Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Peptid: MHC-Tetrameren und magnetische Mikrobeads zur niederfrequenten Populationen von Epitop-spezifischen T-Zellen zu isolieren und zu analysieren durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Untersuchung von endogenen T-Zell-Populationen von Interesse In vivo Experimentellen Systemen.

Zusammenfassung

Eine Grundvoraussetzung für die Forscher studieren adaptiven Immunität in vivo experimentellen Modellen ist die Fähigkeit, T-Zellen auf ihren T-Zell-Antigenrezeptor (TCR)-Spezifität zu identifizieren. Viele indirekte Methoden zur Verfügung, in denen ein Schüttgut Population von T-Zellen in vitro mit einem Antigen und Epitop-spezifischer T-Zellen werden durch die Messung einer funktionalen Antwort wie Proliferation, Zytokinproduktion, oder Expression der Aktivierungsmarker ¹ identifiziert wird angeregt. Jedoch sind diese Methoden nur identifizieren Epitop-spezifischen T-Zellen, die eine von vielen möglichen Funktionen, und sie sind nicht empfindlich genug, um Epitop-spezifischer T-Zellen bei naiven Vorstufe Frequenzen zu detektieren. Eine beliebte Alternative ist die TCR-transgene adoptiven Transfer Modell, in dem monoklonalen T-Zellen aus einem transgenen Maus TCR in histokompatiblen Hosts ausgesät, um eine große Population von Vorläufer-Epitop-spezifische T-Zellen, die easi sein könnenly mit der Verwendung eines kongenen Markerantikörper ^2,3 nachverfolgt. Wenn leistungsfähig leidet dieses Verfahren aus experimentellen Artefakte mit der unphysiologischen Häufigkeit von T-Zellen mit einer Spezifität für ein einzelnes Epitop ^4,5 zugeordnet. Darüber hinaus kann dieses System nicht verwendet, um die funktionelle Heterogenität der Epitop-spezifische T-Zell-Klone in einer polyklonalen Population untersuchen.

Der ideale Weg zur adaptiven Immunität studieren sollte den direkten Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen aus dem endogenen T-Zell-Repertoire mit einer Methode, TCR Aspekt unterscheidet ausschließlich durch dessen Bindung an cognate Peptid: MHC (pMHC)-Komplexe. Die Verwendung von Tetrameren pMHC und Durchflusszytometrie erreicht dieses ^6, jedoch wird auf die Erfassung von hochfrequenten Populationen von Epitop-spezifischer T-Zellen nur gefunden folgenden antigeninduzierte klonale Expansion begrenzt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, die die Verwendung von pMHC Tetramere koordiniert und magnetic Zellanreicherung Technologie, um Erkennung von extrem niederfrequenten Epitop-spezifischer T-Zellen aus der Maus Lymphgewebe ^3,7. Mit dieser Technik kann ein umfassender verfolgen gesamte epitopspezifischen Populationen von endogenen T-Zellen in Mäusen in allen Stadien der Immunantwort.

Protokoll

Ein. Zellisolation von Lymphgewebe

1. 1 ml eiskaltem cEHAA (EHAA + 10% FBS, Pen / Strep, Gentamycin, 2 mM L-Glutamin, 55 mM 2-Mercaptoethanol) oder andere gleichwertige T-Zell-Medium auf eine 60 mm Kulturschale, die ein kleines Quadrat aus 100 mu m Nylon-Mesh und auf Eis stellen.
2. Einschläfern Maus.
3. Entfernen Sie die Milz und so viele leicht zugängliche Lymphknoten wie möglich. Diese sollten mindestens die Leistengegend, Achsel, brachial, Gebärmutterhals-und mesenterialen Lymphknoten. Legen Sie sie auf der Oberseite des Nylon-Mesh in der Kulturschale.
4. Mit der flachen Oberseite eines geschlossenen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das Lymphgewebe sanft Maische über die Nylon-Mesh-Lymphozyten zu befreien. Hinzufügen 1 ml cEHAA angesetzt und nach oben und unten, um Zellen in einer Suspension zu arbeiten. Übertragen der Zellen durch ein anderes Stück Nylon Netzgewebe über der Oberseite einer 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben. Spülen Sie das Geschirr und Mesh mit einem anderen 1 ml eiskaltem cEHAA, poOling die Volumina in das gleiche Rohr. Wiederholen, um einen endgültigen Zellsuspension Volumen von 4 ml zu erreichen.
5. Hinzufügen kalten Sortierer (PBS + 2% FBS, 0,05% Azid) auf ein Endvolumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C
6. Sorgfältig Überstand absaugen und sicherstellen, keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet in Fc-Block (Sorter Puffer + 2.4G2 Antikörper) auf ein Endvolumen gleich ungefähr das Doppelte des Pellets selber. Zum Beispiel können die Milz und Lymphknoten eines naiven Maus erzeugt gewöhnlich eine Zellpellet von etwa 100 ul. In diesem Fall fügen Sie 100 ul Fc-Block, um die Lautstärke zu 200 ul zu bringen. Wenn ein hohes Maß an Zelle Verklumpung aufgetreten ist, entfernen Sie vorsichtig die Zellklumpen an dieser Stelle mit einer Pipettenspitze.

2. Tetramerfärbung

1. Hinzufügen PE-oder APC-markierten Tetramer pMHC zu einer Endkonzentration von 10 nM (oder empirisch optimiert Konzentration).
2. Mix und Gründerzentrente für 1 Stunde bei Raumtemperatur (oder empirisch optimiert Zeit und Temperatur).
3. Hinzufügen kalten Sortierer Puffer auf ein Volumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C Die Proben auf Eis oder bei 4 ° C von nun an.
4. Sorgfältig Überstand absaugen und sicherstellen, keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet im Sortierer-Puffer auf ein Endvolumen von 200 ul. Für Doppel-Tetramer Bereicherung, resuspendieren auf ein Endvolumen von 150 ul.

3. Magnetische Anreicherung

1. Fügen Sie 50 ul Miltenyi anti-PE-oder Anti-APC Mikrokügelchen. Für Doppel-Tetramer Bereicherung, werden 50 ul von beidem.
2. Mischen und inkubieren für 20 min bei 4 ° C.
3. Hinzufügen kalten Sortierer Puffer auf ein Volumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C
4. Während der Wartezeit, die Einrichtung eines Miltenyi LS magnetischen Säule auf einem MidiMACS oder QuadroMACS Magnet. Positionieren Sie eine offene 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen auf einemRack direkt unterhalb der Säule.
5. 3 ml der Sortierer Puffer zu dem oberen Ende der Säule, so dass sie in den 15 ml-Röhrchen abzulassen.
6. Legen Sie eine 100 mu m Nylon-Mesh Quadrat auf der Säule.
7. Wenn die Zellen fertig sind Spinnen, sorgfältig absaugen Überstand und das Pellet in 3 ml Sortierer Puffer.
8. Übertragen der Zellsuspension durch die Nylonnetz auf den Kopf der Kolonne.
9. Wenn der Zellsuspension vollständig in der Säule abgelassen, spült das Originalbild mit einem anderen Rohr 3 ml Puffer Sortierer und übertragen die Puffer durch das Nylonnetz in die Kolonne, Spülen, die Maschen des Prozesses. Entsorgen Sie die Nylon Mesh.
10. Wenn der Puffer in die Säule vollständig entleert, einen weiteren 3 ml Sortierer Puffer auf die Säule.
11. Wiederholen Schritt 10 für insgesamt 3 x 3 ml Wäschen.
12. Entfernen Sie die Säule vom Magneten und sich über einen neuen 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen.
13. 5 ml Sortierer Puffer ter Spalte.
14. Sofort übernehmen den Kolben in den Kopf der Kolonne und in einer kontinuierlichen Bewegung, drücken den Kolben ganz nach unten, wodurch der Puffer aus der Kolonne in die Röhre.
15. Die Röhrchen enthaltend das eluierte gebundenen Fraktion und die Durchströmung ungebundenen Fraktion für 5 min bei 300 × g, 4 ° C
16. Sorgfältig Aspiration des Überstands von der gebundenen Fraktion, wodurch sicher, dass keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet in Sortierer Puffer auf ein Endvolumen von genau 95 ul. Ansaugen und resuspendieren ungebundene Fraktion auf ein Endvolumen von 2 ml.

4. Durchflusszytometrie

1. Für jede Fraktion, entfernen 5 ul und in 200 ul Zählen Wülste (eingestellt auf eine Konzentration von 200.000 / ml in Sortierer Puffer) in einem 5 ml FACS-Röhrchen. Beiseite bei 4 ° C für eine spätere Analyse. Um Zeit zu sparen, können Perlen beschrifteten Röhrchen werden vor dem Beginn des Experiments vor-aliquotiert.
2. Bereiten Uhraster Mischung von Antikörpern zu färben Oberflächenmarker auf den Zellen (Tabelle 1). Um Zeit zu sparen, kann diese vor dem Beginn des Experiments durchgeführt werden.
3. Für die gebundene Fraktion, einen Dosis von Antikörper-Cocktail direkt mit dem ~ 90 ul Zellen in der Röhre. Wenn eine Analyse der ungebundenen Fraktion gewünscht wird, können 90 ul Zellen zu einem 5 ml FACS-Röhrchen und fügen Sie eine Dosis von Antikörper-Cocktail.
4. Einsetzung eines Panels von einfarbigen Entschädigung Kontrollen für das Durchflusszytometer. Für jedes Fluorochrom verwendet werden, mischen 50 ul übriggebliebene ungebundenen Fraktion Zellen in einem 5 ml FACS-Röhrchen mit 1 ul des anti-CD4-Antikörper, konjugiert mit dem entsprechenden Fluorochrom ist. Denken Sie daran, Einrichten eines ungefärbten Kontrolle.
5. Wirbel und inkubieren alle Proben für 30 min bei 4 ° C.
6. 5 ml Sortierer Puffer zu jedem Röhrchen und Zentrifuge 5 min bei 300 × g, 4 ° C
7. Für die gebundene Fraktion, sorgfältig absaugen Überstand und Zellen in 200 ul Sortierer buffer. Übertragen der Zellen in einem 1,2 ml Microtube FACS. Spülen Sie das Rohr mit einem anderen 200 ul Sorter-Puffer und Pool in der gleichen Mikroröhrchen. Wenn Zellklumpen offensichtlich sind, passieren die Zellen durch ein 50 um-Filter.
8. Für die ungebundene Fraktion und Entschädigung Kontrollen, dekantieren oder absaugen Überstand und resuspendieren in 2 ml Sortierer Puffer.
9. Einrichten des Durchflusszytometer unter Verwendung der Single-Farbkompensation Kontrollen. Wählen Seitenstreuung-Breite (SSC-W) als ein zusätzlicher Parameter aufgezeichnet werden.
10. Analysieren der gefärbten Proben unter Verwendung einer Sequenz von aufeinanderfolgenden Aufnahme Gates an CD4 identifizieren + oder CD8 + T-Zellen wie in den 1 und 2 dargestellt. Bei gebundenen Fraktionen, sammeln Sie so viele Zellen wie möglich bis zu einem Maximum von 2.000.000 insgesamt Veranstaltungen. Für ungebundenen Fraktionen sammeln 1.000.000 insgesamt Veranstaltungen. Halten Sie die Akquisition bei oder unterhalb von 3.000 Ereignisse pro Sekunde.
11. Mit den gleichen Geräteeinstellungen, analysieren die Zählung bead Proben. Sammle 10.000 insgesamt Veranstaltungen.
12. Speichern Sie alle Daten, wie FCS-Dateien.

5. Data Analysis

1. Analysieren FCS Datendateien für die Zählung bead Proben mit FlowJo Software. Plot Vorwärtsstreuung von FITC und setzen ein Tor aroung die Zählergebnisse Perlen (siehe Abbildungen 1 und 2). Ermitteln der Gesamtanzahl der Zählung Wülste in jeder Probe detektiert. Subtrahieren von der Gesamtanzahl der erfassten Ereignisse, die Anzahl der gesammelten Ereignisse Zelle zu bestimmen.
2. Berechne die Anzahl aller Zellen in jeder Probe unter Verwendung der Gleichungen, die in Kasten 1 dargelegt.
3. Analysieren FCS-Dateien für den gefärbten gebundenen und ungebundenen Fraktion Proben. Einrichten einer Abfolge von aufeinanderfolgenden Aufnahme Tore zu lymphoiden +, ^{Side-Scatter-Breiten-lo,} dump-, CD3 +, CD4 + oder CD8 +, Tetramer +-T-Zellen in jeder Probe wie in den 1 und 2 dargestellt. Identifizieren
4. Multiplizieren die Gesamtzahl der Zellen in der Probe durch die Frequenzen jedes der Aufnahme-Gatter verwendet werden, um CD4 + definieren Tetramer+ Oder CD8 +-Tetramer +-Zellen, um die Gesamtzahl von Epitop-spezifischen T-Zellen (Kasten 1) zu berechnen.

Ergebnisse

1 zeigt repräsentativ Durchflusszytometrie Parzellen pMHCII Tetramer angereicherten Milz und Lymphknoten-Proben von naiven Mäusen, während 2 zeigt repräsentative Daten für Mäuse zuvor mit dem jeweiligen Peptid + CFA immunisiert. Serielle Gating entfernt Autofluoreszenzlichtbild und andere unerwünschte Ereignisse aus der Analyse der CD4 + T-Zellpopulationen. Die CD8 + T-Zell-Population dient als nützliche interne negative Kontrolle für pMHCII Tetramerfärbung von CD4 + T-Zellen. Beachten ...

Diskussion

Die pMHC Tetramer basierte Anreicherung von Zellen-Methode von diesem Protokoll vorgestellt ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium Epitop-spezifischer T-Zellen aus körpereigenen T-Zellen Repertoires. Die Verwendung von Tetrameren pMHC ermöglicht Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen direkt auf die Fähigkeit ihrer TCRs auf artverwandten pMHC Liganden binden. Die Anreicherung stellt einen Grad der Empfindlichkeit derart, dass extrem selten Populationen von Antigen-spezifischen T-Zellen aus endogenen Repertoires...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagent Hersteller Katalog-Nummer
PE oder APC konjugierten pMHC Tetramer (oder Multimer)	By Ermittler Made, erhalten aus der NIH Tetramer Kern oder gekauft aus kommerziellen Quellen
Anti-PE konjugierte magnetische Mikrobeads	Miltenyi	130-048-801
Anti-APC konjugierten magnetischen Mikrokügelchen	Miltenyi	130-090-855
LS magnetischen Säulen	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS oder QuadroMACS Magneten	Miltenyi	130-042-302 oder 130-090-976
Zellzählung Perlen	Life Technologies	PCB-100