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Bei Säugetieren sind viele Aspekte des Verhaltens und der Physiologie wie Schlaf-Wach-Zyklen und Leberstoffwechsel durch endogene circadiane Uhren (bewertet 1,2) geregelt. Die circadiane zeithaltenden System ist eine hierarchische Multi-Oszillator-Netzwerk, mit dem zentralen Takt im suprachiasmatischen Nukleus (SCN) zu synchronisieren und koordinieren extra-SCN und peripheren Uhren anderswo 1,2 liegt. Zellen sind die einzelnen Funktionseinheiten für die Erzeugung und Aufrechterhaltung der zirkadianen Rhythmen 3,4 und dieser Oszillatoren verschiedener Gewebetypen im Organismus teilen eine bemerkenswert ähnliche biochemische negativen Rückkopplungsmechanismus. Jedoch aufgrund von Wechselwirkungen an der neuronalen Netzwerk-Ebene im SCN und durch rhythmische, systemischer Cues am organismal Ebene werden Tagesrhythmus am organismal Ebene nicht notwendigerweise zellautonome 5-7. Im Vergleich zu herkömmlichen Studien der lokomotorischen Aktivität in vivo und ex vivo SCN Explantate, cell-basierte in vitro-Assays ermöglichen Entdeckung der Zell-autonome circadiane Mängeln 5,8. Strategisch sind zell-basierte Modelle mehr experimentell handhabbar zur phänotypischen Charakterisierung und schnelle Entdeckung der Grundtakt Mechanismen 5,8-13.
Da zirkadianen Rhythmen dynamisch sind, sind Längs-Messungen mit hoher zeitlicher Auflösung benötigt, um Uhrfunktion beurteilen. In den letzten Jahren hat Echtzeit Biolumineszenz Aufnahme mit Leuchtkäfer-Luciferase als Reporter zu einer gebräuchlichen Methode zur Untersuchung Tagesrhythmus in Säugetieren 14,15, wie es für die Prüfung des Persistenz und Dynamik molekularer Rhythmen ermöglicht. Um Zell-autonome circadiane Rhythmen der Genexpression überwachen, können Luciferase Reporter in Zellen durch transiente Transfektion 13,16,17 oder stabile Transduktion 5,10,18,19 eingeführt werden. Hier beschreiben wir eine stabile Transduktion Protokoll unter Verwendung Lentivirus-vermittelte Gentransfer. Ter Lentivirales Vektorsystem ist den herkömmlichen Methoden wie transiente Transfektion und Keimbahntransmission wegen ihrer Effizienz und Vielseitigkeit: er ermöglicht die effiziente Bereitstellung und stabile Integration in das Wirtsgenom von beiden Teilen und nicht teilende Zellen 20. Sobald ein Reporter-Zelllinie hergestellt ist, kann die Dynamik der Uhr-Funktion durch Biolumineszenz-Aufnahme untersucht werden. Wir beschreiben zunächst die Erzeugung von P (Per2)-d Luc Reporter Linien, und dann vorliegenden Daten aus diesem und anderen circadianen Reportern. In diesen Assays werden 3T3 Mausfibroblasten und U2OS humanen Osteosarkomzellen als zelluläre Modelle verwendet. Wir diskutieren auch verschiedene Möglichkeiten der Verwendung dieser Uhrenmodelle in zirkadianen Studien. Hier beschriebenen Methoden können zu einer Vielzahl von Zelltypen, die zellulären und molekularen Grundlagen von circadianen Uhren studieren angewendet werden, und es kann nützlich sein bei der Bewältigung von Problemen in anderen biologischen Systemen.