstatin A till volym av lyseringsbuffert som krävs för varje cellysat preparat färskt för varje användning.
2. Lysat koncentration bör mätas med hjälp av en bicinkoninsyra (BCA)-analys. Provkoncentration kan empiriskt justeras för optimal känslighet och låg bakgrund. En rad av 100-300 ig lysat rekommenderas som en initial utgångspunkt.
3. Frys / tö cykler av prover bör undvikas och korrekt lagring av lysat krävs för optimal prestanda. Tina frysta lysat prover på is.

1. Ta alla kitkomponenter till rumstemperatur före användning. För att undvika kontaminering, handskar när de utför procedurerna.
2. Pipettera 2,0 ml av Array buffert 1 i varje brunn av 4-Väl flera skål som skall användas. Array Buffert 1 tjänar som ett block buffert.
3. Använda platt-tip pincett, ta bort varje membran som ska användas mellan de skyddande blad och lägg i en brunn av 4-Well Multi-skålen. Matrisen nummer ska vara vänd uppåt.
4. Vid kontakt med Array buffert 1, kommer det blåa färgämnet från fläckarna försvinna, men de infångande antikropparna kvarhålles i sina specifika platser.
5. Inkubera under 1 timme på en gungande plattform. Orientera facket så att varje rad stenar ände mot ände i sin brunn. Ytan av uppsättningen bör fullständigt vätt och täckt av blockbuffert.
6. Medan membranen blockerar, späd den önskade mängden av cellulärt lysat till en slutlig volym av 1,5 ml med buffert Array 1.
<li> Aspirera Array Buffer 1 från brunnarna i 4-Well Multi-skålen och lägga utspätt lysat lösningar. Placera locket på den 4-Well Multi-skålen.
7. Inkubera över natten vid 2-8 ° C på en vaggande plattform. En kortare inkubationstid kan användas om optimal känslighet inte krävs.
8. Ta försiktigt bort varje membran från 4-Well Multi-skålen och placera i enskilda plastbehållare med 20 ml 1x tvättbuffert. Den 4-Väl flera skålen får inte användas för att komplettera tvättningssteg. Skölj 4-Väl flera skålen med avjoniserat eller destillerat vatten och torka noga.
9. Tvätta varje membran med 1X tvättbuffert under 10 minuter på en gungande plattform skakapparat. Upprepa två gånger för totalt 3 tvättar.
10. Späd anti-fosfo-tyrosin-pepparrotsperoxidas (HRP) upptäckt buffert i 1X Array Buffer 2 med spädningsfaktorn på flaskans etikett. Pipettera 2,0 ml av utspädd lösning i varje brunn av 4-Väl multi-skålen.
11. Ta försiktigt bort varje membran från sin tvätt behållare.Tillåt överskott buffert rinna ut ur membranet och återföra membranet till 4-Väl flera skålen med utspädda anti-fosfo-tyrosin-HRP. Täck brunnarna med locket.
12. Inkubera under 2 timmar vid rumstemperatur på en vaggande plattform.
13. Tvätta varje matris såsom beskrivits tidigare.
14. Slutföra de återstående stegen utan avbrott. Ta försiktigt bort varje membran från sin tvätt behållare. Tillåt överskott buffert rinna från membranet genom blotting den nedre kanten på absorberande papper. Placera varje membran på en plastfolie beskyddare med identifieringsnumret uppåt.
15. Pipettera 1 ml av den framställda Chemi reagensblandning jämnt på varje membran. Använder mindre än 1 ml Chemi reagensblandning per membran kan resultera i ofullständig membran täckning. Substitution av vissa högintensiva kemiluminiscenta reagens för Chemi Reagens 1 och 2 kan orsaka antingen ökad bakgrund eller minskad signal beroende på reagens.
16. Försiktigt täcka med en plastark beskyddare. Försiktigt jämna ut eventuella luftbubblor och se Chemi reagensblandning sprids jämnt till alla hörn av varje membran. Inkubera under 1 min.
17. Placera pappershanddukar på toppen och sidorna av plastfolie beskyddare innehåller membranen och pressa försiktigt ur överflödig Chemi reagensblandning.
18. Ta bort den övre plastfolie beskyddare och lägg försiktigt en absorberande labb torka ovanpå membranen att utplåna bort eventuellt kvarvarande Chemi reagensblandning.
19. Lämnar membran på undersidan plastfolie beskyddare, täcker membranen med plastfolie noga med att försiktigt jämna ut eventuella luftbubblor. Linda överskottet plastfolie runt baksidan av arket beskyddare så att membranen och plåt beskyddare helt förpackade.
20. Placera membranen med de identifikationsnummer uppåt, i en autoradiografifilm kassett som inte används med radioaktiv isotop upptäckt.
21. Utsättas för Kodak BioMax Lätt film för 1-10 minuter. Flera exponeringar är rekommavslutades. Alternativt kan bilderna samlas med hjälp av en kemiluminiscens kompatibel imager såsom Carestream Health Image Station 4000mm PRO.

3. Dataanalys

1. Positiva signaler ses på framkallad film kan snabbt identifieras genom att placera öppenhet overlay på matrisen bilden och anpassa den med par referens fläckar tryckta i hörnen för detta ändamål. Det stansade identifikationsnummer på matrisen ska placeras på vänster hade sida. Placeringen av kontroller och antikroppar fånga listas i bilagan för mänskliga Phospho-RTK array datablad.
2. Pixel densiteter på framkallad film kan samlas med en transmission-läge scanner såsom Epson Perfection V750 Pro.
3. Skapa en mall för att analysera pixeltäthet i varje fläck av matrisen med ett lämpligt bildbehandlingsprogram analysprogram. Kompatibla program inkluderar ImageQuant eller ArrayVision programvara från GE, Västra Vision software med mallar som är specifika för Proteome Profiler matriser, BioRad Antal One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ och protein Enkel AlphaView.
4. Exportera signalvärden till ett kalkylblad för manipulation i ett program som Microsoft Excel.
5. Bestäm den genomsnittliga signalen (pixeltätheten) av paret av dubbla punkter representerar varje RTK.
6. Subtrahera en genomsnittlig bakgrund signal från varje fläck. Använd en signal från en öppen yta av matrisen eller negativa punkter kontroll som bakgrund värde.
7. Jämför motsvarande signaler på olika matriser för att bestämma den relativa förändringen i RTK fosforylering nivåer mellan prover.

4. Representativa resultat

Detta protokoll visar hur Human Phospho-RTK-grupp kan användas för att screena effekterna av ligand stimulering och inhibitorer på RTK fosforylering. I figur 1, är data som visas för MDA-MB-453-celler som var obehandlade, behandlade med 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) under 5 minuter, eller förbehandlad med kända inhibitorer ErbB family ^8-11 före HRGβ1 behandling. För inhibitor experiment inkuberades cellerna med 1 | iM HDS 029, 200 nM PD 153.035, eller 200 nM PD 158.780 i SFM under tre timmar. Varje array inkuberades med 100 | ig av lysat. En ökning i fosforylering observeras för ErbB2, ErbB3, ErbB4 och fånga fläckar vid jämförelse obehandlade celler med HRG-β1 behandlade MDA-MB-453-celler. Behandlingen av celler med alla tre erbB-familjen selektiva inhibitorer före HRG-β1 inkubering orsakade minskningar ErbB2, ErbB3, ErbB4 och fosforylering.

I figur 2, är data som visas för Kato III celler kända för att överuttrycka RTK FGF R2. I denna uppsättning av experiment, var Kato III celler obehandlade, behandlade med 100 ng / ml rhFGF sur (FGF) och 1 pg / ml heparin, eller förbehandlade med FGF R selektiva hämmare ^12-15 före behandling medFGF och heparin. Den hämmare PD173074, PD 161.570, och PD 166.285 användes vid en koncentration av 1 iM och inkuberades med Kato III cellerna för 3 h i serumfritt medium. Medan det finns konstitutiv fosforylering av både EGF R och FGF R2 i obehandlade KATO III-celler, en ökning i FGF R2 fosforylering observerades vid FGF behandling. Inkubering av cellerna med PD 173.074, resulterade PD 161.570, eller PD 166.285 i minskad FGF R2 och EGF R fosforylering. Även om dessa inhibitorer är kända att påverka fosforylering av FGF R familjemedlemmar, dessa resultat visar användbarheten av den mänskliga Phospho-RTK array för övervakning av effekten en specifik koncentration av hämmare kan ha på andra RTK, såsom EGF R i detta fall.

Figur 1. Induktion och hämning av recepTor tyrosinkinas fosforylering i bröstcancerceller. Array bilder från Proteome Profiler Human Phospho-RTK arrayer och motsvarande profiler histogrammet visas. MDA-MB-453-celler var obehandlade eller behandlade med RTK-hämmare, följt av behandling med NRG-β1/HRG-β1. Matrisen användes för att övervaka effekterna av inhibitorer på kinasfosforylering i MDA-MB-453 celler. Klicka här för att se större bild .

Figur 2. Induktion och hämning av receptortyrosinkinas fosforylering i mag cancerceller. Array bilder från en Proteome Profiler Human Phospho-RTK matris och motsvarande histogram profiler visas. Kato III celler var UNTreated eller behandlas med RTK-hämmare följt av behandling med FGF sura och heparin. Klicka här för att se större bild .

Referenser

1. Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenborg, PA, Öberg, A., Van Guelpen, B., Rutegård, J., Stenling, R., & Palmqvist, R. kolorektal cancer celler aktiverar angränsande fibroblaster följd i FGF1/FGFR3 signalering och ökad invasion. Am. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011).
2. Morishita, A., Gong, J., Nomura, T., Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushidas, Y., Haba, R., D'Armiento, J., & Masaki, T. Användningen av proteinarray att identifiera inriktningsbara receptortyrosinkinaser för behandling av human koloncancer. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010).
3. Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, B., Guo, T., Wong, GC, Socci, ND, Maki, RG,DeMatteo, RP, Besmer, P., & Antonescu, CR Molekylär karakterisering av pediatriska gastrointestinala stromacellstumörer. Clin. Cancer Res. 14, 3204-3215 (2008).
4. Stommel, JM, Kimmelman, AC, Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Brennan, C, Chin, L., & DePinho påverkar RA Coactivation av receptortyrosinkinaser svaret av tumörceller till riktade behandlingar. Science. 318, 287-290 (2007).
5. Agarwal, S., Zerillo, C, Kolmakova, J., Christensen, JG, Harris, LN, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, & Stern, DF Association of konstitutivt aktiverad hepatocyttillväxtfaktor receptorn (Met) med resistens mot en dubbel EGFR/Her2 hämmare i icke-småcellig lungcancerceller. Br. J. Cancer. 100, 941-949 (2009).
6. Dewaele, BM, Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, CD, Coindre, JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schoffski, P., MARYNEN, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., & Debiec-Rychter, M. Co-aktiverad PDGFRA och EGFR är potentiella terapeutiska mål i intimal sarkom. Cancer Res. 70, 7304-7314 (2010).
7. Yoon, YK, Kim, HP, Han, SW, Hur, HS, Oh, DY, IM, SA, Bang, YJ, och Kim, TY Kombination av EGFR och MEK1 / 2 hämmare uppvisar synergieffekter genom att undertrycka EGFR/HER3-dependent AKT aktivering i mänskliga gastriska cancerceller. Mol. Cancer Ther. 8, 2526-2536 (2009).
8. Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V., Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., & Bridges, AJ Biokemiska och antiproliferativa egenskaper 4 - [ar (alk) ylamino] pyridopyrimidiner, en ny kemisk klass av potenta och specifika epidermal tillväxtfaktorreceptor tyrosinkinashämmare. Biochem. PharmacoL. 54, 877-887 (1997).
9. Bos,M., Mendelsohn, J., förhindrar Kim, YM, Albanell, J., Fry, DW, och Baselga, J. PD153035, en tyrosinkinashämmare, epidermal tillväxtfaktor aktiveringsfaktor receptorn och hämmar tillväxten av cancerceller i en receptor-nummer beroende sätt. Clin. Cancer Res. 3, 2099-2106 (1997).
10. Stoll, SW, Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Leopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M., Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, EF, & Elder, JT Differential utnyttjande och lokalisering av ErbB receptortyrosinkinaser i huden jämfört med normala och maligna keratinocyter. neoplasi. 3, 339-350 (2001).
11. Klutchko, SR, Zhou, H., Winters, RT, Tran, TP, Broar, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Elliott, WL, Meade, MA, Roberts, BJ, Fry, DW, Gonzales, AJ, Harvey , PJ, Nelson, JM, Sherwood, V., Han, HK, Pace, G., smaill, JB, Denny, WA, och Showalter, HD tyrosinkinashämmare. 19. 6-alknyamides av 4-anilinokinazoliner och 4-anilinopyrido [3,4-d] pyrimidiner som irreversibla hämmare av erbB-familjen av tyrosinkinasreceptorer. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006).
12. Kunii, K., Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M., Di Bacco, A., Elbi, C., & Lutterbach, B. FGFR2-förstärkta ventrikelcancer cellinjer kräver FGFR2 och erbB3 signalering för tillväxt och överlevnad. Cancer Res. 68, 2340-2348 (2008).
13. Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Sharma, SV, Brugge, J., Meyerson, M., Settleman J . & Gray, NS En struktur-guidad tillvägagångssätt för att skapa kovalenta FGFR-hämmare. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010).
14. Batley, BL, Doherty, AM, Hamby, JM, Lu, GH, Keller, P., Dahring, TK, Hwang, O., Crickard, K., & Panek RL Inhibering av FGF-1-receptor-tyrosinkinasaktivitet av PD 161.570 , ett nytt protein-Tyrosinkinashämmare. Life Sci. 62 143-150 (1998).
15. Panek, RL, Lu GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, Hamby, JM, Hallak, H., Doherty, AM & Keiser, JA in vitro farmakologisk karakteristik av PD 166285, en ny nanomolar potent och brett aktivt protein tyrosinkinashämmare. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997).

Discussion

Den mänskliga Phospho-RTK är ett ekonomiskt och snabbt alternativ till traditionella metoder som immunfällning (IP) Western för screening förändringar i RTK fosforylering. Med denna metod, de relativa nivåerna av 42 fosfo-RTK screenas samtidigt med ett enda prov av MDA-MB-453 eller Kato III cellysat. Dessutom krävs denna array analys 2,5 timme av hands-on tid, vilket gör denna metod mycket mer tidseffektiv än att utföra flera IP-Westerns. Genom att använda en metod kemiluminiscens detektion, ingen specialutrustning utöver vad som normalt används för att samla in uppgifter västerländska krävs. Arrayer är känsliga och kan användas för att jämföra förändringar i fosforylering orsakade av både ligand och hämmare. Denna metod tillåter också utvärdering av hämmare selektivitet till off-mål RTK. Positiva träffar kan vidare utvärderas med hjälp av en kvantitativ analys, såsom en ELISA.

För att effektivt använda arrayer för att screena för förändringari fosforylering bör vissa viktiga experimentella riktlinjer följas. Först bör experiment innefatta lämpliga kontrollprover. Till exempel i dessa experiment effekten av hämmare på MDA-MB-453 eller Kato III lysaten mättes på lysat prover framställda på samma dag. Endast array data som samlas in inom samma experiment bör analyseras för att minimera variationer i signalen beroende på skillnader i provhantering, inkubationstid, pipett teknik eller tvätt teknik. Jämföra signalintensiteter mellan två analyter på samma membran rekommenderas inte, eftersom infångningsantikroppar inte valt att ha parallella tillhörighet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.