Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

Zusammenfassung

Die Schritte, die zur täglichen Abstimmung und Optimierung der Leistung einer CyTOF Masse Zytometer beschrieben. Kommentare zu optimalen Probenaufbereitung und Durchfluss werden diskutiert

Zusammenfassung

In den letzten Jahren hat die schnelle Analyse von Einzelzellen üblicherweise durchgeführt mittels Durchflusszytometrie und fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Allerdings ist das Problem der spektralen Überlappung von Fluorophor-Emissionen die Anzahl der gleichzeitigen Sonden begrenzt. Dagegen ist die neue Masse CyTOF Zytometer von DVS Sciences Paare eine Flüssigkeit einzellige Einführungssystem mit einem ICP-MS. ¹ Anstatt Fluorophore werden chelatisierende Polymere enthaltenden hoch angereicherten Metall-Isotope an Antikörper oder andere spezifische Sonden gekoppelt. ^2-5 Aufgrund der Metall-Reinheit und Massenauflösung der Masse Zytometer, gibt es keine "spektrale Überlappung" von benachbarten Isotope, und daher keine Notwendigkeit zur Kompensation Matrizen. Zusätzlich, aufgrund der Verwendung von Lanthanidmetallen, gibt es keine biologischen Hintergrund und damit kein Äquivalent Autofluoreszenz. Mit einer Masse Fenster Spanning Atommasse 103-203, theoretisch bis zu 100 Etiketten könnten gleichzeitig unterschieden werden. Gegenwärtig, Mehr als 35 Kanäle zur Verfügung mit dem Chelatisierungsreagenzien ab DVS Sciences, ermöglicht beispiellose Dissektion der immunologische Profil der Proben. ^6-7

Nachteile sind die Masse Zytometrie strengen Notwendigkeit eines gesonderten Metallisotops pro Sonde (kein Äquivalent vorwärts oder side scatter), und die Tatsache, dass es ein zerstörungsfreies Verfahren (keine Möglichkeit der Sortierung Rückgewinnung) ist. Die aktuelle Konfiguration der Masse Zytometer hat auch eine Zellen-Übertragungsrate von nur ca. 25% und erfordern somit eine höhere Anzahl von Zellen-Eingang.

Optimale tägliche Leistung der Masse Zytometer erfordert mehrere Schritte. Das grundlegende Ziel der Optimierung besteht darin, die gemessene Signalintensität der gewünschten Metall-Isotope (M) maximieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Bildung von Oxiden (M 16), daß das M Signalintensität zu verringern und stören beliebiger Signal an M +16. Der erste Schritt ist, um sich aufzuwärmen das Gerät so ein heißer, stabile ICP Plasma hergestellt wurde. Zweitens müssen die Einstellungen für aktuelle und Make-up-Gas-Strömungsrate auf einer täglichen Basis optimiert werden. Während der Probenahme wird der maximale Zelle Ereignisrate von Detektor-Effizienz und die Verarbeitungsgeschwindigkeit zu 1000 Zellen / Sekunde begrenzt. Jedoch in Abhängigkeit von der Probe Qualität, eine langsamere Zelle Ereignisrate (300-500 Zellen / Sekunde) ist in der Regel wünschenswert, damit eine bessere Auflösung zwischen Zellen Ereignisse zu maximieren und somit intaktes Singuletts über Dubletts und Schutt. Schließlich trägt angemessene Reinigung der Maschine am Ende des Tages minimieren Hintergrundsignal durch freie Metall.

Protokoll

Alle Zellproben für die CyTOF müssen fixiert und permeabilisiert werden. Dies ermöglicht eine größere Eintrag des Iridium-haltigen DNA-Interkalator, und verhindert auch, dass während der Zelllyse MilliQ Wasser waschen und Resuspension Schritte unmittelbar vor der Injektion in die Masse Cytometer.

Ein. Start-up der Messe Cytometer

1. Öffnen Sie die CyTOF Software-Programm. Wählen Sie Instrument Setup. Auf der Karte Cage Registerkarte in der rechten unteren Ecke und klicken Sie Heater "ON"-Taste. Einschalten der Heizung mindestens 15 min vor der gewünschten Zeit, um genügend Zeit für die Sprühkammer Mantels erlauben bis 200 ° C zu e....

Ergebnisse

Nach dem obigen Protokoll sollte durchzuführen vier Dinge. Erstens wird damit ausreichende Aufwärmzeit für die Masse Zytometer erzeugen einen heißen, stabiles Plasma für optimales Signal und minimalen Oxidbildung. Zweitens ausreichendes Waschen der Masse Zytometer mit MilliQ Wasser und DVS Waschlösung (Abbildung 9) wird dazu beitragen, die Niveaus von Metall Adsorption an die Schläuche und andere Teile der Maschine und hilft, Hintergrund während Probenaufnahme reduzieren (Abb. 8). Es wi.......

Diskussion

In den letzten Jahrzehnten hat sich Fluoreszenz-Durchflusszytometrie war ein Arbeitstier Verfahren zur Analyse von einzelnen Zellen, sowohl in Bezug auf Oberflächen-Expression und funktionelle Assays. Allerdings hat die Fragen der spektralen Überlappung der Fluoreszenzfarbstoffe die Anzahl der gleichzeitigen Marker begrenzt. Während Experimente mit mehr als 12 gleichzeitige Marker gemeldet wurden, macht die Höhe der Entschädigung notwendigen dies technisch schwierig.

Statt Fluorophore, Pioni.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
CyTOF TM Masse Zytometer	DVS Sciences
Waschlösung	DVS Sciences	201071	0,05% Flusssäure in Wasser
Tuning-Lösung	DVS Sciences	201072	0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, Spurenelemente Salpetersäure
Eu-haltigen Polystyrol-Kügelchen	DVS Sciences	201073	Enthält natürliche Überfluß Eu Isotopen; Perlen an rund 1 Mio. / ml geliefert
Multi-Lanthanoid-(La / Pr / Tb / Tm / Lu) - Polystyrol-Kügelchen	DVS Sciences	Noch nicht im Handel erhältlichen	Enthält natürliche Überfluß Isotope von börsennotierten Lanthaniden
Salpetersäure (konzentriert)	Fisher Scientific	A467-500	Optima Spur-Metall reinen ICP-MS Grade
Polystyrol mit rundem Boden Rohr mit Zell-Sieb cap-5mL	BD	352235	verwendet werden, um Zellproben vor der Injektion filtern
Norm-Ject Tuberkulin Spritze 1ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	silikonfrei, latexfrei
Norm-Ject Spritze-3 mL	Henke Sass Wolf	4010.000V0	silikonfrei, latexfrei
MilliQ Wasser			18 M reines Wasser, darf nicht in Glas-oder Plastikflaschen, die mit handelsüblichen Waschmittel (wegen ihrer hohen Barium-present) gewaschen wurden gespeichert werden.
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	saures Reinigungsmittel
Argon-Gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99,999% Ultra-hohe Reinheit