Ein neues Screening-Verfahren für die gelenkte Evolution von thermostabilen Bakteriolytische Enzyme

Summary

Eine neuartige Methode der gerichteten Evolution spezifischen Bereich der Thermostabilität Engineering entwickelt wurde und folglich validiert bakteriolytischen Enzymen. Nach nur einem Runde der Zufallsmutagenese, ein weiterentwickelter bakteriolytischen Enzym, PlyC 29C3, erscheint größer als zweimal die Restaktivität bei dem Wildtyp-Protein nach erhöhter Temperatur Inkubation verglichen.

Abstract

Gerichteten Evolution wird als eine Methode der natürlichen Selektion zu nutzen, um Proteine ​​konstruieren, um besondere Eigenschaften, die nicht mit dem Protein in der Natur assoziiert sind zu erwerben definiert. Literatur hat zahlreiche Beispiele für die Umsetzung der gerichteten Evolution zur Verfügung gestellt, um erfolgreich zu verändern molekularen Spezifität und Katalyse ^1. Der primäre Vorteil der Verwendung gerichteten Evolution statt rationellere Ansätze für Molekulartechnik betrifft das Volumen und Variantenvielfalt, die ² gescreent werden können. Eine mögliche Anwendung der gerichteten Evolution beinhaltet die Verbesserung der strukturellen Stabilität bakteriolytischen Enzymen, wie Endolysinen. Bakteriophagen kodieren und auszudrücken Endolysine eine kritische kovalenten Bindung im Peptidoglycan (dh Zellwand) von Bakterien hydrolysieren, was Wirtszelle Lyse und Freisetzung von Nachkommen Virionen. Bemerkenswert ist, besitzen diese Enzyme die Fähigkeit, extrinsisch induziert Lyse susceptIVK Bakterien in Abwesenheit von Phagen und ferner wurden sowohl in vitro als auch in vivo für ihr therapeutisches Potential ^3-5 validiert. Das Thema unserer gerichtete Evolution Studie beinhaltet die PlyC Endolysin, die aus PlyCA und PlyCB Untereinheiten ⁶ besteht. Wenn gereinigtes und fügte extrinsisch, lysiert die PlyC Holoenzym Gruppe A-Streptokokken (GAS) sowie anderen Streptokokken Gruppen in wenigen Sekunden und weiterhin wurde in vivo gegen GAS ⁷ validiert. Bezeichnenderweise Überwachung der Rest Enzymkinetik nach erhöhter Temperatur Inkubation bietet deutliche Hinweise darauf, dass PlyC lytische Aktivität verliert abrupt bei 45 ° C, was auf eine kurze therapeutische Haltbarkeit, die zusätzliche Entwicklung dieses Enzyms begrenzen kann. Weitere Studien zeigen, die mangelnde thermische Stabilität nur für die PlyCA Untereinheit beobachtet, während die PlyCB Untereinheit ist stabil bis zu ~ 90 ° C (unveröffentlichte Beobachtung). Neben PlyC bestehen siele Beispiele in der Literatur, die thermolabile Natur Endolysine beschreiben. Beispielsweise verliert die Staphylococcus aureus Endolysin LysK und Streptococcus pneumoniae Endolysinen Cpl-1 und Pal Aktivität spontan auf 42 ° C, 43,5 ° C und 50,2 ° C, jeweils ^8-10. Nach der Arrhenius-Gleichung, die die Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion bezieht sich auf die Temperatur, die in dem bestimmten System, wird eine Erhöhung der Thermostabilität mit einer Zunahme der Lebenserwartung Regal ¹¹ korrelieren. Zu diesem Zweck hat die gerichtete Evolution gezeigt worden, um ein nützliches Werkzeug für die Änderung der thermischen Aktivität verschiedener Moleküle in der Natur, aber niemals hat dieser spezielle Technologie bereits erfolgreich für das Studium der bakteriolytischen Enzymen ausgenutzt. Ebenso erfolgreich Konten voran die strukturelle Stabilität von dieser besonderen Klasse von Antibiotika überhaupt sind nicht vorhanden. In diesem Video beschäftigen wir eine neue Methode, die einen Fehler-pr verwendetein DNA-Polymerase durch eine optimierte Siebvorgang unter Verwendung eines 96-Well-Mikrotiterplatten-Format, um Mutationen an den PlyCA Untereinheit des PlyC Streptokokken Endolysin die zu einer Erhöhung der Stabilität enzymkinetische (Abbildung 1) korrelieren identifizieren gefolgt. Ergebnisse nach nur einer Runde der Zufallsmutagenese schlagen die Methodik generiert PlyC Varianten, die mehr als zweimal die restliche Aktivität beibehalten, wenn zum Wildtyp (WT) PlyC nach erhöhter Temperatur Behandlung verglichen.

Protocol

Ein. Bestimmung der optimalen Heizung AGB

Zuerst muss man experimentell die optimale Bebrütungstemperatur und die Zeit bis zum Erwärmungsschritt in dem Assay verwendet. Für unsere PlyC Modell, ist es wichtig zu beachten, dass E. coli mit plyCA und plyCB Gene auf getrennten Expressionsplasmiden cotransformiert ist gezeigt worden, um eine voll funktionsfähige PlyC Holoenzym ^{6 zu} bilden. Die 96-well Mikrotiterplatte Vorbereitung sowie Zellwachstum Bedingungen und die anschließende Replica-Plating-Technik wurden von Beispielen in der Literatur ^12-16 angepaßt. Eine Inkubationszeit von 30 min wird für diesen Test als Ergebnisse aus früheren thermische Inaktivierung Experimenten einen schnellen Verlust der Aktivität während der Kurzzeitinkubation in Umgebungen über physiologischen Temperatur (unveröffentlichte Beobachtung) diktieren. Die optimale Temperatur für die Inkubation PlyC wurde durch die folgenden Schritte näher erläutert:

1. Transform das Expressionskonstrukt pBAD24: plyCA (Amp ^r) in den kompetenten E. coli-Stamm DH5 pBAD33: plyCB (Cm ^r).
2. Platte die Transformanten auf einem Luria-Bertani (LB)-Agarplatte mit Ampicillin (100 ug / ml) und Chloramphenicol (35 ug / ml) ergänzt. Die Inkubation über Nacht bei 37 ° C.
3. Mit einem sterilen Zahnstocher, impfen einen individuellen Kolonie in jeder Reihe von Vertiefungen (Abbildung 2a) in einem sterilen, klar, Flachboden-96-Well, lidded Mikrotiterplatte mit 200 ul LB mit Ampicillin und Chloramphenicol ergänzt enthält.
4. Sicher stellen Sie den 96-Well-Mikrotiterplatte auf einem 37 ° C Schüttelinkubator und wachsen die Bakterien über Nacht bei 300 Umdrehungen pro Minute.
5. Rufen Sie die 96-Well-Mikrotiterplatte aus dem 37 ° C Schüttelinkubator und Replik Platte zu einem neuen 96-Well Mikrotiterplatten wie folgt:
   1. Fügen Sie 180 ul LB mit Ampicillin und Chloramphenicol ergänztIn jede Vertiefung der Replik Platte.
   2. Übertragen 20 ul von Bakterien aus der Original-Platte in die entsprechenden Vertiefungen in der Replik Platte. Dies sollte in einer anfänglichen OD ₆₀₀ von ~ 0,5 führen.
6. Sicher stellen die Replik Platte auf dem 37 ° C Schüttelinkubator und inkubieren Sie die Platte für 1 Stunde bei 300 rpm, dann die inductant. Im Falle der pBAD Expressionssystemen ist die inductant 0,25% Arabinose. Andere Expressionssysteme können unterschiedliche inductants. Legen Sie die Platte wieder auf die 37 ° C Schüttelinkubator und schütteln bei 300 rpm für weitere 4 Stunden, um für die Proteinexpression ermöglichen. Expression der Regel zwischen 10-20 pg PlyC.
7. Sobald Proteinexpression abgeschlossen hat, rufen Sie die Replik Platte und Pellet die Bakterien, indem Sie die 96-Well Mikrotiterplatten in einer Kühlzentrifuge, die einen Ausschwingrotor Rotor, der 96-Well-Mikrotiterplatten passt enthält. Zentrifugieren bei 3000 UpM für 10 min bei Raumtemperatur.
8. Entfernen Sie die Medien Überstand langsam umdrehen, die Mikrotiterplatte und sanft Dekantieren die Medien.
9. Lyse der Zellen durch Zugabe von 50 ul B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte bei Raumtemperatur für 20 min.
10. Erhöhung der Lautstärke in jeder Vertiefung zu 120 ul 70 ul durch Zugabe von Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,2.
11. Das unlösliche Pellet Zelltrümmer durch Spinnen der Platte bei 3000 UpM für 10 min bei 4 ° C in der Kühlzentrifuge.
12. Übertragen 110 ul des löslichen Rohlysat zu den entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Platte Thermocycler.
13. Mit 30 min nach der vorgegebenen Inkubationszeit, setzen die löslichen Lysate derzeit wohnhaft in der 96-well Thermocycler Platte mit einem breiten Gradienten Temperaturbereich Spanning 15-20 ° C. Beachten Sie, ist das Ziel, bei welcher Temperatur ein bestimmtes Enzym verliert> 95% katalytische Aktivität zu bestimmen.
14. Nach der Inkubation inkubieren 96 wellThermocycler Platte bei 4 ° C für 5 min und dann 100 ul der löslichen Lysaten aus der 96-Well-Platte Thermocycler zu ihren entsprechenden Speicherort auch in der endgültigen 96-Well-Mikrotiterplatte.
15. Mit einem 12-Kanal-multipipettor, fügen Sie 100 ul GAS-Stamm D471 in jede Vertiefung. Beachten Sie, D471 Zellen, die ursprünglich von Übernacht-Kulturen gefriergetrocknet und erneut mit PBS pH 7,2 bis eine OD ₆₀₀ von ~ 2,0 erhalten.
16. Anschließend wird der 96-Well-Platte in der Mikroplatte Spektralphotometer und überwachen die Enzymkinetik durch Messung der OD ₆₀₀ alle 15 Sekunden für 20 min. Die niedrigste Temperatur, Inkubationszeit, die Vertiefungen, die eine Änderung der optischen Dichte (AOD ≤ 0,1) fehlte entsprach wird als der nicht-permissiven Temperatur.

Nach einem breiten Temperaturbereich Bildschirm durchgeführt wird, um das nicht-permissiven Temperatur zu identifizieren, können die obigen Schritte in einem engeren Bereich von Temperaturen (5 ° -10 ° C) zu erhellen wiederholt werdendie genaue nicht-permissiven Temperatur für das Enzym von Interesse. Hinweis kann der nicht-permissiven Temperatur in diesem Assay identifiziert anders sein als die Schmelztemperatur durch andere Mittel aufgeklärt aufgrund der Unterschiede im Volumen, Konzentration etc.

2. Erzeugen der Mutant Bibliothek

Die Schaffung der Mutantenbibliothek zu screenenden beinhaltet zufällig Einbau von Mutationen durch einen fehlerhaften DNA-Polymerase mit minimaler Verzerrung der Nukleotid plyCA Gens unter Verwendung der GeneMorph II Zufällige Mutagenese-Kits wie folgt:

1. Entwerfen Nukleotidprimer mit ähnlichen Schmelztemperaturen (T _m) zwischen 55 bis 72 ° C mit den Restriktionsschnittstellen der Wahl an der 5 'und 3' Enden des plyCA Gens.
2. Da die gewünschte Mutation beträgt 2-3 Nukleotiden pro plyCA (1,4 kb), verwenden Sie die PCR-Reaktion-Konzentrationen sowie die Thermocycler vom Hersteller empfohlen für geringen Mutationsrate frequencies (0-4,5 pro kb).
3. Klonen der mutagenisierten plyCA Gene in den Expressionsvektor pBAD24.
4. Transformieren der Konstrukte in eine DH5a pBAD33: plyCB Hintergrund und Platte Transformanten auf LB-Agarplatten mit Ampicillin und Chloramphenicol ergänzt.
5. Zusätzlich zu transformieren und Platte DH5a pBAD33: plyCB mit dem Expressionsvektor pBAD24 enthaltend die WT plyCA Gens. Kolonien von dieser Platte wird wie die Kontrollen beim Screening dienen.

3. 96 Well Mikrotiterplatten Vorbereitung und Cell Growth AGB

1. Füllen Sie jede Vertiefung einer 96-Well Mikrotiterplatten mit 200 ul LB mit Ampicillin und Chloramphenicol ergänzt.
2. Nach der Mikrotiterplatte schematische (Abb. 2b), sorgfältig wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Nacht Agarplatten mit einem sterilisierten Zahnstocher und impfen die Bakterien in der Vertiefung der 96 bezeichnet Mikrotiterplatten plate. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass nur eine Kolonie pro Well geimpft.
3. Schütteln Sie die fest verankert 96-well Mikrotiterplatte bei 300 rpm über Nacht bei 37 ° C.

4. Replica Plating, Protein Expression Induktion und Lysate Vorbereitung

1. Folgen Sie den Schritten 1,5-1,11 aus dem Abschnitt "Bestimmung der optimalen Heizung Bedingungen" mit einer Modifikation. Bewahren Sie die Original-Platte bei 4 ° C nach der Replika-Plattierung Schritt abgeschlossen hat.
2. Nach Schritt 1.11, Übertragung 110 ul des löslichen Rohlysat zu den entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Platte Thermocycler mit Ausnahme der positiven Kontrollvertiefungen A1-D1. Im Hinblick auf die positive Kontrolle Lysaten (dh Lysaten, die nicht erwärmt werden), 100 ul Transfer der Lysate auf die entsprechenden Vertiefungen einer neuen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, die als letzte Testplatte für das Experiment und auf Eis lagern dienen wird.

5. Löslichen Lysate Heat Treatment

1. Erwärmen der negativen Kontrolle und mutierten löslichen Lysaten derzeit beengten im 96-Well-Platte in dem Thermocycler Thermocycler für 30 min bei der optimierten nicht permissiven Inkubationstemperatur in Schritt 1 bestimmt.
2. Nach nicht-permissiven Temperatur Inkubation inkubieren 96 well Thermocycler Platte bei 4 ° C für 5 min.
3. Übertragen Sie 100 ul der löslichen Lysate aus der 96-Well-Thermocycler Platte ihrer identischen auch Standorte in der abschließenden 96-Well Mikrotiterplatten-Assay Platte bereits mit den positiven Kontrolle löslichen Lysate.
4. Mit einem 12-Kanal-multipipettor, fügen Sie 100 ul GAS-Stamm D471 in jede Vertiefung. Sofort legen die Platte in der Mikroplatten-Spektralphotometer.
5. Überwachen Sie die Enzymkinetik durch Messung der OD ₆₀₀ alle 15 Sekunden für 20 min.
   1. Eine Variante mit PlyC fortgeschritten thermische Verhalten wird als ein Konstrukt, das die ursprüngliche optische Dichte um 50 Prozent abnehmen kann in weniger als 900 Sekunden bei der definiertenicht-permissiven Temperatur. Zusätzlich müssen die positiven Kontrollen (dh nicht-beheizten, WT PlyC) zu WT katalytische Aktivität entfalten (t _1/2 ≤ 100 sec) und die negativen Kontrollen (dh erhitzt, WT PlyC) sollte keine Aktivität.
6. Sobald eine Variante mit PlyC fortgeschritten thermische Verhalten ermittelt wird, Abrufen der ursprünglichen Platte bei 4 ° C und inoculate Bakterien aus der einzelnen Vertiefung spezifisch für die Mutante von Interesse in frischem LB-Medium mit Ampicillin und Chloramphenicol ergänzt gespeichert. Wachsen des Inokulums über Nacht bei 37 ° C.
7. Extrahieren und zu reinigen Plasmid-DNA aus der Kultur und dann legt für die Sequenzierung, um die Nukleotid-Mutationen, die verbesserte thermische Verhalten abzuleiten, um PlyCA identifizieren. Darüber hinaus ergänzen eine kleine Teilmenge der Übernacht-Kultur mit 10% Glycerin und bei -80 ° C zur weiteren Verwendung.

Results

Zum Abschluss der ersten Runde der Zufallsmutagenese wurden über 6.000 PlyC Mutanten gescreent und insgesamt 35 Mutanten mit potentiell erhöhten thermischen Verhaltens identifiziert, ausgewählt und sequenziert. Genomanalyse, die in Tabelle I zusammengefaßt, legt nahe, dass der 35 Kandidaten, 7 der Konstrukte enthalten WT PlyCA Sequenzen auf der Ebene der Translation, entsprechend Fehlalarme durch den Assay identifiziert. Von den verbleibenden 28 Kandidaten, war die Mutation Bereich von 1 bis 6 Nukleotid-Mutationen mit einem Durchschnitt von 2,75 Mutationsrate Nukleotide pro plyCA Gen, das in der 2-3 Nukleotid Mutationsbereich wir Targeting war. Auf der Ebene der Translation, ergab dies insbesondere Nucleotid-Mutation und Frequenz eine Aminosäuremutation Bereich von 1 bis 5 Aminosäuren, mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 1,9 Mutation Aminosäuremutationen pro PlyCA Polypeptids.

Von den 28 Kandidaten mit mindestens einer Aminosäure MutatIonen wurden vier dieser mutierten Konstrukte zufällig für die weitere Charakterisierung zu bestätigen, dass die umfangreiche Screening-Verfahren der gerichteten Evolution Methodik wurde in der Tat richtig funktioniert gewählt. Die mutierten PlyC Enzyme wurden zu> 95% Homogenität mittels SDS-PAGE-Analyse, wie oben beschrieben basierend ^6-7 gereinigt. Enzymkinetik von WT PlyC und jedem der vier PlyC Mutanten wurden in gleichen molaren Konzentrationen nach Inkubation der gereinigten Enzymen an verschiedenen erhöhten Temperaturen aufweist. Die Aktivität wurde nach der Zugabe von D471 GAS durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm alle 15 Sekunden für 20 min verfolgt. Aktivität wurde als die restliche maximale Geschwindigkeit des Enzyms nach Wärmeinkubation definiert. Von den vier Kandidaten nach dem Zufallsprinzip für die weitere Charakterisierung ausgewählt, zeigten Mutanten 29C3 am meisten verbesserten thermischen Verhalten. Das thermische Verhalten der WT PlyC und 29C3 wurde bei verschiedenen Temperaturen untersucht während Inkubieren und Testen auf Aktivität in PBS pH 7,2 bei80 nM und 40 nM Konzentrationen sind. Die 45-50 ° C Inkubationsexperimente (Abbildung 3) wurden in einem Thermocycler, wobei die Proben in einem dünnwandigen 96-Thermocycler Platte in einem Gesamtvolumen von 120 ul inkubiert wurden durchgeführt. Der 35 ° C, 40 ° C und 45 ° C Inkubationsexperimente (Abbildung 4 und 5) wurden in einem Heizblock bei dem die Proben in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem Gesamtvolumen von 1,3 ml inkubiert wurden durchgeführt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

WT PlyC und 29C3 zeigte keinen signifikanten Unterschied in kinetische Stabilität bei Raumtemperatur (25 ° C), wie in dem ersten Satz von Stangen in Abbildung 3 dargestellt. Nachdem jedoch eine kurzfristige Inkubation für 30 min von Temperaturen im Bereich von 45-50 ° C war die Aktivität von 29C3 wesentlich größer als die spezifische Aktivität zu dem WT-Konstrukt bei jeder Temperatur Punkt. Zum Beispiel, erscheint WT PlyC einen 44% igen Verlust an Aktivität bei 45,2° C während 29C3 zeigte nur eine 2% Verlust in der Aktivität bei der gleichen Temperatur.

Langzeitinkubation Studien Vergleichen der Restaktivität von sowohl WT PlyC und 29C3 wurden zusätzlich bei 35 ° C und 40 ° C mit der Messung der Restaktivität bei 24 und 48 h Zeitpunkten. Bei 35 ° C, erscheint 29C3 41% und 176% höhere Aktivität als WT PlyC bei 24 und 48 Stunden Inkubationszeit Punkten bzw. (Abbildung 4a). Bei 40 ° C, erscheint 29C3 28% und 107% höhere Aktivität als WT PlyC bei 24 und 48 h Inkubationszeit Punkten, bzw. (4b).

Die Restaktivität von WT PlyC und 29C3 wurden alle 20 min für insgesamt 3 Stunden bei 45 ° C überwacht WT PlyC konnte nur 21% der Aktivität nach einer 3-stündigen Inkubation bei dieser Temperatur halten während 29C3 konnte auf 46% Aktivität beibehalten. Die Halbwertszeit (t _1/2) für WT PlyC und 29C3 waren 67 und 147 min, bzw. schlagen ten, dass 29C3 hat eine 2,2 fache Erhöhung der kinetischen Stabilität bei 45 ° C (Abb. 5).

Insgesamt Runde 1 Bewerber	35
Kandidaten mit WT PlyCA Sequence	7
Kandidaten mit ≥ 1 Aminosäuremutation	28
- Durchschnittliche Nucleotide Mutation Rate (nt / plyCA)	2,75
- Nucleotide Mutation Range (nt)	1-6
- Durchschnittliche Aminosäuremutation Rate (AA / PlyCA)	1,9
- Amino Acid Mutation Range (AA)	1-5

Tabelle 1. Candidate Pool Genomic Analysis.

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Abbildung 1. Gerichtete Evolution Test-Methodik. In der gerichteten Evolution, beginnt man mit der Führung Enzym, das WT PlyC wäre für die erste Runde. Eine Bibliothek von Mutanten, die zufällige PlyC unvoreingenommene Nukleotid Mutationen zur plyCA Gen wird dann durch einen fehlerhaften DNA-Polymerase konstruiert, kloniert in den Expressionsvektor pBAD24 und in den E. coli-Stamm DH5a bereits enthaltenden pBAD33:. plyCB Einzelne Transformanten werden in ihre eigenen spezifischen well einer 96 well-Mikrotiterplatte inokuliert. Durch ein umfangreiches Screening-Verfahren werden einzelne PlyC Mutanten, die katalytisch aktiv sind nach Inkubation bei einer nicht-zulässigen Temperatur als Mutanten mit verbesserten kinetischen Stabilität klassifiziert. Theconstruct Anzeigen der meisten fortgeschritten Wärmeverhalten wird folglich wird das Blei Enzym für die nächste Runde der Zufallsmutagenese. Insgesamt gibt es drei komplette Runden random Mutagenese gefolgt von DNA-Shuffling, was zu einem bakteriolytischen Molekül mit entwickelt thermisches Verhalten. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 2. 96-well Mikrotiterplatte Vorlagen für die gerichtete Evolution Assay. Die Mikrotiterplatte schematische bei der Bestimmung der optimalen Heizbedingungen (Abbildung 2a) besteht aus Impfen einer einzigen elterlichen WT PlyC Klon in jeder Zeile der Mikrotiterplatte. Die Mikrotiterplatte schematische während Mutante Screening (2b) aus Inokulieren alle Vertiefungen in Spalte 1 mit einer einzigartigen elterliche WT PlyC Klon sowie Inokulieren alle Vertiefungen in Spalten 2-12 mit einer verschiedenen PlyC Mutante Klon. Wells A1-D1 sind für die positive elterliche Kontrolle, die zusammen bezeichnetnsist der WT PlyC Konstrukte nicht auf nicht zulässige Temperatur Inkubation ausgesetzt. Wells E1-H1 sind für die negativen Kindersicherung, welche von WT PlyC Konstrukte, die auf nicht-zulässigen Temperatur Inkubation ausgesetzt sind, bestehen bezeichnet.

Abbildung 3. Restaktivität kinetische Analyse Vergleichen WT PlyC und 29C3. Enzyme wurden bis zur Homogenität gereinigt und inkubiert für 30 Minuten in einem Thermocycler in gleichen molaren Konzentrationen entweder bei Raumtemperatur oder bei einem Temperaturgradienten im Bereich von 45-50 ° C. Enzymatische Aktivität korreliert mit der maximalen Geschwindigkeit nach bestimmten Temperatur Inkubation angezeigt. Mit Ausnahme der 25 ° C und 47,7 ° C, die Abweichung in der Aktivität zwischen WT und 29C3 bei jeder Temperatur korreliert, um einen p-Wert <0.05. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten angegeben.

Abbildung 4. Restaktivität kinetische Analyse Vergleichen WT PlyC bis 29C3 bei 35 ° C und 40 ° C äquimolare Konzentrationen von gereinigtem WT PlyC und 29C3 wurden in einem Heizblock bei 35 ° C (Fig. 4a) oder 40 ° C (4b) inkubiert. Die restliche Enzymaktivität wurde bei 24 und 48 h Zeitpunkten gemessen. Die Aktivität von jedem Konstrukt angezeigt wurde, um die Maximalgeschwindigkeit zum Zeitpunkt Null angezeigt normalisiert. Die Variation in der Aktivität zwischen WT und 29C3 bei jeder Temperatur und Zeitpunkt bis zu einem p-Wert <0.05 korreliert. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten angegeben.

Abbildung 5. Restaktivität kinetische Analyse verglichenWT PlyC bis 29C3 bei 45 ° C äquimolare Konzentrationen von gereinigtem WT PlyC und 29C3 wurden in einem Heizblock bei 45 ° C und die restliche Enzymaktivität wurde alle 20 min gemessen 3 h inkubiert. Die Aktivität von jedem Konstrukt angezeigt wurde, um die Maximalgeschwindigkeit zum Zeitpunkt Null angezeigt normalisiert. Mit Ausnahme der Datenpunkte bei 20 min, die Variation in der Aktivität zwischen WT und 29C3 zu jedem Zeitpunkt auf einen p-Wert <0.05 korreliert. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten angegeben.

Discussion

Dieses Protokoll, das in Abbildung 1 dargestellt, stellt eine 96-well Mikrotiterplatte Methodik, die ein bis gerichteten Evolution zu verwenden, um die Thermostabilität einer bakteriolytischen Enzyms erhöhen kann. Durch die Verwendung eines fehlerhaften DNA-Polymerase, einer zufälligen Mutationen, die die gesamte kinetische Stabilität des übersetzten bakteriolytischen Molekül von Interesse, das typischerweise durch molekularen Reorganisationen bestehend aus zunehmender elektrostatischen erhöhen einführen kann, Interaktionen Disulfidbrücke und hydrophoben erzeugen, die eine verbesserte Molekülpackung, erweiterte Modifikationen der Oberflächenladung Netzwerken oder Verstärkung einer höheren Oligomerisierungszustand ^17-18. Nach dem Einbringen von Nukleotid-Mutationen wurde ein umfangreiches Screening-Verfahren dann verwendet, um Mutationen, die thermisch nutzbringende identifizieren. Die repräsentativen hier vorgestellten Ergebnisse wurden auf einer Runde Zufallsmutagenese basiert. In Wirklichkeit ist vorgeschlagen worden, dassmindestens drei aufeinanderfolgenden Runden der Zufallsmutagenese ist jede Verwendung der robustesten Mutante als Lead Enzym, gefolgt durch DNA-Shuffling geeignet für diese Art der gerichteten Evolution thermischen Verhaltens in der ^2.

Es ist wichtig zu verstehen, dass, während diese Protokoll identifiziert Mutationen, die kinetische Stabilität zu vergrößern, diese Varianten nicht notwendigerweise Thermostabilität erhöht. Ein Molekül wird als thermostabile wenn es die Fähigkeit, seine Struktur auf einer hohen Temperatur zu halten hat. Jedoch in dem Assay präsentiert werden die Restaktivität der Mutante Lysaten nicht bei gleicher Temperatur, dass sie zunächst wurden während des Wärmebehandlungsschritts inkubiert und damit ein möglicherweise für Mutationen, die Rückfaltung anstatt verbesserte Thermostabilität ¹⁹ fördern Auswählen getestet. Während wir Extrapolieren thermische Verhalten als Hinweis auf thermische Stabilität muss wahre thermische Stabilität empirisch durch Biophys messendenical Methoden wie Circulardichroismus (CD), Differential Scanning Calorimetry (DSC) und Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF). Vorläufige Daten von CD und DSF Experimenten legen nahe, dass mehrere Kandidaten von der Methode vorgestellt identifiziert tatsächlich anzuzeigen fortgeschritten Thermostabilität (Daten nicht gezeigt).

Obwohl der hier vorgestellte Methode ist spezifisch für Anwendung erhöhten thermischen Verhalten PlyC kann diese gleiche Methode verwendet werden, um zusätzlich thermische Aktivität auf andere bakteriolytischen Enzymen steigern mit geringfügigen Veränderungen Variablen wie Puffer, Mutationsraten, Erwärmungsbedingungen und Expressionssysteme werden. Eine kritische Variable assoziiert mit diesem Assay betrifft die Nukleotid Mutationsrate des fehlerhaften DNA-Polymerase. Wir entschieden uns für die fehleranfällige Mutazyme II-DNA-Polymerase in unserem gerichtete Evolution Assay verwenden, durch experimentelle Hinweise darauf, diese besondere Enzym zeigt die geringste Vorspannung mitBezug auf die Nukleotide werden zufällig in dem interessierenden Gen eingebaut, wenn auf andere zufällige Mutagenese-Techniken, wie die Verwendung von Hydroxylamin, Mutator E. Vergleich coli-Stämme und andere fehleranfällige DNA polyermases ^20. Im Allgemeinen neigen niedrigere Mutationsraten zu sein aus zwei Gründen wünschenswert. Erstens Engineering Thermostabilität an Proteine ​​typischerweise aus relativ wenigen Aminosäuresubstitutionen. Hohe Mutationsraten kann dramatische strukturelle Veränderungen insbesondere Moleküle, die abschließend in strukturellen Fehlfaltung und funktionelle Abweichungen führen kann. Beispielsweise kann die Einarbeitung von Glycin und Prolin-Reste stören alpha schraubenförmigen sekundären Strukturen ^21. Sekunde, hohe Nukleotid Mutationsraten die Chancen erhöhen Einbeziehung vorzeitige Stoppcodons, was abgeschnitten Moleküle, die biologisch inaktiv sind. Im Allgemeinen werden niedrigere Mutationsraten bevorzugt, da geringere Fehlerraten Ergebnis im accumulation der adaptiven Mutationen während höhere Mutationsraten neutral oder schädlichen Mutationen zu erzeugen ^22.

Für jede Runde der Zufallsmutagenese, beinhaltet eine weitere kritische Variable, daß man Optimierung des Inkubationstemperatur während des Screening-Prozesses verwendet wird. Auswahl der experimentellen nicht-permissiven Temperatur ist relativ schwierig. Wir haben uns zunächst verwendet eine Inkubationstemperatur, die 10 ° C höher als die nicht-permissiven Temperatur von PlyC, aber nach Screening 3.000 Mutanten konnten wir keine vorteilhafte Mutationen zu identifizieren. Unter Berücksichtigung der gerichteten Evolution Methoden aus sequenziellen Identifizieren von Vorteil Aminosäuresubstitutionen, additive Wirkungen haben, wurde festgestellt, dass eine weniger strenge Temperatur während des Screening-Prozesses verwendet werden soll, auch wenn es die Möglichkeit der Erzeugung Fehlalarmen erhöht. Als solches verwendet man eine Inkubationstemperatur betrug die nur wenige Grad oberhalb der Nicht-Zulive Temperatur und nachgesiebt ausgewählten Bewerber auszuschließen, die False-Positives.

Wir entschieden uns, eine Inkubationstemperatur, die nicht allzu gemäßigten nutzen (≤ 1 ° C höher als niedrigsten nicht-permissiven Temperatur) und umgekehrt nicht zu hart (≥ 5 ° C höher als niedrigsten nicht-permissiven Temperatur). Die ideale Temperatur haben wir beschlossen, in diesem speziellen Assay verwenden, war eine moderate 2 ° C höher als die experimentell ermittelten nicht-permissiven Temperatur. Auswählen einer Temperatur, die zu mild ist, wird in einer wesentlich höheren falsch positiven Identifizierung Rate als die ~ 20% haben wir beobachtet (Tabelle I) ergeben bei Verwendung eines moderaten Inkubationstemperatur. Darüber hinaus konnte mit einer Inkubationstemperatur, die zu hart ist letztlich in der Unfähigkeit, Mutanten mit deutlich verbesserte thermische Verhalten zu identifizieren führen. Zum Beispiel mit einer Inkubationstemperatur von ≥ 5 ° C würde in der Unfähigkeit geführt haben, um die Identifizierungverspricht 29C3 Mutante als auch die Mehrheit der anderen Kandidaten in der ersten Screening-Runde ausgewählt.

In Summe bieten wir ein Protokoll für Engineering bakteriolytischen Enzyme verbesserte kinetische Stabilität zu erwerben. Darüber hinaus kann diese gleichen Assay ohne die Erwärmungsschritte, zum Screening auf Mutationen, die katalytische Aktivität zu erhöhen verwendet werden. Vermehrung sowohl katalytische Aktivität und Thermostabilität ist ein wichtiger Entwicklungs-Hürde keinen therapeutischen Enzym. Obwohl die Details dieser protokollspezifischen zum Endolysin PlyC sind, kann die Methodik einem bakteriolytischen Enzym mit nur wenigen Änderungen angepasst werden. Wir die vorläufigen Ergebnisse aus nur der ersten Runde der Mutagenese, die diese Funktionalität des Assay überprüft, was zur Umsetzung und zur Identifizierung von Mutationen, die eine Erhöhung der Thermostabilität von molekularen signifikanter Größe generieren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78260
GeneMorph II Zufallsmutagenese Kit	Agilent Technologies	200500
Löschen 96 Well, Flachboden-Mikrotiterplatte mit Deckel	BD Vacutainer Labware Medical	353072
96 Well Nonskirted PCR Plates	Fisher Scientific	14-230-232
Ausschwingrotor	Eppendorf	A-2-DWP
Ampicillin Sodium Salt	Fisher Scientific	BP1760
Chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904
Arabinose	Fisher Scientific	BP2504
pBAD24 Expression Vector	ATCC	87399
pBAD33 Expression Vector	ATCC	87402