Methodenartikel

Dissection, Kultur und Analyse der

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DOI:

10.3791/4377

⸱

23. Dezember 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, College of William and Mary

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Xenopus laevis bietet ein ideales Modellsystem zur Untersuchung von Zell Schicksal Spezifikation und physiologische Funktion der einzelnen Zellen der Netzhaut in primären Zellkulturen. Hier stellen wir eine Technik zum Präparieren Netzhautgewebe und Erzeugen primären Zellkulturen, die für Calcium-Aktivität abgebildet und analysiert werden durch in situ-Hybridisierung.

Zusammenfassung

Der Prozess, durch den vorderen Bereich des Neuralplatte ergibt sich die Retina von Wirbeltieren weiterhin ein wichtiger Schwerpunkt der klinischen und der Grundlagenforschung sein. Neben der offensichtlichen medizinischen Relevanz für das Verständnis und die Behandlung von Netzhauterkrankungen, weiterhin die Entwicklung der Retina von Wirbeltieren als ein wichtiges und elegantes Modell für das Verständnis neuronaler Zelltyp Bestimmung und Unterscheidung 1-16 dienen. Das neurale Retina besteht aus sechs diskrete Zelltypen (Ganglion amakrinen, horizontal, Fotorezeptoren, bipolaren Zellen, und Müller Gliazellen) in stereotypen Schichten angeordnet sind, ein Muster, das weitgehend unter allen Vertebraten 12,14-18 konserviert ist.

Während des Studiums der Netzhaut im intakten entwickelnden Embryo ist eindeutig für das Verständnis erforderlich, wie dieses komplexe Organ von einem Vorsprung des Vorderhirns in eine geschichtete Struktur entwickelt, gibt es viele Fragen, die fro profitierenm Einsatz Ansätze unter Verwendung von primären Zellkulturen von mutmaßlichem Netzhautzellen 7,19-23. Beispielsweise Analysieren von Zellen aus Geweben entfernt und dissoziiert in verschiedenen Phasen ermöglicht es, den Stand der Spezifikation der einzelnen Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden, das heißt, das Schicksal der Zellen in Abwesenheit von Wechselwirkungen mit benachbarten Geweben 8,19-22 ,24-33. Primäre Zellkultur ermöglicht auch die Ermittler, die Kultur mit spezifischen Reagenzien zu behandeln und analysieren die Ergebnisse auf einer einzigen Zellebene 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, ein klassisches Modellsystem für die Untersuchung von frühen neuralen Entwicklung 19,27,29,31-32,40-42, dient als ein besonders geeignetes System zur Netzhaut primäre Zellkultur 10,38,43-45.

Mutmaßlich Netzhautgewebe ist von den frühesten Stadien der Entwicklung, unmittelbar nach neuralen Induktion 25,38,43. Darüber hinaus, th gegebenbei dem jede Zelle im Embryo eines Vorrats von Eigelb enthält, retinaler Zellen in einem sehr einfachen definierten Medien, bestehend aus einer gepufferten Salzlösung kultiviert werden, wodurch das Entfernen der Wirkung von Störfaktoren Inkubation Seren oder anderen Produkten auf 10,24,44-45 .

Allerdings ist die Isolierung des Retinagewebe vom umgebenden Gewebe und der nachfolgenden Verarbeitung schwierig. Hier stellen wir ein Verfahren zur Präparation und Dissoziation von Retinazellen in Xenopus laevis, die zum primären Zellkulturen, die wiederum für Calcium Aktivität und Genexpression bei der Auflösung von einzelnen Zellen analysiert werden vorbereitet wird. Während das Thema in diesem Papier ist die Analyse der spontanen Kalzium Transienten ist die Technik breit anwendbar auf ein breites Spektrum von Fragestellungen und Ansätze (Abbildung 1).

Protokoll

Alle Versuche werden folgende Protokolle durch die Institutional Animal Care und Use Committee am College of William and Mary genehmigte durchgeführt. Entwicklungsstadien in diesem Protokoll verwiesen werden nach Nieuwkoop and Faber 46.

Ein. Präparation

  1. Lassen Sie das Zellkulturmedium und Calcium Magnesium Kostenlose Medium (CMF) auf Raumtemperatur äquilibrieren. Sie müssen auch 0,1 er Marcs modifizierte Ringer-(MMR) pH 7,4-7,6.
  2. Sterilisieren die folgenden Elemente durch Aufbringen eines UV-Licht für 30 min in einer Zellkultur Sterilbank. (Spray jedes Element mit 70% Ethanol, bevor sie in der Motorhaube.)
    • 35 mm Kunststoff-Petrischalen.
    • 60 mm Kunststoff-Petrischalen.
    • 35 mm Nunclon Oberfläche Gerichte.
    • 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    • p1000 Mikropipette (1.000 ul Mikropipette).
    • Aerosol beständig p1000 Tipps (1.000 ul Mikropipette Aerosol beständig Tipps).
    • Alkoholresistenten Stift.
    • Feine Pinzette.
    • * 15 ml konischen Röhrchen (nur für die Bildgebung Calcium-Aktivität).
    • * Nur für die Bildgebung von Kalzium Aktivität.
  3. Sobald die Haube UV sterilisiert worden und Lösungen auf Raumtemperatur gebracht, auf dem laminaren Luftstrom wiederum in der Motorhaube, abspritzen Handschuhe und Medien-Flaschen mit 70% Ethanol und Ort media Flaschen in der Haube.
  4. Im Inneren der Haube bereiten Sie die folgenden mit einem p1000 Mikropipette für jede Platte von Zellen, eine angemessene Etikettierung.
    • Ein 60 mm Kunststoff-Petrischale mit 10 ml Zellkulturmedium - Dissection Plate.
    • Ein 35 mm Nunclon Oberfläche Schale mit 2 ml Zellkulturmedium - Kultur Plate. (Nunclon Plastikschalen nicht weiter mit irgendwelchen Klebstoffen behandelt.)
    • Eine leere 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen-Explantation Dissoziation Tube.
    • * Ein 15 ml konischen FalkenRöhrchen, enthaltend 15 ml Zellkulturmedium. Zum Waschen überschüssiges Fluo4-AM bei der Bildgebung Calcium Aktivität.
  5. Im Inneren der Kapuze, bereiten Sie die folgenden mit einem p1000 Mikropipette für jeden Dissektion Sitzung (mehr als ein Netzhaut kann in einer Sitzung seziert werden).
    • Ein 35 mm Kunststoff-Petrischale mit 2 ml CMF - Explantation spülen Plate.
    • Ein 35 mm Kunststoff-Petrischale mit 2 ml CMF - Explantation Dissoziation Plate.
  6. Außerhalb der Haube bereiten Sie die folgenden:
    • Ein 60 mm Kunststoff-Petrischale pro Platte von Zellen mit 10 ml 0,1 x MMR - Holding Plate.
    • Ein 60 mm Kunststoff-Petrischale pro Platte von Zellen mit 10 ml 0,1 x MMR - Sibling Plate.
    • Ein 60 mm Kunststoff-Petrischale pro Dissektion Sitzung, die 10 ml 0,1 X MMR + 0,5 mg / ml MS-222 (Tricain) - anesthetization Plate.
  7. Add 40 ul 5% Trypsin in CMF zur Explantation Dissoziation Plate (was in einer 0,1% Trypsin-Lösung), Schwenken vermischen und beiseite stellen.
  8. Wenn Sezieren eines Embryos, die jünger als Stufe 30 ist, fügen Sie 10 mg Collagenase B der Dissection Plate (was in einer 1 mg / ml Collagenase B-Lösung), wirbeln zu lösen und beiseite stellen.
  9. Wählen Sie einen Embryo des gewünschten Zeitpunkt an der Halteplatte mit einem nicht-sterile Pipette übertragen, und entfernen Sie die Dotterhaut (wenn der Embryo noch nicht schraffiert) mit feinen Pinzette.
  10. Übertragen mehrere identisch inszeniert Embryonen in die Geschwister-Platte mit einem nicht-sterile Pipette.
  11. Wenn der Embryo-Stufe 25 oder früher, direkt weiter mit Dissektion, anderweitig die Embryos zur Anästhesierung Platte mit einer nicht-sterilen Pipette und erlauben der Embryo zu sitzen, bis Bewegung und der Reaktion auf Reize aufhört. Dies könntebis zu einer Minute.
  12. Fahren Sie mit Dissektion (Abbildung 2) unter einem Binokular (4X Ziel, 10x Okular).

Bei Embryonen Stufe 25 oder jünger:

  1. Übertragen Embryo in die Dissektion Platte mit einer nicht-sterilen Pipette.
  2. Die Verwendung von zwei Paaren von feinen Pinzette, einen sagittalen Schnitt auf der Bauchseite des Embryos, die am hinteren Ende und weiter durch den Zement Drüse im anterioren Abschnitt des Embryos.
  3. Öffnen Sie vorsichtig den Embryo durch Greifen entweder Rande des Schnittes und die Verbreitung links und rechts. Dies resultiert in einem Embryo mit der dorsalen zugewandten Seite in die Dissektion Platte, und mit der ventralen Ektoderm aufgespreizt die Endoderm und Mesoderm innerhalb offenbaren.
  4. Beginnen Sie das Entfernen der Endoderm und Mesoderm (2A und 2B). Der erste und größte Schicht dieser Gewebe ist sehr "fluffy" in Erscheinung mitgroßen Zellen und wenig offensichtlich Organisation.
  5. Nach dem Entfernen dieser Schicht wird die Somiten und Chorda sichtbar. Für einen besseren Kontrast, bewegen Sie den Embryo zu einem separaten 60 mm Kunststoff-Petrischale mit 10 ml Zellkulturmedium und 100 ul 1% ige Lösung von Nile Blue Sulfate (in Wasser) für 2-3 min, bevor sie wieder an die Dissection Plate. Dies färbt das Ektoderm, Somiten und Chorda zur leichteren Identifikation und Orientierung.
  6. Die Fokussierung auf den vorderen Teil des Embryos, entfernen Sie vorsichtig die Chorda und alle verbleibenden Mesoderm Aussetzen des Gehirns und Augenblasen (Abbildung 2C).
  7. Sobald das Gehirn und Augenblasen vollständig ausgesetzt sind, verwenden Sie die Zange, um das Neuralrohr und die zugrunde liegenden Ektoderm unmittelbar hinter dem Gehirn zu trennen.
  8. Drehen Sie diesen Teil (das Gehirn und Augenblasen) über, so dass die Ektoderm oben ist.
  9. Dabei nicht um die zugrunde liegenden Augenblasen beschädigen, vorsichtig wiederbewegen Sie den Ektoderm (Abb. 2D).
  10. Schließlich, unter Verwendung einer Pinzette, trennen die Augenblasen vom Gehirn (2D und 2E).

Bei Embryonen älter als Stufe 25:

  1. Während der Embryo in der Betäubung Plate, entfernen Sie das ventrale Teil des Embryos mit einer Pinzette.
  2. Für einen besseren Kontrast, bewegen Sie den Embryo zu einem 60 mm Kunststoff-Petrischale mit 10 ml 0,1 x MMR und 100 ul von 1% Nile Blue Sulfate für 2-3 min vor der Übertragung an den Dissection Plate. Dies färbt das Ektoderm blau.
  3. Einmal in der Dissection Plate, ziehen Sie den Ektoderm über der Netzhaut (oder Augenblase für die Embryonen Bühne 26-30) (Abbildung 2F und 2G). Wenn Nilblau Sulfat eingesetzt wurde, wird die Ektoderm angefärbt werden, aber die darunter liegenden Netzhautgewebe nicht.
  4. Entfernen Sie die Netzhaut oder Augenblase vorsichtig mit forceps (2H, 2I, und 2J). Es ist hilfreich, um den Embryo in Position zu halten mit einer Pinzette und entfernen Sie die Netzhaut oder Augenblase mit dem anderen.

2. Dissoziation von Tissue und Oberflächen von Zellen

Wichtiger Hinweis - Bei der Übertragung von Gewebe, darf die Netzhaut oder Augenblase, um alle Luft-Flüssigkeit-Grenzen berühren, wenn dies der Fall ist, werden die Zellen zu lysieren.

  1. Sobald die Augenblase oder Netzhaut seziert hat, sorgfältig auf die Explantation zu übertragen spülen Platte mit einem p100 Mikropipette mit Aerosol beständig Tipps und lassen für 30 Sekunden sitzen.
  2. Übertragen 80 ul 0,1% Trypsin in CMF aus dem Explantat Dissoziation Platte zur Explantation Dissoziation Tube.
  3. Mit einem p100 Mikropipette und Aerosol-resistente Tipps, übertragen die Netzhaut oder Augenblase aus dem Explantat spülen Platte zur Explantation Dissociatimit Tube, Vermeidung einer Übertragung von den Explantaten Spüllösung.
  4. Erlauben das Gewebe in der Explantation Dissoziation Tube für 1 Stunde bei Raumtemperatur dissoziieren. Einer Retina pro Platte verwendet wurde jedoch bemerken wir, dass es möglich ist, mehr als einen pro Platte zu verwenden, wenn dies gewünscht wird, die Anzahl der Zellen pro Platte zu erhöhen.
  5. Auf die Platte, die Zellen, erst langsam zu entfernen 40 ul der Lösung aus dem Explantat Dissoziation Tube und entsorgen mit einem p100 Mikropipette und Aerosol-resistenten Spitzen. Mit einem p100-Set bis 40 ul und Aerosol-resistente Tipps, übertragen die Zellen (jetzt, dass das Gewebe dissoziiert hat) auf die Kultur Plate. Zum Ansaugen der Zellen auf der Platte, langsam pipettieren und halten die Zellen in einem kleinen Bereich in der Mitte der Platte.

Anmerkung: Wenn mehrere Bilder der Zellen während des Experiments zu fassen sind, befestigen eines Gitters (Cellattice) an die Unterseite der Kulturplatte mit einem kleinen Tropfen Sekundenkleber. Dadurch können Bilder der identischen Zellen, die in gleicher Orientierung an unterschiedlichen Punkten des Verfahrens entnommen werden.

  1. Damit die Zellen zu sitzen für mindestens 1 Stunde ungestört auf die Nunclon Platte haften. Nach dieser Zeit muss sie sehr schonend behandelt werden oder sie könnten sich ablösen.
  2. Kulturzellen um gewünschte Stufe durch Beobachtung der nebengeordneten Embryonen, die bei der gleichen Temperatur wie die Zellen gezüchtet werden. Wenn lebenden Zellen nicht zur weiteren Bearbeitung verwendet wird, können sie in MEMFA Lösung zu diesem Zeitpunkt festgesetzt.

Wichtiger Hinweis: Die meisten unserer Experimente sind innerhalb von 6 h Ausplattieren der Zellen fixiert. Die Langlebigkeit der Zellen in Kultur ist abhängig von dem Stadium, in dem das Gewebe wurde seziert und der Menge an noch vorhandenen Dotter in den Zellen; Zellen aus J. (Neurula Stufen) seziert gesund bleiben in Kultur für 5-6 Tage, während Zellen von erworbenen älteren Embryonen (Schwimmen tadpoleStufen) bleiben in der Kultur lebensfähig für 2-3 Tage.

3. Calcium Imaging 47-49

Dieses Protokoll nutzt Calcium-sensitiven Fluo4-AM und konfokale Mikroskopie, Kalzium Transienten in einzelnen Zellen zu quantifizieren. Alle Schritte mit Fluo4-AM sollte weg vom Licht durchgeführt werden, wie Fluo4-AM ist lichtempfindlich. Alle Wäschen sollte hinzugefügt oder entfernt werden mit einem p1000 Mikropipette und Aerosol-resistenten Spitzen. Pipettiervorgänge langsam und in Richtung der Kante der Platte zu verhindern, daß die Zellen erfolgen. Die Medien werden nicht geändert, weil die Kulturen in der Regel innerhalb von 6 h wird seziert befestigt sind. Für längerfristige Kulturen, sollten die Medien täglich gewechselt werden.

  1. Fluo4-AM wird bei -20 ° C gelagert, und wir empfehlen in 5 ul Aliquots lagern. Vor der Verwendung auftauen eine 5 ul Aliquot Fluo4-AM weg vom Licht und fügen 2 ul Pluronic F-127 direkt zu diesem Aliquot.
  2. Nach dem Kultivieren der Zellen für die gewünschte Menge an Zeit (mindestens1 Std.), entfernen 1 ml des Zellkulturmediums von der Kulturplatte. Fügen Sie diese auf der Fluo4-AM und Pluronic, Mischen durch vorsichtiges Pipettieren.
  3. Langsam übertragen alle dieser Lösung zurück zu dem Rand der Platte Kultur der Zellen abzubildenden und verlassen die Zellen in dieser Lösung für 1 Stunde ungestört die Fluo4-AM absorbieren.
  4. Zum Auswaschen überschüssigen Fluo4-Uhr aus dem Zellkulturmedium, füllen Sie das folgende wash Serie:
    • Entfernen 1 ml Medium von der Platte.
    • 3 ml frisches Zellkulturmedium (aus den 15 ml konischen Röhrchen) an der Platte.
    • Führen zwei zusätzliche Wäschen jeweils langsam Entfernen von 3 ml Lösung von der Platte und Zugabe von 3 ml frisches Zellkulturmedien.
  5. Die Zellen sollten nun in 4 ml Zellkulturmedium sein und darf Fluo4-AM. Fluo4-AM wird enzymatisch einmal innerhalb der Zelle abgespalten wird, verhindern, dass es Diffundieren aus der Zelle oder in jede membrangebundene Kompartimente.
  6. Vor dem Laden der Platte auf die Stufe des konfokalen Mikroskops zum Abbilden Ziehung einer vertikalen roten Linie mit permanenten Markierung auf der Schale, während Deckel auf Markerpartikel verunreinigen die Kultur zu verhindern. Die vertikale Linie ist an der Seite der Petrischale (die Basis der Petrischale, nicht der Deckel) erstellt. Sein Zweck ist es, die Orientierung der Kulturplatte gegenüber dem Sichtfeld angeben, so daß die genaue Orientierung und Ausrichtung der einzelnen Zellen kann zu einem späteren Zeitpunkt wieder aufgenommen werden.
  7. Die Platte ist nun bereit zum Laden auf der Bühne des konfokalen Mikroskops zum Abbilden. Visualisieren Sie die Zellen mit den Hellfeld-Einstellungen auf einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop (Objektiv 20x). Finden einer Fläche von dichten Zellen nicht enthält Klumpen, vorzugsweise mit einem Sichtfeld, das die großen Raster Zahlen auf der Cellatice Deckplättchen, um das Auffinden der gleichen Sichtfelds später leichter bei der Abbildung enthält die Kultur nach der in situ-Hybridisierung. Vor der Bebilderung, konzentrieren unten durch die Kultur und einen Hellfeldbild des Gitters unter den Zellen, um den Ort und die Orientierung der Zellkultur aufzuzeichnen. Dies ermöglicht Neuausrichtung der Zellen für eine nachfolgende Analyse.
  8. Heben Sie die Brennebene und erfassen einen Hellfeldbild der Zellen vor Beginn Calcium Imaging (Abbildung 3A).
  9. Sobald der Mittelebene der Zellen im Fokus ist, ist die Platte bereit zum Abbilden von Calcium-Aktivität. Einstellungen variiert in Abhängigkeit von dem Mikroskop und der Anwendung. Wir Bild der Zellen unter Verwendung eines Argon-Laser 488 nm für 1, 2 oder 12 h mit den folgenden Parametern:
    • 1 hr Bilder:
      • Argon 488 nm Laser tastet bei 4% der maximal 30 mW Leistung.
      • Einmal scannen alle 4 Sek. (900 Scans pro Stunde).
    • 2 Stunden Bilder:
      • Argon 488 nm Laser tastet bei 4% der maximal 30 mW Leistung.
      • Einmal scannen jeden8 sec (450 Scans pro Stunde).
    • 12-Stunden-Bilder:
      • Argon 488 nm Laser tastet bei 2% der maximal 30 mW Leistung.
      • Einmal scannen alle 48 sec (75 Scans pro Stunde).

Diese Parameter werden in einer Menge von 900 Standbild Bilder für jeden Zeitrahmen führen. Calcium-Aktivität kann dann durch Analyse Fluoreszenzwerte in den Zeitverlauf Bilder (3B) mit der Verwendung von einer Bildverarbeitungs-Anwendung wie ImageJ 50 aufgezeichnet werden.

4. Fixierung von Zellen

  1. Nach Bildgebung können die Zellen für 30 min mit dem Entfernen von 3 ml Lösung von der Platte und Zugabe von 1 ml 2X MEMFA dem restlichen 1 ml Kulturmedium fixiert werden.
  2. Nach der Fixierung und Entfernen MEMFA dehydratisieren Zellen mit einer Reihe von 5 Wäschen min, jeweils ein Volumen von 1 ml:
    • 25% Ethanol in 1X Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
    • 50% Ethanol in 1X PBS.
    • 75% Ethanol in H 2 O sdd (steriles entionisiertes destilliertes Wasser).
    • Ersetzen Sie die letzte Waschung mit 1 ml 100% Ethanol und speichern Platte bei -20 ° C.

Hinweis: Methanol kann auch für diese wäscht und für die Lagerung verwendet werden.

5. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Kulturen können unter Verwendung der Standard-FISH-Protokoll für Xenopus wie beschrieben 51 mit Modifikationen für die Zellkultur durch das Anderson Lab 52 skizziert. Modifikationen an der Anderson Lab-Protokoll sind unten aufgeführt. Alle Wäschen sind auf den 35 mm Nunclon Platten in einem Volumen von ca. 1 ml durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Lösungen werden wie in Sive et al. 53, sofern nicht anders vermerkt.

Wichtiger Hinweis: Verwenden Sie keine Fluorescein-markierten RNA-Sonden bei der Durchführung von in situ Hybridisierung auf Zellen abgebildet fürCalcium Aktivität. Anti-Fluorescein Antikörper werden, um restliche Fluo4-AM in die Zellen und können positive Signal in allen Zellen in der Kultur verursachen binden.

Tag 1: Permeabilisierung und Hybridisierung

  1. Rehydration Wäschen sollte die Dehydratisierung Lösungsmittel für die Speicherung verwendet benotet. Für unsere Experimente wurden Wäschen zu Ethanol in 1X PBS benotet.
  2. Nach Rehydrierung Waschen Sie die Zellen drei weitere Male in 1X PBS für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  3. 25 ml von 0,1 M Triethanolamin (pH 8,0) mit 62,5 ul Essigsäureanhydrid in einem Falcon-Röhrchen und schnell mischen, bis gründlich verteilt wie bereits in der Anderson Lab 52 Protokoll. Inkubieren Kulturen in dieser Mischung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach Essigsäureanhydrid Behandlung, Waschen Zellen in 1X Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) für 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Entfernen Sie die letzte SSC waschen und ersetzen mit 0,2 M HCl (in sdd H 2 O) für 10 min, um Zellen permeabilisiert.
  5. Auswaschen HCl mit zwei Waschungen in 1X PBS für 5 min.
  6. Prehybridize in ISH-Puffer bei 60 ° C in einem Schüttelwasserbad für mindestens 6 Stunden, aber nicht prehybridize Nacht, da dies stark verringert Signal.
  7. Hybridisierung über Nacht bei 60 ° C für 8-14 h in 750 ul verdünnte Probe (1:250 Verdünnung einer gereinigte Sonde). Das gereinigte Sonde Konzentrationsbereichen von 1,0 bis 1,5 ug / ul.

Tag 2: Entfernung der ungebundenen Sonde und Antikörper Inkubation

  1. Nehmen Sie die Sonde und spülen Kulturen für 5 min in 0,2 x SSC bei 60 ° C. Waschen in frischem 0.2X SSC für 1 Stunde bei 60 ° C.
  2. Entfernen Kulturen aus dem Wasserbad und ihnen zu erlauben auf Raumtemperatur für 5 min einzustellen.
  3. Spülen in 0,2 × SSC bei Raumtemperatur für 5 min.
  4. Waschen für 15 Minuten in 1X PBS mit 0,1% Triton-X-100 (PBT).
  5. Um endogene Peroxidasen inaktiviert, für 1 Stunde in einer 2% H 2 O 2-Lösung in PBT gewaschen.
  6. mit einem 15 min Waschen in 1X Tris spülen Buffered mit 0,1% Tween 20 (TBST) Saline.
  7. Blockieren in 2% Blocking Reagenz in Maleinsäure-Puffer (MAB) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wir haben festgestellt, dass diese blockierende Methode Empfindlichkeit erhöht im Vergleich zu bisherigen Methoden der Blockade in 20% Schafserum in PBT.
  8. Inkubieren Kulturen in 1 ml 2% Blocking Reagenz in MAB enthaltend eine 1:1000 Verdünnung eines POD-konjugierten Antikörper über Nacht bei 4 ° C.

Tag 3: Entfernen des ungebundenen Antikörper und Fluoreszenz Entwicklung

  1. Entfernen Antikörperlösung und spülen 3 mal in TBST für 5 min bei Raumtemperatur.
  2. 4 mal Waschen mit TBST für 15 min bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln bei einer geringen Geschwindigkeit.
  3. Zweimal waschen in PBT bei Raumtemperatur für 10 min.
  4. Übernehmen 750 ul von 1:200 Fluorescein-Tyramid oder 1:25 Cy3 Tyramid in PBT verdünnt. Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur und fügen 2,5 ul 0,3% H 2 O 2. Rock für 40 min zu ermöglichen Signals zu entwickeln.
  5. Waschen Sie mindestens 4 Mal für je 15 min in TBST bei Raumtemperatur unter Schütteln.
  6. Sobald Signal vollständig entwickelt hat, für 5 min in 1X PBT waschen.
  7. Fix in 1X MEMFA für 1 Stunde bei Raumtemperatur und Shop in 1X PBS bei 4 ° C.

6. Bild FISH Ergebnisse und Co-Register Calcium Imaging Daten

  1. Bei Abschluss FISH werden Zellkulturplatten abgebildet zu bestimmen, welche Zellen zeigen eine positive Fluoreszenzsignal für eine gegebene Sonde. Verwenden des Deckplättchens Cellattice um die genaue Sichtfeld während Calcium Imaging untersucht finden und Ausrichten der Platte an der Orientierung der Calcium Bildframes.
  2. Konzentrieren Sie sich auf die Mittelebene der Zellen und nehmen Sie ein einzelnes hochauflösendes Bild mit dem Helium-Neon HeNe 543 nm Laser bei 15% der maximal 1 mW Leistung (3C).
  3. In der ursprünglichen 900-Rahmen von Bildern aus dem Calcium Imaging-Protokoll übernommen gesetzt,Identifizierung einzelner Zellen als Regions of Interest (ROI) durch die Verwendung von einem Bildverarbeitungsprogramm (wie ImageJ 50). Extrahieren ROI Fluoreszenz Daten als ein Satz von Datenpunkten repräsentiert Time-Fluoreszenz Paars Werte (Abbildung 4).
  4. Überlagern die FISH-Ergebnisse Bildes mit der identifizierten ROIs aus den Calcium-Bilder (Abbildung 3D).
  5. Registrieren jedes ROI als positiv für die Sonde, negativ für die Sonde oder unbekannt - im Fall, dass die Zelle, die dem ROI nicht mehr innerhalb des Sichtfeldes des FISH Bild gefunden werden.
  6. Verfahren ROI Fluoreszenzdaten anhand einer statistischen Analyse der Script (wie durch MATLAB oder anderen Programmiersprache bezeichnet), die Calcium-Aktivität zwischen verschiedenen Ebenen seziert Stufen (5A und 5C) oder Zellen positiv für unterschiedliche FISH-Sonden (5B und 5D) zu vergleichen. Alle Skripte in unserem Labor verwendet werden, sind frei verfügbar auf Anfrage.

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Ergebnisse

Beispiele von erfolgreich seziert Augenblasen (Stadium 25) und retinae (Stufe 35) sind in den Figuren 2E und 2J gezeigt. Während dieses Protokoll in verschiedenen Stadien der Entwicklung verwendet werden kann, ist es entscheidend, um nur Retinagewebe zu erhalten, um die Genauigkeit für weitere Experimente gewährleisten. Entfernen Sie vorsichtig die Epidermis in allen Phasen und sicherzustellen, dass Ihre Pinzette nicht Punktion der Netzhautgewebe. In der Stufe 35 oder älter, kann die Linse als klare Sch...

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Diskussion

Mit seinen gut charakterisierten Zelltypen, die in allen Wirbeltieren konserviert sind, bietet die Netzhaut ein nützliches Modell für die Untersuchung der molekularen zellulären Prozesse, die die Zelltyp Spezifizierung und Differenzierung. Primäre Zellkultur bietet eine leistungsfähige Methode für die Untersuchung einer Vielzahl von Prozessen einschließlich Genexpression, Protein Dynamik und Kalzium und elektrische Aktivität auf der Ebene der einzelnen Zelle Auflösung. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Technik f...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Wir huldvoll danken Dr. John Hayes für Skripte; Drs. Eric Bradley und Christopher Del Negro für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, und Liz MacMurray für ihre Arbeit bei der Entwicklung des Projekts und die Bereitstellung vorläufige Daten; Dr. Greg Smith für Anregungen auf einer statistischen Analyse. Diese Arbeit wurde durch ein NIH (NINDS IR15N5067566-01), um MSS und Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant zum College of William and Mary unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer
Für Dissektionen und Kultivierung
BD Falcon Easy Grip Zellkulturschalen, 35 mm Fischer 08-772a
Einweg Polystyrol Petrischalen, 60 x 15 mm Fischer 0875713A
35 mm Nunclon Oberfläche Petrischalen (mit Airvent) Fischer 12-565-91
Dumont feinen Pinzette (Dumostar # 55) Fischer NC9341917
Cellattice Micro-regierten Kunststoff Deckglas, 25 mm Fischer 50-313-17
Ethyl-m-aminobenzoat Methansulfonatsalz (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicinsulfat Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B aus Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz & Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter / Storage Bottle System, 0,22 um Pore 33,2 cm 2 CN Membrane Corning 430758
Für Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Lösung in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14.217
Pluronic F-127 10% Lösung in Wasser Life Technologies P-6866
LSM 510 Konfokale Mikroskop-System Zeiss Modell Discontinued
Blockierungsreagenz Roche 11096176001
Für Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab-Fragmenten Roche 11207733910
Anti-DNP-Antikörper-HRP Perkin-Elmer NEL747A
Cy3NHS-Ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamid, Deionisiertes Amresco 0606-950ml
Torula RNA, Typ IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, Darmschleimhaut von Schweinen Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Tabelle 2. Spezifisch Reagenzien und Ausrüstung.

Lösung Referenz Inhalt
Cell Culture Medium Chang und Spitzer, 2009 54 116 mM NaCl
0,67 mM KCl
2 mM CaCl 2
1,31 mM MgSO 4
4,6 mM Tris
1% (v: v) Penicillin / Streptomycin
Der pH-Wert auf 7,8 mit HCl.
Filter, indem sie durch eine 0,22 um CN-Filter sterilisieren.
Lagerung bei 4 ° C.
Calcium-Magnesium Kostenlose Medium (CMF) Gu et al, 1994 42;. Gu und Spitzer, 1995 55 116 mM NaCl
0,67 mM KCl
4,6 mM Tris
0,4 mM EDTA
1% (v: v) Penicillin / Streptomycin
Der pH-Wert auf 7,8 mit HCl.
Filter, indem sie durch eine 0,22 um CN-Filter sterilisieren.
Lagerung bei 4 ° C.
Maleinsäure-Puffer (MAB) Sive et al., 2000 53 100 mM Maleinsäure
150 mM NaCl (pH 7,5).
Marcs Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 2000 53 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO 4
2 mM CaCl 2
5 mM HEPES
pH mit NaOH auf 7,4 eingestellt
0,1 X MMR enthält auch 50 mg / ml Gentamicinsulfat und der pH wird mit NaOH auf 7,4 eingestellt.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 2000 53 0,1 M MOPS (pH 7,4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO 4
3,7% Formaldehyd
A 10X Lösung, ohne Formaldehyd, bei 4 ° C gelagert werden Formaldehyd zugegeben frischen (1/10 Volumen einer Standard-37% Aktien).
In-situ-Hybridisierung Buffer SivE et al., 2000 53 50% Formamid
5X SSC
1 mg / ml RNA Torula
100 mg / ml Heparin
1X Denharts Lösung
0,1% Tween 20
0,1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. * Gentamicin, ein Antibiotikum, wird in unserem MMR-Lösungen verwendet werden, während Penicillin und Streptomycin in unserer Kultur Medien verwendet werden.

Referenzen

  1. Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
  2. Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The emergence, localization and maturation of neurotransmitter systems during development of the retina in Xenopus laevis. I. Gamma aminobutyric acid. J. Comp. Neurol. 188, 587-598 (1979).
  3. Hamm, H. E., Menaker, M. Retinal rhythms in chicks: circadian variation in melantonin and serotonin N-acetyltransferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4998-5002 (1980).
  4. Szaro, B., Ide, C., Kaye, C., Tompkins, R. Regulation in the neural plate of Xenopus laevis demonstrated by genetic markers. J. Exp. Zool. 234, 117-129 (1985).
  5. Holliday, J., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium influx and its roles in differentiation of spinal neurons in culture. Dev. Biol. 141, 13-23 (1990).
  6. Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Gilbert, W., Dowling, J. E., Drager, U. C. Retinoic acid is necessary for development of the ventral retina in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7286-7290 (1994).
  7. Feller, M. B. The role of nAChR-mediated spontaneous retinal activity in visual system development. J. Neurobiol. 53, 556-567 (2002).
  8. Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
  9. Perkins, B. D., Nicholas, C. S., Baye, L. M., Link, B. A., Dowling, J. E. dazed gene is necessary for late cell type development and retinal cell maintenance in the zebrafish retina. Dev. Dyn. 233, 680-694 (2005).
  10. Zaghloul, N. A., Moody, S. A. Changes in Rx1 and Pax6 activity at eye field stages differentially alter the production of amacrine neurotransmitter subtypes in Xenopus. Mol. Vis. 13, 86-95 (2007).
  11. Wang, C. T., et al. GABA(A) receptor-mediated signaling alters the structure of spontaneous activity in the developing retina. J. Neurosci. 27, 9130-9140 (2007).
  12. Dullin, J. P., et al. Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina. BMC Dev. Biol. 7, 110(2007).
  13. Martins, R. A., Pearson, R. A. Control of cell proliferation by neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. 1192, 37-60 (2008).
  14. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
  15. Graw, J. Eye development. Curr. Top Dev. Biol. 90, 343-386 (2010).
  16. Feller, M. B., Sun, Y. H. Introduction to special issue on retinal development. Dev. Neurobiol. 71, 1131-1132 (2011).
  17. Borodinsky, L. N., et al. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429, 523-530 (2004).
  18. Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 11, 18-29 (2010).
  19. Evers, J., et al. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: analysis of early synaptic currents. J. Neurosci. 9, 1523-1539 (1989).
  20. Spitzer, N. C., Gu, X. Purposeful patterns of spontaneous calcium transients in embryonic spinal neurons. Semin. Cell Dev. Biol. 8, 13-19 (1997).
  21. Dyer, M. A., Cepko, C. L. p57(Kip2) regulates progenitor cell proliferation and amacrine interneuron development in the mouse retina. Development. 127, 3593-3605 (2000).
  22. Harris, R. E., Coulombe, M. G., Feller, M. B. Dissociated retinal neurons form periodically active synaptic circuits. J. Neurophysiol. 88, 188-195 (2002).
  23. Feller, M. B. Retinal waves drive calcium transients in undifferentiated retinal cells. Focus on "spontaneous waves in the ventricular zone of developing mammalian retina". J Neurophysiol. 91, 1940(2004).
  24. Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1641-1645 (1976).
  25. Grant, P., Rubin, E., Cima, C. Ontogeny of the retina and optic nerve in Xenopus laevis. I. Stages in the early development of the retina. J. Comp. Neurol. 189, 593-613 (1980).
  26. Harris, W. A., Holt, C. E., Smith, T. A., Gallenson, N. Growth cones of developing retinal cells in vivo, on culture surfaces, and in collagen matrices. J. Neurosci. Res. 13, 101-122 (1985).
  27. Tabti, N., Poo, M. M. Study on the induction of spontaneous transmitter release at early nerve-muscle contacts in Xenopus cultures. Neurosci. Lett. 173, 21-26 (1994).
  28. Lin, W., Szaro, B. G. Neurofilaments help maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cord neurons. J. Neurosci. 15, 8331-8344 (1995).
  29. Rettig, J., et al. Alteration of Ca2+ dependence of neurotransmitter release by disruption of Ca2+ channel/syntaxin interaction. J. Neurosci. 17, 6647-6656 (1997).
  30. Firth, S. I., Feller, M. B. Dissociated GABAergic retinal interneurons exhibit spontaneous increases in intracellular calcium. Vis. Neurosci. 23, 807-814 (2006).
  31. Root, C. M., Velazquez-Ulloa, N. A., Monsalve, G. C., Minakova, E., Spitzer, N. C. Embryonically expressed GABA and glutamate drive electrical activity regulating neurotransmitter specification. J. Neurosci. 28, 4777-4784 (2008).
  32. Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30, 5792-5801 (2010).
  33. Nicol, X., Hong, K. P., Spitzer, N. C. Spatial and temporal second messenger codes for growth cone turning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13776-13781 (2011).
  34. Bixby, J. L., Spitzer, N. C. The appearance and development of neurotransmitter sensitivity in Xenopus embryonic spinal neurones in vitro. J. Physiol. 353, 143-155 (1984).
  35. Hightower, L. E., Renfro, J. L. Recent applications of fish cell culture to biomedical research. J. Exp. Zool. 248, 290-302 (1988).
  36. Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
  37. Feller, M. B., Delaney, K. R., Tank, D. W. Presynaptic calcium dynamics at the frog retinotectal synapse. J. Neurophysiol. 76, 381-400 (1996).
  38. Green, C. B., Liang, M. Y., Steenhard, B. M., Besharse, J. C. Ontogeny of circadian and light regulation of melatonin release in Xenopus laevis embryos. Brain Res. Dev. Brain Res. 117, 109-116 (1999).
  39. Jadhav, A. P., Mason, H. A., Cepko, C. L. Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina. Development. 133, 913-923 (2006).
  40. Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K., Hunt, R. K., Tompkins, R. The development of retinal ganglion cells in a tetraploid strain of Xenopus laevis: a morphological study utilizing intracellular dye injection. J. Comp. Neurol. 224, 231-251 (1984).
  41. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  42. Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J. Neurosci. 14, 6325-6335 (1994).
  43. Charnas, L. R., Szaro, B. G., Gainer, H. Identification and developmental expression of a novel low molecular weight neuronal intermediate filament protein expressed in Xenopus laevis. J. Neurosci. 12, 3010-3024 (1992).
  44. Gomez, T. M., Harrigan, D., Henley, J., Robles, E. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
  45. Lewis, B. B., et al. Cloning and characterization of voltage-gated calcium channel alpha1 subunits in Xenopus laevis during development. Dev. Dyn. 238, 2891-2902 (2009).
  46. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
  47. Foldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int. Immunopharmacol. 3, 1715-1729 (2003).
  48. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. J. Microsc. 228, 390-405 (2007).
  49. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, Unit 14 11(2008).
  50. Abaramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  51. Davidson, L. A., Keller, R. E. Neural tube closure in Xenopus laevis involves medial migration, directed protrusive activity, cell intercalation and convergent extension. Development. 126, 4547-4556 (1999).
  52. In Situ Hybridization Protocols [Internet]. , Available from: http://wmc.rodentia.com/docs/Big_In_Situ.html (1995).
  53. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  54. Chang, L. W., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium spike activity in embryonic spinal neurons is regulated by developmental expression of the Na+, K+-ATPase beta3 subunit. J. Neurosci. 29, 7877-7885 (2009).
  55. Gu, X., Spitzer, N. C. Distinct aspects of neuronal differentiation encoded by frequency of spontaneous Ca2+ transients. Nature. 375, 784-787 (1995).
  56. Rosenberg, S. S., Spitzer, N. C. Calcium signaling in neuronal development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a004259(2011).

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