Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

William C. Clegern; Michele E. Moore; Michelle A. Schmidt; Jonathan Wisor

doi:10.3791/4328

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Methodenartikel

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

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DOI:

10.3791/4328

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19. Dezember 2012

William C. Clegern¹ , Michele E. Moore¹ , Michelle A. Schmidt¹ , Jonathan Wisor¹

¹Department of Veterinary & Comparative Anatomy, Pharmacology and Physiology, Sleep and Performance Research Center, WWAMI Medical Education Program, Washington State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein Verfahren zur Manipulation der Aktivität der zerebralen kortikalen Pyramidenzellen optogenetically während das Elektroenzephalogramm, Elektromyogramm, und zerebrale Laktatkonzentration überwacht werden beschrieben. Experimentelle Aufnahmen werden auf Kabel-tethered Mäusen durchgeführt, während sie spontane Schlaf / Wach-Zyklen. Optogenetische Ausrüstung wird in unserem Labor zusammengebaut; Kontrollgerät ist kommerziell erhältlich.

Zusammenfassung

Obwohl das Gehirn macht weniger als 5% des Körpers Massenteile, nutzt sie etwa einem Viertel der Glucose durch den Körper in Ruhe ¹ verwendet. Die Funktion des non rapid eye movement sleep (NREMS), der größte Teil der Schlaf durch die Zeit, ist ungewiss. Allerdings ist ein herausragendes Merkmal der NREMS eine signifikante Reduktion der Rate der zerebralen Glucoseverwertungsstörungen relativ zu Wachheit ^2-4. Diese und andere Erkenntnisse haben zu der weit verbreiteten Meinung, dass der Schlaf eine Funktion im Zusammenhang mit zerebralen Metabolismus dient geführt. Dennoch bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen der Reduktion des zerebralen Glukosestoffwechsels während NREMS aufgeklärt werden.

Ein Phänomen, das mit NREMS zerebralen Stoffwechsel auswirken könnten einhergeht, ist das Auftreten der langsamen Wellen, Schwingungen mit Frequenzen von weniger als 4 Hz, im Elektroenzephalogramm ^5,6. Diese langsame Wellen auf der Ebene des Schädels oder zerebraler kortikalen Oberfläche detektiert spiegeln dieSchwingungen des zugrunde liegenden Neuronen zwischen einem depolarisiert / up Staat und einem hyperpolarisierten / down Zustand ^7. Während der ausgeschaltete Zustand, noch nicht erfahren Zellen Aktionspotentiale bei Intervallen von bis zu einigen hundert Millisekunden. Restaurierung von ionischen Konzentrationsgradienten im Anschluss an Aktionspotentiale stellt eine bedeutende metabolische Belastung der Zelle ^8, Fehlen von Aktionspotentialen während sich Staaten mit NREMS verbunden sein mit einem verminderten Metabolismus relativ zu wecken beitragen.

Zwei technische Herausforderungen mussten, damit diese hypothetische Beziehung zu testenden adressiert werden. Zuerst war es notwendig, cerebralen Metabolismus glykolytischen mit einer zeitlichen Auflösung reflektierenden der Dynamik des zerebralen EEG messen (das heißt über Sekunden statt Minuten). Dazu maßen wir die Konzentration von Lactat, das Produkt der aerobe Glycolyse und daher ein Auslesen der Geschwindigkeit des Glukosemetabolismus in den Gehirnen der Mäuse. Lactatgemessen mit einem Lactatoxidase basierte Echtzeit-Sensor im frontalen Kortex eingebettet. Der Sensormechanismus aus einem Platin-Iridium-Elektrode durch eine Schicht aus Lactatoxidase Moleküle umgeben. Metabolismus von Lactat von Lactatoxidase produziert Wasserstoffperoxid, die einen Strom erzeugt in der Platin-Iridium-Elektrode. So ein Hochfahren der zerebralen Glykolyse gibt einen Anstieg in der Konzentration des Substrats für Lactat-Oxidase, die dann in erhöhten Strom an der Meßelektrode reflektiert wird. Es war darüber hinaus notwendig, diese Variablen zu messen, während die Manipulation der Erregbarkeit der Hirnrinde, um diese Variable von anderen Facetten NREMS isolieren.

Wir entwickelten ein experimentelles System zur gleichzeitigen Messung der neuronalen Aktivität über den elecetroencephalogram, Messung der glykolytischen Fluss über einen Biosensor Lactat, und Manipulation von zerebralen Kortex neuronale Aktivität über optogenetische Aktivierung pyraMIDAL Neuronen. Wir haben dieses System genutzt werden, um die Beziehung zwischen Schlaf-bezogenen EEG-Wellenformen und die Moment-zu-Moment Dynamik der Laktat-Konzentration in der Großhirnrinde zu dokumentieren. Das Protokoll kann für jeden einzelnen an einem Studium Interesse nützlich, in frei verhalten Nagetiere, die Beziehung zwischen neuronaler Aktivität bei der zellulären Ebene und elektroenzephalographischen Energetik innerhalb des Gehirns gemessen.

Protokoll

Ein. Chirurgische Vorbereitung der Tiere

Ein. Experimentelle Fächer

Verwenden Mäuse der B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J transgenen Linie ^9; JAX Stamm # 7612) oder andere Mäuse Exprimieren des blauen lichtempfindlichen Kationenkanal, Channelrhodopsin-2, des zerebralen kortikalen Neuronen. Anwendung von blauem Licht zur Hirnrinde des B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J transgenen Linie bewirkt, dass die pyramidalen Neuronen exprimieren Channelrhodopsin-2 zu depolarisieren und dort einer Aktionspotentiale ^9,10. Als Folge der pyramidenförmigen Zellaktivierung werden lokale Interneuronen akti....