Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

Summary

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Abstract

Nos mamíferos, muitos aspectos do comportamento e fisiologia, tais como ciclos de sono-vigília e metabolismo do fígado são regulados pela endógenos relógios circadianos (revisado ^1,2). O sistema de cronometragem circadiano é uma rede multi-oscilador hierárquica, com o relógio central, localizado no núcleo supraquiasmático (SCN) a sincronização e coordenação de relógios SCN-extra e periférico em outro lugar ^1,2. As células individuais são as unidades funcionais para a geração e manutenção de ritmos circadianos ^3,4, e estes osciladores de diferentes tipos de tecidos de um organismo a percentagem notavelmente semelhante mecanismo de feedback negativo bioquímico. No entanto, devido a interacções a nível de rede neuronal no SCN e através rítmicos, pistas sistémicos ao nível dos organismos, os ritmos circadianos no nível organismal não são necessariamente células autónoma ^5-7. Em comparação com estudos tradicionais de actividade locomotora in vivo e ex vivo explantes SCN, cell com base em ensaios in vitro permitir a descoberta de células autônomas defeitos circadianos ^5,8. Estrategicamente, baseados em células modelos são mais tratáveis ​​experimentalmente para a caracterização fenotípica e rápida descoberta de mecanismos de clock básico ^5,8-13.

Porque os ritmos circadianos são dinâmicos, medições longitudinais com alta resolução temporal são necessários para avaliar a função do relógio. Em anos recentes, a gravação em tempo real usando a bioluminescência de luciferase do pirilampo, como repórter tornou-se uma técnica comum para o estudo de ritmos circadianos em mamíferos ^14,15, uma vez que permite o exame da persistência e da dinâmica de ritmos moleculares. Para monitorar a célula-autónomos ritmos circadianos de expressão do gene, os repórteres de luciferase pode ser introduzido em células através de transfecção transiente ^13,16,17 ou transdução estável ^5,10,18,19. Aqui descrevemos um protocolo de transdução estável usando lentivírus mediada entrega de genes. Tele sistema vector lentiviral é superior aos métodos tradicionais, tais como a transfecção transiente e transmissão germinal devido à sua eficácia e versatilidade: ela permite a entrega eficiente e a integração estável no genoma do hospedeiro de ambos dividindo e não as células em divisão ^20. Uma vez que uma linha celular repórter é estabelecida, a dinâmica da função de relógio pode ser examinado através da gravação de bioluminescência. Nós primeiro descrever a geração de P (Per2)-D linhas repórter Luc, e em seguida, apresentam dados deste e de outros repórteres circadianos. Nestes ensaios, os fibroblastos 3T3 de rato e células de osteosarcoma humano U2OS são utilizados como modelos celulares. Também discutimos várias formas de utilizar esses modelos de relógio em estudos circadianos. Métodos descritos aqui podem ser aplicados a uma grande variedade de tipos de células para o estudo da base molecular e celular do relógio circadiano, e pode ser útil na resolução de problemas em outros sistemas biológicos.

Protocol

1. Construção de Lentiviral Repórteres luciferase

A construção repórter de mamífero circadiano geralmente contém uma cassete de expressão no qual um promotor circadiano é fundido com o gene da luciferase. Ambas as estratégias de ligação e de recombinação baseada são comumente usados ​​para a clonagem de DNA. Como um exemplo, aqui descrevemos um método baseado em recombinação clonagem Gateway para gerar um P (Per2)-d repórter Luc lentiviral, em que a luciferase desestabilizado (d Luc) está sob o controle do promotor do rato Per2.

1. A clonagem do promotor Per2. Use PCR para amplificar o fragmento de DNA Per2 promotor de 526 bp a montante do sítio de iniciação da transcrição a partir de um clone BAC Per2 rato ^9-13, utilizando um iniciador directo (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') e um iniciador reverso (5' CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC-TTGG-3 '), e do clone em pENTR5'-TOPO vector (Invitrogen) para gerarpENTR5'-P (Per2).
2. Clonagem de d Luc. O Luc d contém o gene da luciferase do pirilampo e de uma sequência PEST C-terminal por degradação de proteínas rápida como anteriormente descrito ^21. Use PCR para amplificar o fragmento de DNA d Luc, e clone em pENTR / D-TOPO vector (Invitrogen) para gerar pENTR / Dd Luc.
3. Construção do vector repórter. Misture os dois plasmídeos pENTR, pENTR5'-P (Per2) e pENTR / Dd Luc, com o vetor de destino lentiviral pLV7-BSD (BSD, blasticidina gene de resistência), e realizar a reação de recombinação usando Clonase para gerar um pLV7-BSD-P (Per2)-d repórter Luc (Figura 1). pLV7-Bsd é uma versão modificada (feito no nosso laboratório) de pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen), em que o vírus da hepatite da marmota pós-transcricionais reguladoras de elementos (WPRE) sequências de ²² foram inseridos imediatamente a jusante da expressão de ca ssette para aumentar a expressão do gene.

2. Produção de Partículas Lentiviral

1. Células de sementes 293T (dia 1)

1. Crescer de rim embrionário humano (HEK) 293T células até à confluência em DMEM 90-100% normal suplementado com FBS a 10% e penicilina-estreptomicina 1x-Glutamina (PSG) em placas de cultura de 10 cm. (Células com crescimento acelerado, com número de passagens baixo são essenciais para transfecção eficiente.)
2. Antes de semear as células para transfecção, revestimento placas de cultura de 6 poços por adição de 1 ml de 0,001% de poli-L-lisina em PBS a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Aspirar a solução e lavar uma vez com 1x PBS antes da utilização.
3. Dissociar células 293T com tripsina e de sementes 0,75 x 10 ⁶ células para cada poço das placas pré-revestidas com 2 ml de DMEM regular. Redemoinho as placas cuidadosamente para se obter uma distribuição uniforme de células em cada poço. Crescer as células na incubadora a 37 ° C durante a noite.

tep "> 2 transfecção. Transient via _CaPO4 / precipitação do DNA (dia 2)

1. Observe as células semeadas a partir do dia 1. Celular deve chegar a confluência de 80-90%.
2. Preparar a mistura de transfecção do plasmídeo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por adição de 2 ug de ADN de um plasmídeo repórter lentiviral (por exemplo, pLV7-P (Per2) d-Luc; Liu lab) e os três vectores de empacotamento (1,3 ug Gag / Pol, 0,5 ug Rev, e 0,7 ug VSVG; Invitrogen). Como controlo, tanto para a transfecção e infecção subsequente, que geralmente incluem um poço adicional na transfecção de um vector lentiviral expressão da GFP, pLV156-CMV-EGFP (Figura 1A), abrigando proteína verde fluorescente melhorada (EGFP), sob o controlo do promotor de CMV como descrito previamente ^20.
3. Adicionar 100 ul de 0,25 M _de CaCl2 (diluído com DNase / RNase DDH ₂ O estoque de 2,5 M) à mistura de plasmídeo no passo 2 e misturar bem. Em seguida adicionar 100 ul de solução de BBS 2x (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM de Na ₂ HPO _4, pH 6,95) e misturar suavemente mas profundamente. Incubar a mistura de ADN à temperatura ambiente durante 15 min.
4. Enquanto espera, aspirar médio a partir de células 293T e altere a 2 ml de meio fresco. Regressar a placa à incubadora durante pelo menos 10 min para equilibrar o pH do meio antes da transfecção.
5. Adicionar mistura de transfecção a partir do passo 3 para células 293T gota a gota. Placa Mexa suavemente e observar a formação de partículas sob um microscópio. Incubar em _5% de CO2, 37 ° C durante a noite. (Formação de partículas finas de CaPO precipitado ₄ / DNA é crítica para a transfecção eficiente.)

3. Partículas virais de colheita (dias 3-4)

1. Cerca de 16 horas após a transfecção (dia 3), através da qual as células de tempo deve chegar a 100% de confluência, aspirar meio de células e substituir com 2 ml de DMEM fresco regular. Incubar a 37 ° C durante a noite.
2. No dia 4, avaliar a eficiência de transfecção pela observação de expressão EGFP em transfection células de controlo (A eficiência de transfecção de 90-100%, com maior expressão EGFP é uma previsão fiável de uma boa preparação viral.)
3. Recolher o meio contendo segregadas, partículas virais infecciosas. Centrifugar a> 2000 xg durante 5 min para remover residuais células 293T e recolher o sobrenadante contendo vírus. Alternativamente, o meio pode ser limpo com um filtro de membrana de 0,45 um. As partículas virais estão prontos para utilização na infecção.

3. A infecção de células 3T3

1. As células 3T3 de semente (dia 3)

Dividir e número de sementes apropriada (~ 12000) de células 3T3 numa placa de 12 poços para se obter 20-30% de confluência por dia seguinte. Incubar a 37 ° C durante a noite.

2. Infectar as células 3T3 (dia 4)

1. Observe as células semeadas. Confluência de 20-30% (menos do que 50%) é desejado para a infecção.
2. Adicionar polibreno a uma concentração final de 5 ug / ml para o meio recolhido contendo viralpartículas. Misturar bem por pipetagem.
3. Aspirar meio de células 3T3 e adicionar 1 ml da mistura acima viral por poço. Incubar a 37 ° C durante a noite. (Polybrene é utilizado para melhorar a eficiência de infecção, mas não é absolutamente necessário. Como pode ser tóxico para algumas células, o teste prévio é recomendado.)

3. Selecione as células infectadas (dia 5 em diante)

1. Vinte e quatro horas após a infecção, aspirar meio contendo polibreno vírus e de células infectadas, lavar uma vez com PBS 1x e mudar para meio fresco. Incubar a 37 ° C durante a noite para a recuperação e crescimento.
2. Quando confluentes (geralmente 1-2 dias mais tarde), dividir as células e incubar a 37 ° C durante a noite.
3. No dia seguinte meio, aspirado a partir de células (<50% de confluência é desejada) e substitua com meio fresco contendo 10 ng / ml para seleccionar blasticidina para estavelmente transduzidas células. (Blasticidina matar-curva tem de ser determinado empiricamente para uma linha de células particular.)

4. Gravação de bioluminescência de Células Reporter

1. Repórter células de sementes

Propagar células resistentes blasticidina repórter e dividida em placas de cultura de 35 mm. Incubar a 37 ° C até à confluência. Nós normalmente preparar ≥ 3 pratos para cada linha de células repórter em cada condição para fenotipagem circadiano.

2. Sincronização e mudança de meio de gravação

1. Aspirar meio a partir de células confluentes repórter, lavar uma vez com PBS, e substituir com DMEM contendo 10 mM de forskolin (ou 200 nM de dexametasona). Incubar a 37 ° C durante 1 hora, para sincronizar as células. (Alternativamente, as células podem ser sincronizados por ²³ ciclos de temperatura ou de choque de soro ^24.)
2. Enquanto espera, prepare recordeing meio para células 3T3 como se segue: 1x DMEM (HyClone) contendo 10% FBS, 1x pH Pen / Strep / Gln, 1 uM de forscolina, 1 mM de luciferina, 25 mM de HEPES, 7,4. Soro ea concentração de forskolin pode ser determinada empiricamente. No caso de células muito fraca, média livre de vermelho de fenol podem ser usados.
3. No final do tratamento de forscolina, aspirar meio e substituir por meio de gravação feita recentemente.

3. Gravação bioluminescência de células repórter

1. Após a mudança médio, cobrir placas de cultura com 40 milímetros lamínulas estéreis e selo em lugar com graxa de vácuo para evitar a evaporação.
2. Carregar os pratos para o luminómetro LumiCycle, que é mantido no interior de um conjunto de incubadora a 36 ° C sem H ₂ O ou CO _2.
3. Iniciar gravação em tempo real de bioluminescência. Nós normalmente gravar ritmos durante 1 semana, seguido por troca de meio e de gravação contínua para uma segunda semana (ver Savelyev et al. Para mais pormenores) ^25. (Para gravação de 96 nósll, placas Synergy SL2 foi usado como o dispositivo de gravação, ver Discussão 1.1 para detalhes).

5. Análise de Dados e Apresentação

Células repórter facilitar alta resolução de gravação de luminescência quantitativa, fundamental para determinar efeitos fenotípicos sobre a função do relógio circadiano. Para obter parâmetros circadianos, incluindo fase, a duração do período, amplitude, ritmo e taxa de amortecimento, usamos o programa de Análise LumiCycle (Actimetrics) para analisar os dados de bioluminescência ^5,14. Resumidamente, os dados em bruto são de linha de base equipado primeiramente, e da linha de base-subtraídas dados são montados a uma onda seno, a partir da qual os parâmetros são determinados. Para amostras que mostram ritmos persistentes, bondade do ajuste de> 90% é geralmente obtida. Devido à elevada transiente bioluminescência após mudança de meio, que normalmente excluir o primeiro ciclo de análise de dados.

Para a apresentação dos dados, que geralmente traçar dados brutos (bioluminescência, contagens / s) contra time (dias). Quando necessário, os dados de linha de base, podem ser representados subtraídos para comparar a amplitude e fase.

6. Resultados representativos

1. Fase específicos repórteres circadianos

O relógio circadiano baseia-se num mecanismo de feedback negativo bioquímico ^1. O ciclo de realimentação núcleo é constituído de ativadores transcricionais Bmal1 e relógio, e Pers repressores e Crys, que atuam sobre os elementos circadianos E / E'caixa-Enhancer para produzir a expressão do gene rítmica (com fase de manhã, por exemplo, Rev-erb α). O laço núcleo regula e integra pelo menos dois outros circadianos cis-elementos, o elemento de ligação DBP/E4BP4 (D-box, para fase de dia, por exemplo, Per3) eo elemento ROR / REV-ERB ligação (RRE, por fase de noite, por exemplo, Bmal1) ^17. Regulação combinatória por múltiplos elementos circadianos pode gerar novas fases intermediárias. Por exemplo, a transcrição Cry1ção é mediada por todos os três elementos circadianos (isto é, os elementos E, / E'-box e D-box no promotor e RREs no primeiro intrão do gene Cry1), dando origem ao distinto Cry1 fase noite tempo ^13.

Com base nestes mecanismos de regulação dos genes, foram geradas quatro construções repórter diferentes: P (Per2) d-Luc e P (Cry1)-D repórteres Luc contendo tanto E / E'-caixa e da caixa D-elementos na região reguladora ^{17, 26,27;} P (Cry1) - Intron-d Luc representando regulação combinatória por todos os três elementos (ou seja, E / E'-box, D-box, e RRE) ^13,17, e P (Bmal1)-d Luc regulada exclusivamente por RRE ^9,17,19,21. Introduzimos estas repórteres em células 3T3 para produzir as fases antecipadas distintos de expressão repórter (Figura 2).

2. Knockdown do gene através de RNAi e farmacologicamente active compostos

Quando a eficiência de transfecção é elevada, siRNA sintético pode ser transientemente transfectados para células de derrubar a expressão do gene. Quando a transfecção é tecnicamente difícil, um vector de expressão podem ser estavelmente shRNA transduzida em células por meio de infecção por lentivírus, de modo a que shRNA produzido pela célula é processada para siRNA para knockdown do gene (KD). Apresentamos aqui os efeitos de KD Cry1 e cry2 genes utilizando siRNA em células U2OS (Figura 3A) e em células 3T3 shRNA, utilizando um vector de expressão de Gateway pLL3.7 ⁹ (Figura 3B). Além de células 3T3, o modelo U2OS tornou-se outro modelo de relógio proeminente celular em grande parte porque ele atende aos requisitos fundamentais para high-throughput screening de bibliotecas disponíveis comercialmente siRNA humanos (por exemplo, origem humana, capaz de gerar fortes ritmos circadianos, função validada de todos os conhecidos genes do relógio, e passíveis de transfecção altamente eficiente egravação de luminescência quantitativa). Em ambos os tipos de células, RNAi mediada KD resultou em fenótipos de relógio consistentes com knockout rato anterior (KO) e estudos celulares KD ^5,10,11,28. Por exemplo, Cry1 KD duração do período diminui e reduz a persistência do ritmo, enquanto cry2 KD prolonga período. Além disso, pequenas moléculas seleccionadas podem ser utilizadas para farmacologicamente alvo e a função da proteína perturb (Figura 3C).

Figura 1. O lentivírus mediada por sistema de entrega de genes. (A) Diagrama esquemático de dois P lentiviral (Per2)-D vetores repórter Luc e uma CMV-EGFP construir. Apenas a região para a integração no genoma da célula hospedeira é mostrado. Em ambas as construções repórter, a transcrição de d Luc está sob o controlo directo do promotor Per2. No pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc vetor (recombinação baseada clonagem), um gene de resistência à blasticidina coexpressas (BSD) facilita a selecção de células infectadas. No pLV156-P (Per2) d-Luc vector (ligadura baseado clonagem), tradução EGFP é mediada por um local interno de entrada do ribossoma (IRES) a jusante da d Luc, permitindo por meio de observação visual e triagem por FACS de células infectadas. Além disso, um promotor de SV40 / terminador (P / T), é usado como isolante (ver discussão 1.3). No vector de controlo CMV-EGFP, expressão EGFP está sob controle de um promotor de CMV forte. (B) as imagens fluorescentes de GFP-transfectadas e infectadas que expressam as células. Tipicamente, conseguimos alta eficiência tanto na transfecção transitória de células 293T e na infecção por lentivírus de linhas de células do nosso interesse, como indicado pela expressão de GFP nestas células. para ver figura maior .

Figura 2. Fase a expressão específica de repórteres em células 3T3 de bioluminescência Os vectores lentivirais repórter utilizados nesta experiência são pLV7-Bsd-P (Per2) d-Luc, P (Cry1) d-Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, e P (Bmal1) d-Luc. Cada repórter apresenta uma fase distinta de oscilação, como indicado pelas setas. Enquanto o Per2 e Cry1 bioluminescência unidade promotores de pico na manhã de dia-fases e do promotor na fase Bmal1 noite, regulação combinatória pelo P (Cry1) - Intron abrigar E-box, D-box, e elementos RRE confere fase noite de bioluminescência de pico . Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3. Perturbação genética e farmacológicas dos ritmos circadianos em células de bioluminescência repórter. (A) Efeitos de Cry1 e cry2 knockdown por siRNAs sobre ritmos celulares de células repórter U2OS. O luminómetro LumiCycle foi utilizado para a gravação de bioluminescência de células em pratos de 35 mm. A Figura é adaptado de Referência n º 10, com a permissão da Elsevier (2009). (B) Efeitos da cry2 knockdown por shRNAs sobre ritmos celulares de células repórter 3T3. Um vector de Gateway pLL3.7 contendo uma cassete de U6-shRNA foi usada para knockdown cry2 gene. shRNA2 tem uma eficiência melhor do que knockdown shRNA1 como determinado por análise de Western blot (dados não mostrados). Um luminómetro Synergy foi utilizado para a gravação de bioluminescência de células numa placa de 96 poços. As configurações de gravação são as seguintes:. Incubadora de temperatura, 33 ° C, o tempo de integração de 15 segundos, o tempo de intervalo, 30 min (C) Efeitos de inibidores de moléculas pequenas em celritmos intracelulares de células repórter U2OS. Chir99021 Roscovitina e são inibidores dirigidos contra a GSK-3 e CDK, respectivamente. O sistema ViewLux (Chir99021 ensaio) e um luminómetro Tecan (Roscovitina ensaio) foram utilizadas para as gravações de bioluminescência de células em 384 poços. Figura é adaptado de Referência # 19 (Copyright 2008 Academia Nacional de Ciências dos EUA). Clique aqui para ver maior figura .

Discussion

1. Modificações protocolo atual

1.1 dispositivos de gravação e considerações de rendimento

Devido à sua disponibilidade comercial, a LumiCycle (Actimetrics) tornou-se o dispositivo de luminimetro mais comumente utilizado automatizado para gravação em tempo real ^{4,5,9,19,29-31.} O LumiCycle emprega tubos fotomultiplicadores (PMT), como detectores de luz, que proporcionam sensibilidade extremamente elevada e baixo ruído ^14, e, por conseguinte, é particularmente adequado para a aquisição de dados de extremamente fraca bioluminescência luciferase baseado. Outros semelhantes PMT dispositivos baseados em (por exemplo, Kronos, Atto Co. e polarstar Optima, BMG Labtech Inc.) também têm sido utilizados em vários estudos ^32,33.

O ensaio LumiCycle utilizando pratos de 35 mm pode ser adaptado a 96 -, 384 -, ou mesmo 1152 formatos de placa de poços para rastreio de alto rendimento (HTS) experiências. HTS ensaio desenvolvimento incide principalmente sobre os seguintes aspectos: 1Melhores) com células repórter de luciferase mais brilhante e expressão repórter / ou superior (ver abaixo), e 2) dispositivos de gravação de alta sensibilidade, que podem acomodar multi-poços. Nós e outros têm utilizado vários leitores de microplacas, como Sinergia SL2 (BioTek), M200 Infinito (Tecan) ^19, TopCount (PerkinElmer) ^28, e EnVision (Perkin Elmer) ^34. No nosso laboratório, tanto o LumiCycle e dispositivos de sinergia são colocadas numa incubadora de temperatura controlada e à prova de luz. Alternativamente, se os recursos permitirem, as unidades de gravação podem ser colocadas numa sala com temperatura controlada. Para HTS, críticos, tais como configurações de integração / tempo de exposição e intervalo de tempo entre pontos de tempo tem de ser determinado empiricamente para uma dada repórter e um dispositivo de gravação.

O ensaio LumiCycle não fornece informação espacial em resolução única célula. Yamaguchi et al. ³⁵ e Welsh et ai. ^4,5 pioneira imagens em tempo real por bioluminescência integrating um microscópio especialmente concebido com um altamente sensível, câmera CCD de baixo ruído ¹⁵ para conseguir a resolução única célula. Nos últimos anos, os sistemas de imagiologia mais sensíveis tornaram-se disponíveis comercialmente, incluindo LV200 (Olympus) e CellGraph (AB3000-B, Atto) arrefecida com um ultra-sensível e retro-iluminado electrões multiplicando filtros CCD e multicolor ^36,37. Imagiologia também tem sido utilizada em experiências mais sofisticadas HTS, por exemplo, um sensor CCD ViewLux (Perkin-Elmer), combinada com o sistema automatizado GNF robótico (Sistemas GNF). Este sistema permitiu a grande escala para telas de novos genes e moléculas pequenas que afectam a função do relógio ^10,12,19.

1,2 repórteres luciferase

Luciferases foram utilizados pela primeira vez na gravação em tempo real de luminescência da expressão do gene circadiano no início de 1990 em plantas e cianobactérias, e têm sido comumente usado no sistema de mamíferos desde 2000 ^29,35,38-40 (also ver comentários ^14,15). Repórteres de luciferase são geralmente menos tóxico e mais sensíveis do que os repórteres fluorescentes, tais como a GFP, devido ao fundo muito mais baixo ^41. O repórter mais vulgarmente utilizadas bioluminescente é a luciferase do pirilampo (Photinus pyralis) (Luc +) construída no vector pGL3 série (Promega), no qual a região de codificação do Luc nativa foi modificada para a transcrição e tradução optimizado. A combinação de luciferase de pirilampo e o seu substrato, altamente estável e célula-permeável, D-luciferina, é ideal para a gravação de longa duração. d Luc é uma versão modificada de Luc + com uma sequência PEST fundida na sua extremidade C-terminal para permitir a degradação de proteínas rápida. Uma versão melhorada, Luc2, está disponível na série de vectores pGL4 (Promega) com a expressão mais elevada e menos anómala. No entanto, não observamos uma diferença significativa de desempenho entre Luc + e Luc2 no transitoriamente transfectadas Células 3T3 e U2OS (dados não mostrados). Em um relatório recente, o brasileiro clique besouro luciferase (E Luc) foi mostrado para exibir um sinal muito mais brilhante do que Luc +, apropriado para imagens de células único ^42.

Muitos estudos recentes têm aproveitado o mPER2 :: LUC fusão bater em repórter do mouse ^{4,5,9,19,25,29-31,43.} Este sistema permite que a fenotipagem circadiano repórter de células e de explantes de tecidos, incluindo o SCN. Nos nossos estudos anteriores, cruzado esta linha rato repórter com muitos dos genes knockouts comportamentalmente caracterizadas relógio e para a dinâmica do ritmos bioluminescência no fígado SCN, e os explantes pulmonares cultivadas ex vivo, e em neurónios do NSQ dissociadas e fibroblastos cultivados in vitro ^{4, 5,9,31.} Esses estudos permitiram obter insights importantes sobre os detalhes moleculares de operação do relógio nos níveis celulares e organismos.

1,3 entrega métodos Gene

e_content "repórteres> Vector baseados relógio proporcionar uma grande versatilidade, pois podem ser introduzidos em vários tipos de células, através de transfecção transiente ^11,13,16,17 ou transdução lentiviral ^5,9,18. Embora pesados ​​e menos reprodutíveis, as células transfectadas de forma transiente pode também ser cultivadas na presença continua de antibióticos para gerar linhas celulares estáveis. lentivirais ainda são preferidos devido à sua integração estável no genoma da célula, bem como a uma maior eficiência e versatilidade. Além do vector pLV7 apresentada acima, em que as células infectadas podem ser seleccionado com antibióticos, utilizou-se outros vectores. Por exemplo, o pLV156-P (Per2) d-Luc vector contém um P (Per2)-d cassete de expressão Luc-IRES-GFP em que a tradução de EGFP é mediada por uma entrada de ribossoma interno site (IRES) a jusante da d Luc, permitindo a observação visual e activado por fluorescência de separação de células (FACS) de células com integratvectores ed ⁵ (Figura 1) (ver abaixo). Para proteger o repórter de efeitos de integração no local, um promotor constitutivo e de terminação (P / T), pode ser introduzido como um isolante ou chamariz imediatamente a montante da P-d Luc (Per2) cassete de expressão de repórter (por exemplo, inferior a construção na Figura 1A ), conforme relatado por Brown et al. ¹⁸ e Liu et al. ⁵

Estudos anteriores estabeleceram a base para a exploração de perturbação genética específica de tecido in vivo e / ou ex vivo ^44-48. Por exemplo, as partículas virais pode ser injectado na região SCN seguido de preparação fatia SCN. Como uma alternativa a esta in vivo seguido de teste ex vivo, as fatias de NCS pode ser dissecado em primeiro lugar e cultivadas ex vivo, seguido de incubação com vírus de título elevado. No entanto, devido à baixa eficiência de infecção de fatias de tecido relativamente espessas,um protocolo altamente consistentes ex vivo ainda por desenvolver.

1,4 Escolha de linhas de células e as condições de gravação

Muito do que sabemos sobre a bioquímica e biologia celular do mecanismo do relógio é baseado em três modelos de celulares: fibroblastos de rato 3T3 ^16,17, células de osteossarcoma U2OS humanos ^10,11,19,28 e fibroblastos de rato derivadas de camundongos ^{9,13 , 34.} O sistema de vector lentiviral permite a entrega eficiente e integração estável no genoma do hospedeiro de ambos dividindo e não estão em divisão de células de mamíferos, e, portanto, não está limitado a determinados tipos de células, como a transfecção transiente. Dado o papel dos relógios circadianos na regulação de uma grande variedade de respostas celulares e fisiológicas, estudos futuros, certamente, estender-se a uma grande variedade de tipos de células, tanto as linhas celulares disponíveis comercialmente, ou de células primárias derivadas de ratinhos. Estes estudos de células-autônomas relógio vai ajudar a descobrir tecido ubiquitous, bem como tecido-específicos, propriedades do relógio circadiano.

Vale a pena notar que a geração de células repórter pode exigir testes empíricos de repórteres diferentes (por exemplo, vários tipos de vetor e promotor), e, por vezes, uma maior optimização. Nem todos os tipos de células têm células autônomas ritmos. Para melhorar a saúde das células e persistência de ritmos celulares, otimização de mídia de gravação é muitas vezes necessário. Por exemplo, como uma alternativa para o meio de gravação 3T3, o meio de gravação utilizado para as células U2OS é como se segue: DMEM 1x (Invitrogen), 2% de B-27, 1 | iM forscolina, 1 mM de luciferina, 14,5 mM de NaHCO3, 10 mM de HEPES (pH 7,2). 1 mM de luciferina é geralmente suficiente, mas uma concentração final (0,1-1 mM), podem ser determinados para cada tipo de célula / repórter. Forskolin pode não ser necessária e a sua concentração pode ser determinada empiricamente para cada tipo de célula.

1.5 A eficiência de transfecção in prep lentiviral

Tr altaansfection eficiência de células 293T é crítica para uma boa preparação viral. Considerações importantes incluem saúde das células 293T e escolha de um reagente de transfecção. Células 293T pode ser muito mimado e requer um tratamento cuidadoso. Assim, a taxa de crescimento celular e morfologia devem ser cuidadosamente monitorizados. Por razões de consistência, recomendamos que o soro é testado primeiro e do mesmo lote utilizado posteriormente testada para a manutenção das células. Nós sempre testar novas BBS 2x e CaCl ₂ soluções de reserva e optimizar a concentração de trabalho de cerca de _CaCl2 0,25 M. As células de passagem número elevado e / ou exibindo crescimento lento não devem ser usados. As células 293T são prontamente transfectable com uma série de reagentes de transfecção. Além de _CaPO4, também a eficiência de transfecção obtida com excelente Fugene 6 (Roche, ou Promega) ou Lipofectamine-2000 (Invitrogen). Estes lípidos à base de transfecção (lipofecção) os reagentes são mais caros, mas dão consistência melhor transfecção de _CaPO4. For grande escala preps lentivirais, recomendamos o uso CaPO4 para transfecção por causa do baixo custo.

1,6 Geração de linhas de células clonais

Un-concentrados em bruto de partículas virais são de título relativamente baixo (10 ⁶ partículas virais / ml), e expressão de repórter em células transduzidas é baixa. Embora este seja suficiente para a maioria das aplicações tais como gravação LumiCycle, repórteres brilhantes são muitas vezes necessários, por exemplo, em ensaios de alto rendimento, utilizando um aparelho de gravação menos sensíveis. Reporter expressão pode ser aumentada pela utilização de preparações virais mais elevados de titulação. Para fazer isso, recomendamos o uso de navios de maior porte cultura tais AS15 pratos centímetros para transfecção e coleta de mídia duas vezes em dias 4 e 5. Para a concentração de 10x (10 ⁷ partículas virais / ml), realizar a filtração utilizando centrífugas dispositivos de filtro (Millipore). Para a concentração de 100x ou mais (≥ 10 ⁸ partículas virais / ml), efectuar ultracentrifugação como descrito anteriormente 5,18. Se a população de células homogéneas é desejado, as linhas de células clonais podem ser obtidas por FACS baseada em célula única separação em placas de 96 poços. No entanto, torna-se imperativo que estas células clonais ser cuidadosamente analisadas, a morfologia da célula deve ser indistinguível de células parentais, e as propriedades do relógio, como a duração do período e amplitude deve ser representativa da população de células infectadas.

2. Aplicação de Cell-autônomas modelos de relógio Reporter

Ao contrário dos modelos de tecido ou animal, com base em células modelos são passíveis de perturbações genéticas e farmacológicas e, quando necessário, utilizar também em formatos de HTS. Perturbação da função do gene pode ser conseguido por sobre-expressão ou RNAi mediada knockdown. Selectivos de moléculas pequenas podem ser usados ​​para interferir com a função da proteína. Aqui nós brevemente de discuss alguns usos de modelos de células autônomas do relógio circadiano em estudos.

2,1 Estudo de mecanismos de relógio do núcleo

Modelos de células autônomas relógio grandemente facilitado estudos mecanicistas. Hogenesch e colaboradores utilizaram o modelo 3T3 para demonstrar que a repressão pela realimentação Crys é necessário para a função de relógio ^16, e o modelo de U2OS para investigar as propriedades de nível de sistema de função de relógio ^11. Utilizou-se a Cry1-/ -: cry2-/ - modelo de fibroblastos derivados de ratinhos para demonstrar que a repressão feedback atrasado é necessário para a função de relógio ^13, e o Bmal1-/ - modelo de fibroblastos para mostrar que Rev-erbα e β desempenham papéis redundantes em regulação RRE mediada expressão gênica rítmica, e que o ritmo Bmal1 não é criticamente necessário para a função de núcleo relógio ^9. Além disso, o rastreio químico em células repórter permitiu a identificação e / ou clarificação das funções de GS(Encurtamento período quando perturbado) K-3 β ^19, CK1σ e ε (período de alongamento, quando perturbada) ^49, e CK1α ^12. Como discutido abaixo, estes modelos facilitar a identificação dos componentes de relógio adicional. Estrategicamente, estes modelos celulares são mais tratáveis ​​para a descoberta rápida de mecanismos básicos, que, em seguida, fornecer novos pontos de entrada para a validação vivo e exploração.

2.2 Identificação de factores de relógio

Além do circuito fechado de realimentação de núcleo, o mecanismo do relógio também se integra diversas sinalização e factores reguladores. Para a identificação de componentes de relógio e modificadores adicionais, os modelos de células autónomas de relógio são vantajosos em relação rastreio genético em ratos, devido à letalidade inerente, efeitos pleiotrópicos, e compensação de desenvolvimento genético associado com modelos animais mutantes ^50. Baseados em células telas, em combinação com a genómica funcional adedores, foram efetivamente realizados utilizando sistemas de alta taxa de transferência de gravação para siRNA tela do genoma e bibliotecas shRNA para identificação de fatores de clock novela ^10,28. Da mesma forma, pode-se empregar químicos abordagens biológicas e tela para diversas moléculas pequenas para estudar seus efeitos sobre a função de relógio ^12,19,34,49. Embora os genes de relógio e das suas funções principais têm sido identificados, estes ecrãs tenham identificado os componentes adicionais ou modificadores que estão envolvidos na regulação ou modulação do relógio. Muitos desses modificadores representam modalidades específicas de integração de transdução de sinal de pistas síncrona ou assíncrona (entradas de clock).

2,3 Estudo das saídas de relógio

Embora praticamente todas as células in vivo tem relógios circadianos, as células cultivadas in vitro não necessariamente evidentes exibir os ritmos circadianos. Neste contexto, a abordagem repórter proporciona uma ferramenta útil para testar se omecanismo de relógio existe num tipo de célula particular. Presença de mecanismos autónomos célula de relógio garante estudos de saídas de relógio nestas células, bem como em tecidos in vivo, incluindo o transcriptoma por microarray ou RNA sequenciação ^51,52, redes reguladoras transcricionais, o proteoma, e o metaboloma. Estes estudos examinam do genoma RNA e padrões de expressão de proteínas e, portanto, seria complementar baseados em células ensaios de luminescência repórter que não necessariamente refletem a expressão endógena.

3. Significado dos modelos de células-autônomas Relógio

Coordenação da função circadiano dentro do SCN e em toda célula diferente e tipos de tecidos é um aspecto crítico da fisiologia normal ^30. O SCN central e relógios periféricos são partes essenciais da organização geral circadiano. O NSQ recebe a entrada de luz directamente a partir da retina para arrastar para o ciclo de luz / escuridão, e serve como um coordenadorsincronizar relógios periféricos através de conexões neuronais e hormonais tanto. Além de sincronização interna, o relógio molecular em tecidos periféricos e células também orquestra uma miríade de redes de saída de transcrição, o que em última instância regulam evidentes ritmos circadianos na fisiologia e comportamento.

Assim, ambos os sinais sistémica e local regular fisiologia circadiano, e existe uma necessidade de descobrir genes circadianos regulados directamente por células autónomas relógios versus aqueles indirectamente regulada por sinais sistémicos que emanam do SCN. O papel dos relógios periféricos podem ser estudados em modelos de células autónomas de relógio, em que as influências sistémicas são removidos. No caso de o fígado, tecido-específicos redes reguladoras gerar ritmos em fisiologia local ^51,53. Ao comparar in vitro e in vivo em ritmos circadianos, seremos capazes de discriminar entre células autónomas e sistêmica funções sugestão relógio movido. Com efeito, RecenEstudos t ter começado a revelar um papel significativo para o relógio de fígado na expressão hepática do gene ^6,51,52. Pesquisas futuras no desenvolvimento mandados de campo de vários tecidos e células de modelos específicos para cada tipo de relógio que representam diferentes saídas fisiológicas.

Estudos anteriores da bioquímica e biologia celular do mecanismo de relógio, em grande invocado um número limitado de tipos de células e tecidos, incluindo particularmente 3T3, U2OS, fibroblastos de rato, e no fígado. Uma suposição implícita na maioria dos estudos circadianos é que o relógio funciona da mesma forma em todos os tipos de tecidos e células, e em função de um gene determinado um tipo de célula ou tecido é geralmente considerada universalmente aplicável em todas as células ^7. No entanto, ao estabelecer e caracterizar modelos mais células autônomas de relógio, estudos futuros são esperados para descobrir propriedades de tecidos específicos relógio circadiano subjacentes biologia local.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30243FS	For regular cell growth
DMEM	Invitrogen	12100-046	For luminometry
FBS	HyClone	SH3091003
Pen/Strep/Gln(100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-Luciferin	Biosynth	L-8220
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
All other chemicals	Sigma
Equipment
Tissue culture incubator			5% CO2 at 37 °C
Tissue culture hood			BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope			Phase contrast optional
LumiCycle	Actimetrics