Im Tiermodell in unserem vorliegenden Arbeit beschriebenen gereinigten IgG-Antikörpern gegen eine Strecke von 200 Aminosäuren (aa 757-967) von Kollagen VII werden wiederholt in Mäuse Wiedergeben der Blasenbildung Phänotyp sowie der Histo-und immunpathologischen charakteristischen Merkmale der menschlichen eingespritzt Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) 1.
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Methodenartikel
Granulozyten-abhängige Autoantikörper-induzierten Blasenbildung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Autoimmune Phänomene treten bei gesunden Personen, aber wenn Selbst-Toleranz fehl, kann der Autoimmun-Reaktion kann in bestimmten Pathologie führen. Gemäß Witebsky Postulate, eines der Kriterien bei der Diagnose einer Krankheit wie Autoimmun ist die Reproduktion der Krankheit bei Versuchstieren durch die passive Übertragung von Autoantikörpern. Für Epidermolysis bullosa acquisita (EBA), eine prototypische organspezifische Autoimmunerkrankung der Haut und Schleimhäute, wurden mehrere experimentelle Modelle kurzem gegründet. Im Tiermodell in unserem vorliegenden Arbeit beschriebenen gereinigten IgG-Antikörpern gegen eine Strecke von 200 Aminosäuren (aa 757-967) von Kollagen VII werden wiederholt in Mäuse Wiedergeben der Blasenbildung Phänotyp sowie der Histo-und immunpathologischen charakteristischen Merkmale der menschlichen eingespritzt EBA 1. Ausgewachsenen verbreitete Krankheit wird meist gesehen 5-6 Tage nach der ersten Injektion und das Ausmaß der Erkrankung korreliert mit der Dosis des verabreichten collagen VII-spezifischen IgG. Die Gewebeschäden (Blasenbildung) in der experimentellen EBA wird auf die Rekrutierung und Aktivierung von Granulozyten je nach Gewebe-gebundenen Autoantikörper 2, -4. Daher ermöglicht dieses Modell für die Präparation der Granulocyten-abhängige entzündlichen Wegs in der Autoimmun Gewebeschädigung beteiligt, da das Modell reproduziert nur das T-Zell-unabhängige Phase des efferenten Autoimmunantwort. Ferner wird dessen Wert von einer Reihe von Studien, die die Blister-induzierendes Potential von Autoantikörpern in vivo und Untersuchung des Mechanismus der Blasenbildung in EBA 1,3, -6 unterstrichen. Schließlich wird dieses Modell erheblich erleichtern die Entwicklung neuer anti-inflammatorische Therapien Autoantikörper-bedingten Krankheiten. Insgesamt ist die passive Übertragung Tiermodell der EBA eine zugängliche und lehrreich Krankheit Modell und hilft Forschern dabei nicht nur EBA Pathogenese analysieren, sondern zu beantworten grundlegende biologisch und klinischwesentliche Autoimmunität Fragen.
Protokoll
Ein. Vorbereitung von pathogenen Antikörper
Anmerkung: Die Reinigung und die Konzentration der Antikörper sollten am selben Tag durchgeführt werden, wie Antikörper nicht in 0,1 M Glycin pH 2,5-3 (Elutionspuffer) über Nacht (ON) gespeichert werden.
Affinitätsreinigung von IgG: Verwenden Sie 25 ml des Immunsystems Kaninchenserum:
- Auftauen Kaninchenserum ON bei 4 ° C, mischen Sie es 1:1 mit 1xPBS (Laufpuffer) und zentrifugieren es bei 1260 xg für 10 min bei 20 ° C. Optional kann eine Filterung Schritt mit Filterpapier nach Zentrifugation im Falle das Serum Fettsäuren von Bedeutung sind.
- Inzwischen, waschen das Protein G-Matrix gefüllte Säule mit 10 Bettvolumina (Bettvolumen = Matrix Volumen) 1XPBS (Laufpuffer).
- Übernehmen Sie die verdünnt und filtriert Serum auf die Säule pipettieren und 1 Std. auf dem Schüttler bei Raumtemperatur (RT).
- Sammeln Sie die Flow-Through (FT) in einem 50 ml Flacon Röhre. Nicht wegwerfen es bis die Konzentrationund Titer des gereinigten IgG ist bekannt.
- Waschen Sie die Matrix mit 5 Bettvolumina 1XPBS und in der Zwischenzeit bereiten 50 ml Falcon-Röhrchen zum Auffangen des eluierte IgG-Fraktion. Pipette 1 ml pH neutralisierenden Puffer: 1 M Tris pH 10 in jedem Röhrchen (sonst der Anteil von 1:20 Trispuffer bezogen auf die Menge der zu sammelnden Eluat).
- Anwenden 100-150 ml Elutionspuffer: 0,1 M Glycin, pH 2,5 bis 3 auf die Säule und Sammeln 50 ml Fraktion (en). Klappen Sie den Schlauch 2-3x, messen Sie den pH-Wert und fügen neutralisierende Puffer, bis Sie den pH 7,2-7,4 erreicht haben.
- Sammeln einiger Tropfen IgG Eluat und mit dem Elutionspuffer als Etalon messen die OD bei 280 nm auf. Wenn die OD <0,1 Stopp sammeln.
- Generieren Sie das Protein G-Matrix und speichern Sie es nach den Anweisungen des Herstellers.
Konzentration durch Ultrafiltration mit Amicon Röhren:
- Waschen Amicon Ultra (15 ml / 30 kDa) Ultrafiltration Rohre mit 1XPBS durch Zentrifugieren 15-20 minbei 3220 × g bei 4 ° C. Entsorgen Sie die FT von der Amicon.
- Füllen Sie die Amicons mit 15 ml eluierte IgG-Fraktion und Zentrifuge für 25-30 min bei 3.220 xg und 4 ° C; Zentrifugationszeit hängt immer von der Proteingehalt des Eluats.
- Entsorgen FT und wiederholen Ultrafiltration bis Sie keine eluierte Fraktion verlassen haben.
- Waschen Sie die konzentrierte IgG ausgiebig, zweimal mit 1XPBS 25-30 min durch Zentrifugation.
- Sammeln das "klebrige", gelbliche Antikörperlösung aus dem Amicon-Filter in einem Endvolumen von 1.500-2.000 ul 1XPBS.
- Measure Konzentration von IgG-Präparation mit einem Spektralphotometer oder NanoDrop:
Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x Verdünnungsfaktor / 1,4 - Waschen und speichern Sie die Amicons nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Injektion von Collagen VII-spezifischen IgG in Mäuse
Vor der eigentlichen Versuchsdurchführung, stellen Sie sicher, dass die experimentelle proProtokoll geschrieben wird und alle Materialien werden für das Experiment vorbereitet.
- Bereiten Sie die Datenblätter für die Krankheit Scoring, ELISAs, Immunfluoreszenz (IF)-Analyse und Myeloperoxidase (MPO)-Assay 4.
- Beschriften Sie die Röhrchen für Blut und Organen, cryomolds sowie Histologie Verarbeitung und Einbettkassetten.
- Die Antikörper-Lösungen sollten frisch hergestellt werden oder aufgetaut aus Aktien und charakterisiert hinsichtlich ihrer Reaktivität (Titer von IF-Mikroskopie und / oder ELISA). Die sterilfiltrierte Lösung sollte Antikörpers in PBS in einer Weise, dass die erforderliche Dosis für die Injektion variiert zwischen 250-1000 ul verdünnt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie genügend IgG, das gesamte Experiment durchführen zu können.
- Bereiten Sie frischen Antikoagulans: Heparin 20 U / ml und 8,7 mg / ml Ketamin / 1,3 mg / ml Xylazin Mischung für die Anästhesie. Wenn opfern die Mäuse Röhrchen mit 3,7% Formaldehyd hergestellt beschriftet.
- Sterilisieren chirurgische Instrumente (Skalpell, Schere, feine Spitze und curved forcipes), und bereiten Spritzen (Insulinspritzen, 1, und 2 ml Spritzen), Nadeln, Digitalkamera und zusätzliche Speicherkarte.
Hinweis: Führen Sie alle auf Ketamin / Xylazin oder Isofluran narkotisierten Mäusen Isofluran ist die bevorzugte Anästhesie Option für den täglichen Haut-Check, wie Mäuse schnell erholen.. Jedoch wird, wenn Bilder, 87 mg / kg Ketamin und 13 mg / kg Xylazin üblicherweise subkutan injiziert. Für Euthanasie die Ketamin / Xylazin Dosis auf 130 mg / kg Ketamin und 20 mg / kg Xylazin erhöht.
- Überprüfen Sie die bereits markierten Tiere für ihre allgemeinen Gesundheitszustand, Haut und Fell Aussehen, wiegen sie und messen ihr Ohr Dicke (immer mit dem gleichen Ohr haften).
- Registrieren beobachteten Werte und Veränderungen in der klinischen Bewertung Blatt.
- Sammle 20-30 ul (2-3 Tropfen) Blut aus der Schwanzvene in einer Spritze mit dem gleichen Volumen der Antikoagulans.
- Desinfizieren Sie das Fell undHaut mit 80% Ethanol.
- Injizieren die Antikörper-Lösung subkutan in den Rücken mit einem Insulinspritze. (Für bestimmte Anlage (z. B. die Ohren) nur kleine Volumina (10-50 ul) durchführbar sind, die injiziert werden.)
Die Injektionen sollten wiederholt sich jeden zweiten Tag, 4 mal. Balb / c und C57BL6 Mäuse einem Körpergewicht von etwa 20 g zu starten, um die Krankheit 3-4 Tage nach der ersten Verabreichung von 400-500 bis zu 750 pg / g Körpergewicht / Einspritzung Autoantikörper entwickeln.
Bei Beendigung des Experiments:
- Legen Sie die Mäuse unter tiefe Narkose durch Injektion 130 mg / kg und 20 mg / kg Ketamin / Xylazin subkutan, exsanguinate sie aus dem hinteren Hohlvene und schneiden Sie das Herz aus.
- Sammle Organe / Gewebeproben wie Haut: tail, Ohr, Blut-und Speiseröhre und steckte sie in zuvor beschriftet und PBS oder 3,7% Formaldehyd gefüllten Röhrchen.
Bei der Rückkehr in dieLabor:
- Zentrifuge das Blut bei 1.200 xg, 10 min bei RT Abtrennung des Plasmas, übertragen das Plasma in korrekt beschriftete Röhrchen und bewahren Sie sie entsprechend.
- Einbetten die Haut in optimaler Cut Temperatur Medium Biopsie durch cryomolds, richtig Etikett, und lagern Sie sie bei -80 ° C.
- Legen Sie die Gewebeproben für die Histologie in den markierten Einbettformen gedacht und halten sie in 3,7% Formaldehyd bis Paraffineinbettung.
3. Clinical Evaluation of Disease Severity
Mäuse sollten täglich für Läsionen von Haut und Schleimhaut zu untersuchen und die Ergebnisse zu dokumentieren mit geeigneten Formen werden. Die Kriterien für die frühe Euthanasie ist Hautläsionen, die mehr als 20% der Körperoberfläche und einen Gewichtsverlust von 5-10% des gesamten Körpergewichts in drei aufeinander folgenden Tagen, gerechnet für eine Krankheit Punktzahl von 5 (Tabelle 1).
- Platzieren Sie die Maus auf seinem Bauch. Beginnen mit dem Kopf-Bereich, nämlich mit dem rechtenOhr und erfragen Blasen, Erosionen, Kruste auf der inneren als auch auf der äußeren Seite. Weiter auf die gleiche Weise mit dem linken Ohr.
- Rechte und linke Auge werden nach Anzeichen von Hautrötung gesteuert, Alopezie, Erosionen und / oder Kruste.
- Stirn und Schnauze Bereich werden durch nächsten gebürstet, weiterhin mit dem ventralen Teil der Schnauze, Lippen und der Schleimhaut des Mundes.
- Untersuchen Sie das rechte Vorderbein ab der Pfote, nach oben bewegen; wechseln Sie in das linke Vorderbein. Gleiche Prozedur mit der rechten und linken Hinterbeine.
- Bürste durch das Fell am Hals-und Rückenbereich mit einem gekrümmten feinen Spitze Pinzette.
- Drehen der Maus auf seiner Rückseite und überprüfen ventralen Teil sowie die ventralen Seiten der Glieder auf die gleiche Weise wie zuvor.
- Überprüfen Sie den Schwanz.
- Machen Sie Fotos von relevanten Körperteile, wo die Mäuse entwickeln Krankheit. Augenmerk muss auf die Qualität und Quantität der Bilder bezahlt werden.
- Berechnen Sie die klinische Erkrankung Partituren.
4. Die Analyse der Haut-und Plasmaproben
- Vorzubereiten, zu speichern und / oder verarbeiten alle gesammelten Gewebe nach dem Plan.
- Cut Gefrierschnitten für IF Nachweis von Kaninchen Antikörper und Maus Komplement-System-Komponenten.
- Analyse der verschiedenen Protein-und Enzymgehalt (MPO-Assay) von gefrorenem Gewebe und / oder Organ-Extrakten.
- Abschnitt das Paraffin Gewebe eingebettet und Flecken mit H & E, um das Ausmaß der Gewebeschädigung zu visualisieren.
- Analysieren Sie die Plasma durch ELISA, Immunoblot.
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Ergebnisse
Die passive Übertragung von Antigen-spezifischen Antikörpern führt zu einer ausgewachsenen Krankheit in Mäusen ähnelt in klinischen, histologischen und immunpathologische Ebenen der menschlichen EBA. Blasen, Krusten, Erosionen und Alopezie auf den Ohren, Schnauze, Pfoten, Beine, Rücken und um die Augen der Mäuse entwickeln. Die ersten klinischen Anzeichen der Krankheit wird höchstwahrscheinlich auf den Ohren und / oder Kopfbereich erscheinen. Ablagerung von spezifischen Kaninchen IgG und Maus Komplement C3 wird durch di...
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Diskussion
Die passive Übertragung von Antikörpern in Versuchstieren ist ein wichtiger Ansatz für den Nachweis ihrer Pathogenität 7, -12. Tiermodelle durch dieses Verfahren erhalten wird, abgesehen davon, dass der indirekte Nachweis für Autoimmunität 13, ermöglichen die Untersuchung des efferenten Phase des pathogenen Mechanismus. Der passive Transfer-Modell von Antikörper-induzierte Granulozyten-abhängige Haut Blasenbildung Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) wurde verwendet, um die Mechanismen der Gewebes...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Die Autoren danken für die Unterstützung durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 und BIOSS von der Medizinischen Fakultät der Universität Freiburg (CS).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| rekombinantes Antigen | Die Plasmide Codierung für die rekombinante Formen von murinem Kollagen VII sind aus der entsprechenden Autor zugeordnet. | ||
| Immunsystem Kaninchenserum | www.eurogentec.com | Wir hatten weißen Neuseeland-Kaninchen mit 200 ug Antigen, 3 mal in 2 Wochen-Intervallen immunisiert. Zu diesem Zweck haben wir die Dienste von Eurogentec SA, Belgien verwendet. | |
| Protein G Agarose | Roche Applied Science | 11243233001 | |
| Balb / c-Mäusen | Charles River Laboratories | ||
| OCT-Verbindung, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | Oktober, optimale Schnittleistung Temperatur |
| Cryomold Standard | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm × 20 mm × 5 mm |
| Cryomold Zwischen | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm × 15 mm × 5 mm |
| Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09-0503 | Histologie Verarbeitung und Einbettkassetten |
| Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund & Richard Herberholz GmbH & Co. KG | 71492000 | Tätowieren Paste |
| Tatowierzange TZ1 | EBECO E. Becker & Co GmbH | Tätowieren Gerät | |
| Heparin | Carl Roth GmbH & Co. | 7692,1 | |
| Formaldehyd 37% | Carl Roth GmbH & Co. | 7386 | |
| Ketaminhydrochlorid | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
| Xylazinhydrochlorid | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
| sterile PBS | Biochrom | L182-50 | |
| Digitalkamera | Nikon | Coolpix 5400 | |
| Spritze getrieben Filtereinheit 0,45 um | Millipore | ||
| Caliper | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (Verteiler) |
| Krankheit Scoring-Blatt | B. Kapselungsed |
Referenzen
- Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen. J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).
- Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 225, 401-413 (2011).
- Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes. Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).
- Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage. J. Pathol. 212, 56-65 (2007).
- Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).
- Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).
- Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).
- Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science. 286, 1732-1735 (1999).
- Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice. PLoS One. 7, e31066(2012).
- Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180. J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).
- Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease. N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).
- Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse. Science. 190, 397-399 (1975).
- Rose, N. R., Bona, C. Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited. Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).
- Sitaru, C. Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita. Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).
- Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin. Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).
- Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice. Immunol. Lett. , (2012).
- Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 224, 234-244 (2011).
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