Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Um die Mutualismus zwischen studieren Xenorhabdus Bakterien und Steinernema Nematoden, Methoden wurden entwickelt, um bakterielle Präsenz und Position innerhalb Nematoden überwachen. Der experimentelle Ansatz, der auf andere Systeme angewendet werden kann, bringt Engineering Bakterien das grün fluoreszierende Protein exprimieren und zu visualisieren, mittels Fluoreszenzmikroskopie Bakterien innerhalb des transparenten Nematoden.

Zusammenfassung

Symbiosen, das Zusammenleben von zwei oder mehr Organismen sind in allen Reichen des Lebens verbreitet. Als zwei der am weitesten verbreiteten Organismen auf der Erde bilden Nematoden und Bakterien eine breite Palette von symbiotische Assoziationen, die von Vorteil für pathogene ^1-3. Eine solche Vereinigung ist die gegenseitig vorteilhafte Beziehung zwischen Xenorhabdus Bakterien und Steinernema Nematoden, die als Modellsystem Symbiose ⁴ entstanden ist. Steinernema Nematoden sind entomopathogenen, indem sie ihre bakteriellen Symbionten zu töten Insekten ^5. Für die Übertragung von Insekten Gastgeber, besiedeln die Bakterien im Darm der Nematoden der infektiösen jugendlichen Stadium ^6-8. In jüngster Zeit haben mehrere andere Nematoden wurde gezeigt, dass Bakterien nutzen zu töten Insekten ^9-13, und Untersuchungen haben begonnen Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den Nematoden und Bakterien in diesen Systemen <sup> 9.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung eines bakteriellen Symbionten innerhalb oder auf einer Nematode Host, unter Ausnutzung der optischen Transparenz der Nematoden, wenn durch Mikroskopie angesehen. Die Bakterien werden konstruiert, um ein fluoreszierendes Protein exprimieren, wodurch deren Visualisierung durch Fluoreszenzmikroskopie. Viele Plasmide zur Verfügung, die für Proteine ​​kodierenden Genen tragen, die bei verschiedenen Wellenlängen (dh grün oder rot), und die Konjugation von Plasmiden aus einer Escherichia coli Donor-Stamm in einen Empfänger bakteriellen Symbionten fluoreszieren erfolgreich ist für ein breites Spektrum von Bakterien. Die beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um den Zusammenhang zwischen Steinernema carpocapsae und Xenorhabdus nematophila ¹⁴ zu untersuchen. Ähnliche Verfahren sind verwendet worden, um andere nematodeninduzierbares Bakterium Assoziationen ^{9, 15-18} untersuchen und der Ansatz ist deshalb allgemein anwendbar.

Der method ermöglicht die Charakterisierung von bakteriellen Präsenz und Lokalisierung innerhalb Nematoden in verschiedenen Stadien der Entwicklung, Einblicke in die Natur des Vereins und der Prozess der Kolonisierung ^{14, 16, 19.} Mikroskopischen Analyse ergibt sowohl Kolonisierung Frequenz innerhalb einer Population von Bakterien und Lokalisierung von Geweben ^{14, 16, 19-21} hosten. Dies ist ein Vorteil gegenüber anderen Methoden zur Überwachung Bakterien innerhalb Nematodenpopulationen, wie Ultraschallbehandlung ²² oder Schleifen ^23, die Durchschnittswerte der Besiedlung bestimmt, die aber nicht zum Beispiel diskriminieren Populationen mit einer hohen Frequenz von niedrigen Lasten aus symbiont Populationen mit eine niedrige Frequenz von hoher Symbionten Lasten. Unterscheiden der Frequenz und der Last besiedelnden Bakterien kann besonders wichtig bei der Durchmusterung oder Charakterisierung bakteriellen Mutanten zur Besiedelung Phänotypen ^{21, 24.} Tatsächlich hat Fluoreszenzmikroskopie in Hochdurchsatzscreening von bakteriellen Mutanten für Defekte in Kolonisierung ^{17, 18} eingesetzt, und ist weniger aufwendig als andere Verfahren, einschließlich Ultraschallbehandlung ^{22, 25-27} und Nematoden einzelnen Dissektion ^{28, 29.}

Protokoll

Ein. Bau eines Fluorescent Bakterienstamm via Konjugation

1. Wachsen die Rezipientenstamm (Symbionten untersucht werden) und Donorstamm Nacht. Die Donorstamm, üblicherweise Escherichia coli, sollte fähig sein abgebenden DNA durch Konjugation und sollte mit einem Plasmid transformiert werden (Tabelle 2), die ein Gen für ein fluoreszierendes Protein trägt. Abhängig von dem Plasmid kann ein Konjugation Helferstamm auch erforderlich sein. Wenn ja, sollte dieser Stamm auch über Nacht gezüchtet werden. Die Donorstamm und Helferstamm sollte mit Antibiotika gezüchtet werden, um für die Wartung des Plasmids ausgewählt.
2. Subculture den Spender, Helfer und Empfänger Stämme in nährstoffreichen Nährmedien fehlt Antibiotika in einer 1:100-Verhältnis von Kultur bis mittel.
3. Wachsen die Kulturen bei der geeigneten Temperatur für jeden Stamm, bis sie Mitte-log Wachstumsphase (OD ₆₀₀ ~ 0,6) erreichen. Für Xenorhabdus und E. coli diese Stufe wachsenth etwa 3 bis 4 Stunden nach Subkultivierung erreicht. Dies kann je nach der Belastung, oder in einigen Fällen das Plasmid, verwendet.
4. Mischen Sie die Stämme in einem Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 2 min bei 17.900 xg (13.000 rpm in den meisten microfuges). Der Anteil von Spender und Empfänger, die besten Ergebnisse liefert wird für verschiedene Kombinationen variieren und kann empirisch ermittelt werden. Empfänger für ein Xenorhabdus und E. coli Spender, verwenden wir ein 3:1 oder 1:1. Wenn ein Helfer-Stamm benötigt (zB E. coli), sollte er in dem gleichen Verhältnis wie dem Spender aufgenommen werden.
5. Den Überstand umfüllen.
6. Resuspendieren das Zellpellet in 30 ml frisches Medium.
7. Finde die Suspension auf einer nährstoffreichen Medien Platte ohne Antibiotika, und lassen Sie den Ort, um zu trocknen.
8. Inkubieren Sie die Platte, invertiert, über Nacht bei einer optimalen Temperatur für den Empfänger Bakterium und zulässig, dass der Spender (und Helfer, falls zutreffend). Die Platte sollteinkubiert mindestens 18 hr werden.
9. Abkratzen der Stelle und streifenfrei für einzelne Kolonien auf einem selektiven Antibiotikum Platte. Die Antibiotika sollten gegen den Spender und den Empfänger mit dem Plasmid auszuwählen. Ein oder zwei zusätzliche Isolation Streifen kann notwendig sein, um eine reine Kultur zu isolieren.
10. Sicherstellen, dass die resultierenden Kolonien sind der Empfänger Symbiont und nicht der Donorstamm, durch Screening auf die Gegenwart von empfängerspezifischen Phänotypen wie Koloniemorphologie oder Polymerasekettenreaktion Nachweis von Empfänger-spezifischen Genen. Screenen die Kolonien auf Anwesenheit des Plasmids durch Polymerasekettenreaktion eines bekannten Plasmidsequenz und Fluoreszenz. Die Kolonien sollte unter der richtigen Wellenlänge entsprechend dem fluoreszierenden Protein fluoreszieren.

2. Produktion von Axenische Nematodeneier

1. Wachsen 5 ml der natürliche bakterielle Symbionten über Nacht. Um eine Kultur zu starten, können Bakterien in Lysogenie Broth (LB) oder andere cu geimpft werdenlture Medien direkt aus einem Gefrierschrank Lager oder aus einem Streifen Platte.
2. Verteilt 600 ul der Bakterienkultur auf 10 mm Lipid Agar (LA) Platten ^29. Acht bis zehn Platten erbringt genug Nematoden für die meisten Arten.
3. Im Dunkeln ohne Feuchtigkeit bei 25 ° C für zwei Tage.
4. Hinzufügen 5.000 infektiöse juvenile Nematoden oder anderen Stufen in Abhängigkeit von der Nematoden verwendet wird, in 500 ul Medium zu den Bakterienrasen. Die Inkubation erfolgt bei 25 ° C für 3 Tage.
5. Überprüfen Sie Ihre Platten auf das Vorhandensein von adulte Nematoden und Eier. Platz 20 ul Wasser auf einen Objektträger. Verwendung einer sterilen Stick schaben-up eine geringe Menge an Nematoden aus der Bakterienrasen. Setzen Sie den Stick in das Wasser und damit die Nematoden zu schwimmen. Schauen Sie auf Ihre Folie unter geringer Vergrößerung. Für weitere Informationen über Aussehen siehe die Diskussion und Abbildung 2.
6. Wenn Eier und Frauen sichtbar sind, weiter, andernfalls bebrüten die Platten bei 25 & dzB, C und für die richtige Entwicklung jedes 6-12 hr überprüfen. Wenn Weibchen Eier enthalten, legen Sie ein paar ml Wasser auf der Oberfläche der Platten. Vorsichtig schwenken die Platten und gießen das Wasser in einem 50 ml konischen Röhrchen. Nematoden kommen sollte weg von den Platten und nicht mehr auf der Plattenoberfläche sichtbar. Mehrere Spülungen erforderlich sein.
7. Lassen Sie die Nematoden an den Boden des Röhrchens zu begleichen.
8. Spülen Nematoden. Abpipettieren das überschüssige Wasser aus dem oberen Ende des Rohres. Refill mit sauberem Wasser ab und lassen adulte Nematoden zu begleichen. Pipettieren Sie das überschüssige Wasser.
9. Füllen Sie die konische Röhrchen mit Ei Lösung. Sobald Ei zugegeben wird das Timing aller Schritte mit Ei Lösung muss gehen genauso vor wie für maximale Legeleistung beschrieben. Die Röhrchen unter leichtem Schütteln für genau 10 min. Meist Nematoden soll Ende der Inkubationszeit aufgelöst werden.
10. Sofort zentrifugieren konische Röhrchen bei 1250 xg für genau 10 min (dies schließt bringen die Zentrifuge bis zu beschleunigenaber nicht auf 0 x g. Verwenden Sie die Bremse).
11. Unmittelbar Dekantieren des Überstandes.
12. Unmittelbar resuspendieren des Pellets mit Ei-Lösung durch Pipettieren.
13. Sofort füllen konischen Rohr mit Ei-Lösung und gut mischen durch Invertieren 3-5 mal. Dann sofort in 2,10 spinnen.
14. Unmittelbar Dekantieren des Überstandes.
15. Resuspendieren des Pellets in LB durch Pipettieren, zu einem 15 ml konischen Röhrchen übertragen Pelletierung zur Verbesserung während der Waschschritte. LB ist Standard für Steinernema spp. Andere Puffer (zB eine minimale Salz-Medium) verwendet abhängig von der Nematoden und Bakterien, unter Berücksichtigung der Puffer muss nicht schaden entweder die Nematoden oder Bakterium werden.
16. Füllen Sie das Rohr mit LB und Spin in 2,10.
17. Den Überstand umfüllen und in LB erneut zu suspendieren.
18. Spülen Sie die Nematoden insgesamt 3-mal durch Wiederholung 2,14 und 2,15.
19. Verdünnen Sie die resuspendierten Nematodeneier auf eine angemessene Lautstärke. Es sollte mindestens 10 Eier pro Mikroliter sein. ZBgs in einer 6-cm-Petrischale in 5 ml LB für mindestens vier Tage durch Zugabe Antibiotika das Wachstum von Bakterien zu hemmen besiedelnder und Wickeln der Platte in Parafilm gespeichert. Die Eier müssen noch einmal in 15 ml LB (wie in 2.13 und 2.14) vor dem Impfen auf Bakterienrasen gewaschen werden. Beachten Sie, dass Eier werden während dieser Zeit schlüpfen und darf nicht entwicklungspolitisch synchronisiert werden, wenn bei der Kolonisation Assays verwendet.

3. Co-Kultivierung Assay mit fluoreszierenden Bakterien

1. Wachsen fluoreszierenden Bakterien über Nacht, Auswählen für das Plasmid, falls nötig.
2. Ausgebreitet 600 ul der Bakterienkultur auf 10 mm Lipid Agarplatten mit einer sterilen Stick. Inkubieren bei 25 ° C für 2 Tage.
3. Ort 500-5000 axenischen Nematodeneier in einer Gesamtmenge von 100 bis 400 ul (2000 optimal Nematoden in 200 ul) auf jedes Lipid Agarplatte.
4. Im Dunkeln ohne Feuchtigkeit bei 25 ° C bis IJs oder anderen Stufen des Interesses bilden. IJs sichtbar sein wird als fuzzy weißer Ring an der Kante der Platte. An anderen Lebensphasen betrachten, sehen Protocol 4.
5. Platzieren der Platten in einer modifizierten Weiß Abscheiders ^30. Entfernen Sie den Deckel der Lipid-Agar-Platte und legen Sie die unten in den Boden eines leeren 100 mm x 20 mm Petrischale. Füllen der großen Petrischale mit Wasser oder anderen geeigneten Puffer in einen Fadenwurm, zum Umgeben der kleinen Platte. Der Wasserstand sollte ungefähr die Hälfte der Höhe des Plättchens liegen.
6. Inkubieren Sie die Wasserfalle, bis Nachkommen IJs in den Puffer entstanden.
7. Infektiöser juveniler Nematoden in Wasser in einer Zellkulturflasche gespeichert werden.

4. Collection of Early Life Stages für Screening

1. Verwenden Sie die Schritte 3.1 bis 3.4 zum Einrichten des Assays.
2. Die Platten, bis die gewünschten Lebensphasen vorhanden sind. Täglich Sichtkontrolle notwendig sein, um Timing zu bestimmen. Um die Platten zu inspizieren, verwenden Sie das Verfahren in Protokoll 2.5 beschrieben. Für S. carpocapsae eggsgrown mit X. nematophila auf LA Platten, trächtige Weibchen anwesend sein in 4-5 Tagen werden Jugendliche vorhanden sein in 7 Tagen, und infektiöse Jugendliche startet durch 15-17 Tage hergestellt werden.
3. Wenn die gewünschten Lebensphasen vorhanden sind, sammeln Sie Ihre Probe. Füllen Sie eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit 200 ul PBS oder andere geeignete Puffer. Vorsichtig abkratzen einige der Bakterienrasen die Nematoden enthält. Eine erbsengroße Menge (~ 50 mg) stellt mindestens mehrere hundert Nematoden einmal F1 Nachkommen produziert werden, aber mehr notwendig sein für frühere Zeitpunkte. Setzen Sie den Stick in den Brunnen haltigem Puffer.
4. Inkubieren für 30 sec bis eine Minute. Entfernen Sie den Stick und abkratzen der verbleibende Rückstand. Verwenden Sie den Stick an einen Agar aus dem Bohrloch zu entfernen. Die Nematoden sichtbar sein soll innerhalb des Puffers. Bewegen Sie den Puffer-Gemisches zu einer sauberen Mikrozentrifugenröhrchen.
5. Behandeln Sie die Nematoden mit Levamisol oder andere lähmende Agent. Lösen Sie ein paar Körner von Levamisol in 30 & mu; L Wasser. Fügen Sie 1-2 ul dieser Mischung für je 50 ul der Probe. Nach Levamisol Behandlung werden die Nematoden werden nicht lebensfähig.
6. Wenn die Proben zu einem späteren Zeitpunkt angesehen werden, zu beheben, wie in diesem Schritt beschrieben. Wenn nicht, fahren Sie 4,6 fort. Fügen Sie 200 ul Fixierlösung mit 1X Puffer und 4% Paraformaldehyd. Vorsichtig mischen kann Pipettieren verursachen empfindliche Lebensphasen zu lysieren. Mit Folie abdecken und bei Raumtemperatur inkubieren auf einem Schüttler bei niedriger für mindestens 18 Stunden.
7. Die Röhrchen in einer Röhrchenrahmen und erlauben die Nematoden um zum Boden des Röhrchens absetzen.
8. Spülen Nematoden in den Hintergrund zu entfernen. Abpipettieren überschüssige Flüssigkeit und fügen Sie 200 bis 500 ul Puffer und vorsichtig mischen. Wiederholen. Dies kann wiederholt ein paar Mal mehr Hintergrund zu entfernen, falls gewünscht.
9. Erlauben die Nematoden um zum Boden des Röhrchens absetzen und in der gewünschten Menge resuspendieren.
10. Wenn die Nematoden sind nicht festgelegt, Bildschirm sofort. Feste Nematoden können im Kühlschrank bis gespeichert werdenbis zwei Wochen. Bewahren Sie in der Dunkelheit.

5. Screening Nematoden für bakterielle Vereinigung durch Mikroskopie

1. Wählen Sie einige Nematoden unter dem Mikroskop, indem eine kleine Probe Ihrer Mischung zu sehen.
2. Um sicherzustellen, dass die Nematoden noch für das Bild, mit einem Gelähmten Mittel gemäß Protokoll 4.5 beschrieben zu behandeln. Wenn Sie nicht teilnehmen ein Bild oder die Nematoden sind bereits fixiert, kann dieser Schritt übersprungen werden.
3. Fügen 20-30 ul von Nematoden in Wasser, um Ihre Objektträger und legen Sie eine Deckglas an der Spitze.
4. Erfahren gesamte Nematoden unter Verwendung von Lichtmikroskopie, um sicherzustellen, Nematoden im Sichtfeld.
5. Erfahren Nematoden unter Verwendung des fluoreszierenden Einstellung am Mikroskop, das mit der Fluoreszenz von den Bakterien exprimiert entspricht.
6. Um bakterielle Lokalisierung zu identifizieren, nehmen Fotos der Nematoden unter fluoreszierendem Einstellung und Lichtmikroskopie Einstellung, und dann überlagern die Bilder. Die Fotos müssen von der gleichen fiel seind betrachtet. Es kann notwendig sein, mehrere Vergrößerungen und Ansichten des Nematoden versuchen, die Bakterien zu finden.
7. Die Verteilung der Nematode Kolonisierung kann durch Zählen einer Population von Nematoden, erziehlt auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Bakterien, und Berechnen der prozentuale kolonisiert quantifiziert werden. Wir empfehlen Zählen bis mindestens 30 Nematoden in der Bevölkerung in jeder Kategorie werden gezählt (mit oder ohne Kolonisation), um einen verlässlichen Wert zu erhalten.
8. Wenn nur wenige Nematoden in der Bevölkerung besiedelt sind, kann es notwendig sein, mehrere tausend Nematoden zählen vor 30 beobachtet. Für High-Throughput-Zählen Sie die folgenden Schritte.
9. Anstelle des Zählens Nematoden einzeln Aliquot die Population in eine Multi-Well-Platte (z. B. eine 24-Well-Platte). Nachdem die Nematoden dem Boden der Schale niedergelassen haben, kann jede Vertiefung auf dem Mikroskop gescannt werden und die Zahl der besiedelten Nematoden können erzielt.
10. Die Gesamtzahl der Nematoden ina Bevölkerung kann durch serielle Verdünnungen von Nematoden im gut identifiziert werden. Zum Beispiel kann 1 ml von Nematoden hinzugefügt werden eine gut können gut vermischt unter Rühren mit einer Pipettenspitze und 3 ul entfernt und gezählt werden zur Quantifizierung der Gesamtbevölkerung in den Brunnen.
11. Der Prozentsatz der kolonisiert Nematoden können, indem die Anzahl kolonisiert durch die Gesamtzahl von Nematoden im Bohrloch erhalten werden.

6. Repräsentative Ergebnisse

Beispiel Mikroskopbilder von Steinernema Nematoden mit Xenorhabdus Bakterien zusammenhängen, sind in Abbildung 3 dargestellt. Um das zusammengesetzte Bild in 3A gesehen zu erzeugen, wurde eine Phase Kontrastbild mit einer fluoreszierenden Bild überlagert. Der Pfeil in 3A zeigt die Bakterien innerhalb des infektiösen juvenilen Nematoden (bar = 100 um). 3B wurde in ähnlicher Weise aufgebaut und stellt einen juvenilen Nematoden with grün fluoreszierende Protein markierten Bakterien (grün Stangen) in den Nematoden Darmlumen (bar = 20 um) lokalisiert. Eine Population von den Nematoden aus beiden Medien wurden gezählt und erzielte für die Besiedlung durch die bakterielle Symbionten (Tabelle 1). Für robuste Statistik, ist es am besten mindestens 100 Nematoden pro Probe mit mindestens 30 fallen in jeder Kategorie zu zählen. Wie in Tabelle 1 ersichtlich ist, sind diese Nematoden bei einem Gehalt von ca. 14,6% kolonisiert, wenn am Lipid Agar und 68,6% gewachsen, wenn auf Leber Niere Agar gezüchtet. Nematoden und anderen Bakterienspezies ist gezeigt worden, um verschiedene Kolonisierung haben. Zum Beispiel X. nematophila besiedelt 99% der S. carpocapsae infektiöse Jugendliche (Martens 2003) und P. luminescens besiedelt 26% der H. bacteriophora infektiöse Jugendliche (Ciche 2003).

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Verfahrens. A. Das Bakterium wurde entwickelt, um ein fluoreszierendes Protein exprimieren. B. Nematode Eier aus adulten Nematoden isoliert sind, um sterile Nematoden zu produzieren. C. Die sterilen Nematoden mit den fluoreszierenden Bakterien co-kultiviert. D. Die daraus resultierenden Lebensphasen unter a angesehen Mikroskop zu beurteilen bakterielle Präsenz in der Nematoden.

Abbildung 2. Darstellung der erwachsenen Weibchen die Eier enthalten. A. Das Schema zeigt das allgemeine Aussehen der Steinernema Weibchen. Einschub: DIC Bild einer S. feltiae trächtig weiblich. Der schwarze Pfeil zeigt die Vulva. Weiße Pfeile sichtbare Eier. Das Bild ist bei 20-facher Vergrößerung und der Maßstab entspricht 100 um. B. DIC Bild eines entwickelt, aber nicht geschlüpften S.feltiae Nematoden Ei. Das Bild ist 40-facher Vergrößerung und der Maßstab entspricht 50 um. C. DIC Bild von Eiern isoliert von S. feltiae Nematoden unter 10facher Vergrößerung. Maßstab ist 100 um.

Abbildung 3. Beispiel mikroskopische Aufnahmen von Nematoden-bakterielle Vereins. A. S. puntauvense Nematoden wurden mit ihren bakteriellen Symbionten, X. verbunden bovienii, GFP. Das Bild ist ein zusammengesetztes Bild durch Überlagerung eine Phase kontrastreiches Bild mit einem fluoreszierenden Bild aus dem gleichen Sichtfeld erzeugt. Der Pfeil zeigt die fluoreszierende bakteriellen Symbionten innerhalb des Fadenwurms Host. Maßstab entspricht 100 um. B. Dieses Bild zeigt ein S. carpocapsae juvenile Nematoden mit GFP-exprimierenden X. nematophila innerhalb der Nematoden Darm lokalisiert.Dieses Bild wurde durch Überlagerung ein fluoreszierendes Bild über einen Differential-Interferenz-Kontrast Bild konstruiert. Der Maßstab entspricht 20 um.

Belasten	Anzahl von Nematoden mit acteria	Insgesamt Nematoden gezählt	Prozent der Nematoden olonized
S. puntauvense Lipid Agar	30	205	14,60%
S. puntauvense Leber Nieren Agar	72	105	68,60%

Tabelle 1. Beispiel Scoring eines Nematoden Population für bakterielle Präsenz. In diesem Experiment axenischen S. puntauvense Nematoden wurden mit ihren GFP-exprimierenden Symbionten auf verschiedenen Nährmedien (Lipid-Agar und Leber-Nieren-Agar ^32), um für die Besiedlung Mängel testen gewachsen. Eine Gesamtzahl von mindestens einem hundred Nematoden pro Probe gezählt wurden, und auf die Anwesenheit von Bakterien hat. Für statistische Power, repliziert drei experimentellen sollte mit mindestens 30 Nematoden fallen in jeder Kategorie gezählt werden.

Tabelle 2. Fluoreszenzprotein Plasmide enthielten. Eine Liste potentieller Plasmide zum Einsetzen eines fluoreszierenden Proteins in das bakterielle Symbionten gegeben aufgeführten nach Name des Plasmids. Andere Informationen enthalten sind das fluoreszierende Protein codiert, Antibiotikum Kassette für Plasmiderhaltung verwendet, andere Gebrauchsanweisungen, die Quelle des Plasmids. Die Konzentration in Klammern vermerkt ist die Konzentration des Antibiotikums für X verwendet nematophila. Jedes dieser Plasmide wurde erfolgreich in entweder Xenorhabdus oder Photorhabdus verwendet. Weitere Informationen können aus den angegebenen Zitaten erhalten werden. Abhängigauf das Bakterium getestet, können einige Plasmide nicht auf der Grundlage des fluoreszierenden Proteins, Antibiotika-Selektion, Insertionsstelle bzw. Replikationsursprung arbeiten. Die Plasmide oben aufgeführten enthalten verschiedene Funktionen, die den Einsatz in dem Bakterium von Interesse zu ermöglichen. Beispielsweise Mini-Tn7-KSGFP Einsätze in das attTn7 Stelle des Chromosoms, während pECM20 Einsätze in das X. nematophila Chromosom durch homologe Rekombination. Alternativ werden die Plasmide pPROBE extrachromosomal, gewartet und jedes pPROBE Plasmid hat die gleiche Grundgerüst und Fluorophor aber unterschiedliche Selektionsmarker oder Replikationsursprünge ihre Verwendung in einer Vielzahl von taxonomischen oder Mutante Hintergründen zu ermöglichen.

Diskussion

Die hier beschriebene Protokoll stellt ein Verfahren zur optischen Detektion von Bakterien in einer Nematode Host (Abbildung 1). Diese Methode nutzt die optische Transparenz von Nematoden und die Fähigkeit zur Fluoreszenz-Label Bakterien, mit der in vivo-Analyse von Bakterien innerhalb des Nematoden Host (Abbildung 3). Insbesondere, identifiziert dieser Ansatz bakteriellen Lokalisation innerhalb seines Wirtes. Durch Zählen einer Nematoden Bevölkerung und Scoring für bakterielle...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Lipid Agar (Steril)			8 Gramm Nährbrühe, 15 Gramm Agar, 5 g Hefeextrakt, 890 ml Wasser, 10 ml 0,2 g / ml MgCl 2. 6H 2 0, 96 ml Maissirup Lösung *, 4 ml Maisöl * Stir Medien während Giesserplatten * In sterile Wirkstoff nach dem Autoklavieren
Corn Syrup Lösung (Steril)			7 ml Maissirup, 89 ml Wasser Mix und Autoklaven
Egg Lösung			16,6 ml 12% ige Natriumhypochlorit, 5 ml 5M KOH, 80 ml Wasser
Lysogenie Broth (Steril)			5 Gramm Hefeextrakt, 10 g Trypton, 5 g Salz, 1 L Wasser Mix und Autoklaven
Zentrifugieren	Fischer	13-100-675	Jede Mikrofuge die Mikrozentrifugenröhrchen hält funktionieren
Zentrifugieren	Beckman	366802	Große Tischzentrifuge, die 15 ml und 50 ml konischen Röhrchen hält
Sterile 60 mm X 15 mm Petrischale	Fischer	0875713
50 ml Zentrifugenröhrchen	Fischer	05-539-6
15 ml Zentrifugenröhrchen	Fischer	05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petrischale	Fischer	0875711Z	Tiefer als Standard-Petrischalen
24-Well-Platte	Greiner Bio-One	662000-06
Mikroskop			Das Mikroskop muss florescent Funktionen kompatibel mit Ihrem Fluorophor
Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (Steril)			8 g NaCl 0,2 g KCL 1,44 g Na 2 HPO 4 0,24 g KH 2 PO 4 1 l Wasser Den pH-Wert von 7,4 und Wasser auf 1 l und Autoklav
Mikrozentrifugenröhrchen	Fischer	05-408-138	2 ml oder 1,5 ml Röhrchen
Shaker			Jeder Schüttler, der die Flüssigkeit sanft bewegen verursacht wird funktionieren
Diaminopimelinsäure	Sigma	D-1377	Wenn nötig, zu ergänzen Medien auf eine Konzentration von 1 mM oder