Die Biosynthese von knorpeligen extrazellulären Matrix durch Chondrocyten können durch Einwirkung mechanischer Reize beeinflußt werden. Diese Methode beschreibt die Technik der Anwendung dynamisch Druckspannungen zu Chondrozyten in 3D-Konstrukte und die Auswertung der induzierten Veränderungen in Chondrozytenmetabolismus verkapselt.
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Methodenartikel
Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Gelenkknorpel leidet unter einer begrenzten Kapazität, wenn Reparatur durch mechanische Insult oder abgebaute durch Krankheiten, wie Osteoarthritis beschädigt. Um diesem Mangel abzuhelfen, haben mehrere medizinische Eingriffe entwickelt. Eine solche Methode ist, um den beschädigten Bereich mit Tissue-Engineering Knorpel wieder auftauchen, aber die gezüchteten Gewebe in der Regel fehlen die biochemischen Eigenschaften und Haltbarkeit von nativen Knorpel Frage der langfristigen Überlebensfähigkeit. Dies beschränkt die Anwendung von Knorpelgewebe Engineering zur Reparatur von kleinen fokalen Fehlern, die sich auf das umgebende Gewebe, um die implantierte Material zu schützen. Um die Eigenschaften des entwickelten Gewebe zu verbessern, ist eine mechanische Stimulation eine beliebte Methode verwendet, um die Synthese von Knorpel extrazellulären Matrix sowie die resultierenden mechanischen Eigenschaften des gezüchteten Gewebe zu verbessern. Mechanische Stimulation gilt Kräfte auf das Gewebe konstruiert analog zu den erfahrensten in vivo. Diesbasiert auf der Prämisse, dass die mechanischen Umgebung, teilweise, reguliert die Entwicklung und Wartung von nativem Gewebe 1,2 basiert. Die am häufigsten angewandte Form der mechanischen Stimulation im Knorpel Tissue engineering ist Dynamikkompression bei physiologischem Stämme von etwa 5-20% bei einer Frequenz von 1 Hz 1,3. Mehrere Studien haben die Auswirkungen der dynamischen Kompression untersucht und haben gezeigt, dass es einen positiven Effekt auf Chondrozytenmetabolismus und Biosynthese haben, letztendlich auch die funktionellen Eigenschaften des entwickelten Gewebe 4-8. In diesem Papier zeigen wir die Methode zur mechanischen Stimulierung Chondrozyten-Agarose Hydrogel Konstrukten unter dynamischer Kompression und Analyse der Veränderungen in der Biosynthese durch biochemische und radioaktiven Assays. Dieses Verfahren kann auch ohne weiteres modifiziert werden, um alle möglicherweise induzierte Veränderungen in zelluläre Reaktion als Folge der mechanischen Reizen zu beurteilen.
Protokoll
Ein. Isolation of Primary Chondrozyten
Ernte 10-15 volle Dicke Knorpel Scheiben von den Gelenkflächen des tierischen Gelenken (zB das Mittelhandknochen-Phalangealgelenk von ausgewachsenem Skelett Kühen von einem lokalen Schlachthof gewonnen).
- Ort Knorpel Scheiben in einer 100 mm Petrischale und Inkubieren in 20 ml 0,5% Protease in Ham-F-12 (w / v) für 2 Stunden bei 37 ° C. Spülen Sie drei Mal in Ham-F-12 Kulturmedien und inkubieren mit 20 ml 0,15% Collagenase A in Hams F-12 Kulturmedien über Nacht bei 37 ° C.
- Filtern der Zellsuspension durch ein 200 mesh-Sieb-Filter in einen sauberen Teller. Waschen Sie den Filter mit 5 ml Ham F-12 und zu dem Gericht. Übertragen der Zellsuspension in ein 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Petrischale mit 10 ml Ham F-12 und zu dem konischen Rohr.
- Zentrifugieren bei 600-800 rcf für 6-8 min bei Raumtemperatur.
- Überstand, wodurch nicht th störene Zellpellet und in 40 ml Ham-F-12 Kulturmedium erneut zu suspendieren.
- Zentrifugieren bei 600-800 rcf für 6-8 min.
- Wiederholen Schritte 1.4 und 1.5 noch zweimal mit insgesamt 3 mal. Vor dem Zentrifugieren zum dritten Mal, das Pellet über Agitation und erhalten eine 500 ul Aliquot zur Zellzählung.
- Zählen lebensfähigen Zellen unter Verwendung des Trypan-Blau-Ausschluss-Methode 9 mit einem Hämozytometer und eines invertierten Lichtmikroskops.
- Überstand und resuspendieren des Pellets in einem Volumen von Ham-F-12 Medium, um den gewünschten Einsaatdichte verdoppeln (z. B. 20 x 10 6 Zellen / ml für eine Endkonzentration von 10 x 10 6 Zellen / ml nach der Verkapselung).
2. Chondrozyten-Agarose Hydrogel Encapsulation
- Wärme 0,8 g autoklavierten Typ VII Agarose in 20 ml sterilem 1x PBS (pH 7,4) auf einer Heizplatte bei 120 ° C bis zur Auflösung. Einmal gelöst, die Hitze auf 60 ° C höhere Temperaturen als will beeinträchtigen die Lebensfähigkeit der Zellen.
- In einem 50 ml konischen Röhrchen wird gründlich gemischt gleichen Volumina der Zellsuspension mit der doppelten gewünschten Konzentration aus Agarose (z. B. 4% Agarose Suspension für eine abschließende 2% Agarose Hydrogel). Vermeiden Sie die Erstellung von großen Blasen, wie sie die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen können und bauen Lebensdauer.
- Sorgfältig Aliquot von 10 ml der Chondrozyten-Agarose Mischung in eine 60 mm Petrischale Durchmesser, unter Vermeidung der Bildung großer Blasen.
- Lassen Sie stehen für 30 min bei Raumtemperatur bis geliert.
- Zu erhalten, wie viele Chondrozyten-Agarose Hydrogel Proben nach Bedarf (typischerweise 20-30) mit einem 4 mm Biopsiestanze.
- Messung und Aufzeichnung der physikalischen Abmessungen (Durchmesser und Höhe) von repräsentativen Proben mit einem Mikrometer. Konstrukte sollte etwa 5 mm betragen in der Höhe, verwerfen Proben aus einem Bereich, wo der Probenhöhe Varianz größer als 2% erhalten.
- Übertragen Proben zu einem neuen 60 mm Petrischale und Ergänzungmit 10 ml komplettem Medium (z. B. 20% fötalem Rinderserum in Ham-F-12 Kulturmedium mit 20 mM HEPES, 100 ug / ml Ascorbinsäure und 2x Antibiotika / Antimykotika).
3. Mechanische Stimulation und Radiomarkierung von Chondrozyten-Agarose Hydrogele
- Autoklaven werden die metallischen Komponenten des Kompressions-rig. Sterilisieren Sie die Kunststoffteile mit 70% Ethanol (über Nacht) und UV-Licht (mindestens 15 min).
- Konstrukte Umfallen, mit Pinzette Platz 12 sterile Plastik Halteringe (mit einem Innendurchmesser größer als der Durchmesser Konstrukt) (n = 6, Proben und Kontrollen) innerhalb der Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte zu halten.
- Mit einer Pinzette, transferieren es vorsichtig die Chondrozyten-Agarose Hydrogele aus der Petrischale auf den 24-Well-Platte, die Sicherung jedes in einem Haltering.
- Übertragen 400 ul komplette Medien (zB 20% FBS in Ham-F-12 Kulturmedium mit 20 mM HEPES, 100 ug / ml Ascorbinsäure und2x Antibiotika / Antimykotika) zu jedem Probenbehälter.
- Montieren Sie die sterilisiert Kompression rig (Abbildung 1) und befestigen Sie die Platten mit Stellschrauben. Bringen Sie die Kompression rig auf die 24-well Platte.
- Lösen und wieder sichern die Stellschrauben Platte-Hydrogel-Kontaktlinsen (spannungslosen Zustand) zu etablieren.
- Legen Sie die zusammengebauten Kompression rig in eine Mach-1 Mikromechanische Testing System. Sichere rig auf die vertikale Stufe über Fixierstift und einrasten mit Stellschraube. Entfernen Sie den Abstand jig.
- Anwenden dynamischen Druckbelastung an gewünschten Amplitude (z. B. 10% Dehnung Amplitude auf der ursprünglichen Höhe der Proben basierend), Frequenz (zB 1 Hz) und Dauer oder Anzahl der Zyklen (zB Zeitintervallen bis zu 60 min).
- Nach Abschluss der mechanischen Stimulation, ersetzen Sie den Abstand jig, lösen Sie die Fixierstift Stellschraube und entfernen Sie die Kompression rig und Kultur Platte aus dem Mach-1 Mikromechanische Testing System.
- Radiomarkierung Zell-Hydrogel-Konstrukte durch Ergänzung der Medien mit 5 uCi gewünschte Isotop (zB [3 H]-Prolin-Protein-Label für Chondrozyten-spezifische Kollagen-Synthese und [35 S]-Schwefel für Proteoglykan-Synthese).
- Inkubieren der radiomarkierten Konstrukten für 24 h bei 37 ° C, 5% CO 2 10.
- Ernten Sie die radioaktiv markierten Hydrogel Konstrukten und spülen 3 mal in 1x PBS (pH 7,4) auf eine nicht rechtsfähige Isotop entfernen. Ausgewählte Proben unter Verwendung von Papain (40 ug / ml in 20 mM Ammoniumacetat, 1 mM ethyldiaminetetraacetic Säure und 2 mM Dithiothreitol bei 65 ° C für 72 h).
- Assay Digest für DNA-Gehalt mit dem PicoGreen Farbstoff Assay 11 und eingebauten Isotops Aktivität, normiert auf DNA-Gehalt von β-Flüssig-Szintillationszählung 12,13 unmittelbar folgenden Papainverdau.
Hinweis: Der Kauf und die Entsorgung von radioaktiven Materialien (Abfälle Isotope und Artikeldie möglicherweise in Kontakt radioaktiver Stoffe gekommen sind) müssen den einschlägigen institutionellen (und / oder staatlichen) Vorschriften und Verfahren für die sichere Handhabung und Entsorgung von radioaktiven Substanzen.
4. Repräsentative Ergebnisse
Bovine Gelenkchondrozytenprobe-Agarose Hydrogele Konstrukte (2% Agarose mit 10 x 10 6 Zellen / ml eingekapselten Zellen) wurden mechanisch mit einer Amplitude von 10% Stauchung bei einer Frequenz von 1 Hz für 20 bis 60 min (oder 1.200 bis 3.600 Zyklen angeregt ) und im Hinblick auf DNA-Gehalt und extrazellulären Matrix-Synthese durch Einbau Radioisotop. Und extrazellulären Matrix-DNA-Synthese wurde in einer Dosis-abhängigen Weise beeinflusst. DNA-Gehalt zeigte eine signifikante Abnahme von 35% als Ergebnis von 20 oder 30 min der Stimulation (p <0,01), während 60 min Stimulation zeigte keinen Effekt (Abb. 2). Knorpel-spezifische Kollagen und Proteoglykan-Synthese (bestimmt durch [3 H]-Prolin und[35 S]-Schwefel Einarbeitung jeweils) zeigten signifikante Anstiege von etwa 60% in Reaktion auf 20 bis 30 min der Stimulation (p <0,01), 60 min mit der Stimulation aufweist keinen beobachtbaren Effekt (Abb. 3).
. Abbildung 1 Schematische Darstellung des custom-built dynamische Kompression rig zur Stimulierung Chondrozyten-Agarose Konstrukte. Links: Assembled rig. Rechts: Explosionszeichnung zeigt Einzelkomponenten.
Abbildung 2. Veränderungen in der DNA-Gehalt der Chondrozyten-Agarose Hydrogele mechanisch unter einer 10% Stauchung Amplitude bei 1 Hz für 20 bis 60 min (Mittelwert ± SEM, n = 6/Gruppe) stimuliert.
Abbildung 3. Veränderungen der extrazellulären Matrixsynthese (Kollagen und Proteoglykane) der Chondrozyten-Agarose Hydrogele mechanisch unter 10% Stauchung Amplitude bei 1 Hz für 20 bis 60 min (Mittelwert ± SEM, n = 6/Gruppe) stimuliert.
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Diskussion
Das beschriebene Verfahren für das Auftragen kontrollierter mechanische Reize auf Zellen seeded Agarose Hydrogele ermöglicht die direkte Untersuchung der Auswirkungen von dynamischen Druckkräfte auf Chondrozytenmetabolismus. Die Verwendung des kundenspezifischen Prüfstand in Verbindung mit den Halteringen versehen seitliche Beschränkung für die Konstrukte, um mögliche Probleme der Probe Kippen zu vermeiden. Die Verwendung von dead-gewichtete Belastung Platten durch Mengen Crews gesichert gewährleistet den direkten...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagens oder Ausrüstung | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| Ham-F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd | P5147 | |
| Fötales Rinderserum | Sigma Aldrich Ltd | F1051 | |
| Ascorbat | Sigma Aldrich Ltd | A4034 | |
| Antibiotika / Antimykotika | Sigma Aldrich Ltd | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd | HEP001 | |
| Trypanblau | Sigma Aldrich Ltd | 93595 | |
| Reichert Hell-Line Hämazytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain aus Papaya Latex | Sigma Aldrich Ltd | P3125 | |
| Ammoniumacetat | Sigma Aldrich Ltd | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Säure | Sigma Aldrich Ltd | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd | 43819 | |
| Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, Typ VII | Sigma Aldrich Ltd | A9045 | |
| Mesh-Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd | S4145 | |
| Mach-1 Mikromechanische Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Ein Produkt ähnlich könnte Biomomentum Inc. geliefert werden | |
| Falcon 24 Well Zellkulturplatten | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Flüssigkeits-Szintillationszähler | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
Referenzen
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