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Methodenartikel

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in

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DOI:

10.3791/4443

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22. Dezember 2012

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1Department of Biological Sciences and Institute for Neuroscience, George Washington University, 2Fred Hutchinson Cancer Research Center, 3Department of Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine molekulare Auslesen der langfristigen olfaktorische Anpassung Caenorhabditis elegans. Die Protein Kinase G, EGL-4, ist für einen stabilen Anpassungsmaßnahmen im primären sensorischen Neuronen Paar genannt AWC. Bei längerem Geruch Exposition EGL-4 transloziert aus dem Cytosol an Kern der AWC.

Zusammenfassung

Während anhaltende Stimulation meisten sensorischen Neuronen wird ihre Reaktion durch eine Verringerung ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem Signal anzupassen. Die Anpassung Resonanz hilft Form Aufmerksamkeit und schützt die Zellen vor Reizüberflutung. Anpassung innerhalb des olfaktorischen Schaltung C. elegans wurde zuerst von Colbert und Bargmann 1,2 beschrieben. Hier haben die Autoren Parameter der olfaktorischen Adaption Paradigma, das sie verwendet, um einen genetischen Screen entwerfen zu isolieren Mutanten in ihrer Fähigkeit, an flüchtigen Gerüchen, erfasst durch den Amphid Flügel Zellen Typ C (AWC) sensorischen Neuronen anzupassen definiert. Wenn Wildtyp C. elegans Tiere werden zu einem attraktiven AWC-spürte Geruch 3 für 30 min ihre Reaktionsfähigkeit auf den Geruch wird anzupassen ausgesetzt und ignoriert dann die Anpassung Geruch in einem Chemotaxis Verhaltens Assay für ~ 1 Stunde. Wenn Wildtyp C. elegans Tiere werden zu einem attraktiven AWC-spürte Geruch für ~ 1 Stunde ausgesetzt werden sie dann ignorieren Sie die Anpassung Geruch in achemotaxis Verhaltens Assay für ~ 3 Std. Diese beiden Phasen der olfaktorischen Anpassung in C. elegans wurden als kurzfristige olfaktorische Adaption (induziert nach 30 min Geruch Belichtung) und langfristige olfaktorischen Adaption (induziert nach 60 min Geruch Exposition) beschrieben. Später von L'Etoile et al. Arbeiten, freigelegt 4 ein Protein Kinase G (PKG) genannt EGL-4, die sowohl für die kurz-und langfristigen olfaktorische Anpassung AWC Neuronen benötigt wird. Die EGL-4-Protein enthält eine Kernlokalisierungssequenz, die zur langfristigen olfaktorischen Anpassungsmaßnahmen aber entbehrlich für kurzfristige olfaktorischen Adaption Reaktionen im AWC 4 ist. Durch die Kennzeichnung EGL-4 mit einem grün fluoreszierenden Protein, war es möglich, die Lokalisation von EGL-4 im AWC bei längerer Exposition Geruch zu visualisieren. Mit diesen vollständig funktionellen GFP-markierten EGL-4 (GFP :: EGL-4)-Molekül ist es uns gelungen, eine molekulare Auslesen langfristige olfaktorischen Adaption im AWC 5 zu entwickeln. Mit dieser molecular Auslesen der olfaktorischen Anpassung konnten wir sowohl vorwärts und rückwärts genetischen Screens durchführen, um mutierte Tiere, die defekte subzelluläre Lokalisation Muster der GFP :: EGL-4 weisen in der AWC 6,7 identifizieren. Hier beschreiben wir: 1) die Konstruktion von GFP :: EGL-4 Ausdruck Tieren; 2) das Protokoll für den Anbau von Tieren für die langfristige geruchs-induzierte nukleäre Translokation Assays, und 3) die Wertung der langfristigen geruchs-induzierte Kerntranslokation Event-und Recovery-(Re-Sensibilisierung) aus der nuklearen GFP :: EGL-4 Zustand.

Protokoll

Ein. Bau der GFP Tagged EGL-4 Ausdruck Tiere

  1. Klonen die translationale Fusion GFP :: EGL-4 unter dem Promotor für das odr-3-Gens (2678 bp Gebrauch unmittelbar vor dem Startkodon): (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4. Die odr-3-Promotor-Laufwerke Ausdruck in den amphid Neuron Paare: AWA, AWB, AWC und schwach ASH.
  2. Injizieren das Plasmid (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4 in Wildtyp (N2) Tiere bei 50 ng / ul mit den Co-Injektion unter Verwendung von Standard-Marker Keimbahn-Transformationstechniken 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / ul) und (p) odr-1 :: dsRed 10 (25 ng / ul). Die odr-1-Promotor-Laufwerke Ausdruck in der AWC und AWB amphid Neuron Paaren, und die OFM-1-Promotor-Laufwerke Ausdruck in den coelomocytes.
  3. Betreff Die transgenen Tiere exprimieren die extrachromosomale Arrays in Schritt 1,2 bis Ultra Violet (UV) / trimethylpsoralen (TMP) Integration-Protokoll detailliert11.
  4. Bleach synchronisiert die Tiere 12 und kultivieren sie auf Nematode Growth Media (NGM) Platten mit OP50 E. coli auf die L4-Stadium. Waschen L4 Tiere von NGM-Platten mit M9 Puffer OP50 E. entfernen coli-Bakterien.
  5. Entfernen M9-Puffer und fügen 50-100 ul von 30 ug / ml TMP arbeitet Lösung auf dem Wurm Pellet in der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wickeln Sie den 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in Folie Umgebungslicht blockieren und leicht bewegen auf einem Rotator für 15 min in der Folie verpackte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Übertragen Sie die Würmer in der TMP / Wurm-Lösung zu einem großen ungesetzte NGM Platte.
  6. Setzen Sie die Würmer auf dem NGM Platte UV 350 uJ (X100) mit einem Stratalinker 2400. Dann fügen Würmern zu einem OP50 mit NGM Platte und inkubieren im Dunkeln für 5 Std.
  7. Pick-50 transgenen Würmer etwa 10 gesetzten Platten (2-5 Würmern jede Platte). Transfer P0 ist auf neue Platten alle 24 Stunden für 3 Tage.
  8. Pick-250 klonale F1 einnimals (1 Tier pro Platte). Klonen von 2-4 F2 Tiere aus jeder F1 Platte. Prüfen F3 Tiere für eine 100% Übertragungsleitung durch suchen (p) ofm-1 :: GFP Expressionsmuster unter einem Präpariermikroskop Fluoreszenzmikroskop aussehen.
  9. Outcross die endgültige integrierte Linie (n) mit Wildtyp N2 Tieren 5 mal. Wir werden auf die endgültige integrierte Linie als pyIs500 beziehen, und die GFP-markierten EGL-4-Molekül als GFP :: EGL-4.

2. Anbau und Pflege der Tiere für nukleare Translokation Assays

  1. Kultivieren die pyIs500 Tieren bei 25 ° C auf Standard 10 cm NGM-Platten (siehe unten für Rezept) seeded mit OP50 E. coli-Bakterien 13 (Abbildung 1).
  2. Am Tag 1, Pick vier vor fünf L4 pyIs500 Tiere aus Platten bei 25 ° C kultiviert auf fünf separaten 10 cm OP50 E. coli ausgesät Platten und Inkubation bei 25 ° C (dh 4-5 L4 Tieren pro Platte).
  3. Am Tag 4, waschen erwachsenen populations der pyIs500 Tieren abseits der großen NGM-Platten mit S-Basal-Puffer (siehe unten Rezept). Verwenden Sie Einweg-Glas-Pipetten auf Tiere zu übertragen, da sie an der Seite des Kunststoff-Pipettenspitzen haften.

3. Langfristige Geruch Induced Nuclear Translokation Assays

  1. Waschen Sie die pyIs500 Tieren 3 mal in S-Basal, um Bakterien zu entfernen. Nicht zentrifugieren Tiere zwischen Wäschen, sondern dass die Tiere durch die Schwerkraft in einer stationären 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen begleichen. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass alle Bakterien entfernt wird, und dass die NGM Pasteten sind frei von Verunreinigungen, wie Restbakterien wird sich negativ auf das Ergebnis der Translokation Assay. Außerdem haben wir gefunden, dass die Autoklavierung 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen erzeugt einen "sticky"-Eigenschaft auf die Innenwände der Röhre, die Tiere bewirkt, dass an den Seiten haften und so verwenden nicht-autoklavierter 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Während Tiere zwischen Wäschen Abwicklung, Make-up tEr Adaption Lösung. 100 ml S-Basal-Puffer in einem 100 ml Zylinder graduiert. Hinzufügen Anpassung Geruch an die S-Basal und Abdichtung des Zylinders mit einem Streifen Parafilm. Bei Durchführung Benzaldehyd Anpassung hinzuzufügen 7,5 ul von Benzaldehyd in 100 ml S-Basal für Butanon Adaption fügen 11 ul von 2-butaone zu 100 ml S-Basal. Vorsichtig umdrehen (nicht schütteln) die Abschluss Zylinder mit S-Basal und Geruch 30 Mal um eine gleichmäßige Emulsion zu schaffen.
  3. Nach dem letzten Waschen in S-Basal, damit die Tiere sich niederzulassen und entfernen Sie alle Flüssigkeit. Label ein tube "+ ve" oder "Anpassung" und das andere Rohr "-ve" oder "unadapt". Dann fügen Sie 1 ml der Anpassung Mix der Anpassung Mikrozentrifugenröhrchen (+ ve) und 1 ml S-Basal der unangepassten Kontrolle Mikrozentrifugenröhrchen (-ve). Versuchen, die Anzahl der Tiere zwischen 100 und 200 in jeder Röhre zu halten. Mit einigen der Praxis ist es möglich, den ungefähren Anzahl von Tieren in einem Pellet schätzen, indem Auge.
  4. Legen Sie eine 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen cap protectorZu jedem Röhrchen (verhindert Deckel aus knallen offen) und platzieren Sie die Rohre auf einem Rotator für 80 min. Wir haben festgestellt, dass Geruch Belichtung zwischen 60 min und 80 min zu ähnlichen Ergebnissen (sowohl aufgrund der langfristigen Anpassungsmaßnahmen) ergibt. Allerdings bietet 80 min Exposition konsistentere Ergebnisse in unseren Händen. So sind alle unsere langfristige Anpassung Assays standardisiert sind durch die Verwendung eines 80 min Geruch Exposition (Abbildung 2).
  5. Nach 80 min, waschen Tieren 3 mal in S-Basal. Damit sich die Tiere durch die Schwerkraft zwischen jedem Waschgang zu begleichen.

4. Kurzfristige Odor-induzierten nukleären Translokation von Assays

  1. Im Falle von kurzfristigen Geruch Anpassung, das gleiche Protokoll nach langfristigen geruchs-induzierte Translokation Assays (Schritte 3.1-3.4), jedoch anstelle der Inkubation der pyIs500 Tieren bei der Anpassung Geruch für 80 min, verwenden Sie eine Exposition von 30 Minuten . Die Quantifizierung von Geruchs-induzierte Kerntranslokation unten beschriebenen Assays (Schritt 5) die gleiche ist für eine langfristige und kurzfristige term Expositionen.

5. Scoring der Geruch-induzierten nukleären Translokation Ereignis

  1. Make 2% Agarose Pads enthaltend 5 mM Natriumazid (NaN 3) durch Lösen Agarose-Gelelektrophorese in dH 2 0. Legen Sie eine einzelne Tropfen geschmolzenen Agarose mit NaN 3 auf einem Glasobjektträger. Unmittelbar legen Sie ein weiteres Glasobjektträger auf der ersten Folie, um die Tropfen geschmolzenen Agarose glätten. Hinterlegen für 30 sec, und dann sanft necken abgesehen die Objektträger Ausfahrt aus einer Mikroskop-Objektträger mit einer flachen Agarose Pad von ~ 1 mm.
  2. Nach dem letzten Waschen in S-Basal, damit die Würmer in der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen niederlassen und entfernen Sie alle Flüssigkeit. Dann fügen Sie die Tiere tropfenweise auf die Agarose Pads von mehreren Objektträgern. Es ist wichtig, die Anzahl der Tiere pro Folie zwischen 50 und 100 halten. Zu viele Tiere pro Folie wird komplizierter Scoring und oft eine Streuung glow nach Blaulicht-Anregung. Überschüssige Flüssigkeit kannböse sein aus der Agarose-Pad mit einem kleinen Kim-wischen. Legen Sie eine 0,5 mm Glas Deckglas auf dem Pad und stehen lassen für 2 min für die NaN 3 zu ermöglichen, um die Tiere zu fixieren. Beachten Sie, können Tiere aus den Folien nach Scoring wiederhergestellt werden. Die Tiere werden aus dem NaN 3 Anästhesie nach ~ 1 Stunde wiederherstellen, wenn ein seeded NGM Platte in einem Tropfen M9 Puffer übertragen.
  3. An dieser Stelle ist es zwingend erforderlich, dass jeder Experimentator eine Schlüsselrolle zu verfolgen, welche Rutsche die experimentelle (+ ve) Folie ist und die Folie ist die Steuerung (-ve) slide entwickeln, und übergeben Sie die Folien an eine andere Person, die blind punkten wird die GFP: EGL-4 Lokalisation Muster. Dies wird für jede Experimentator Vorspannung zu steuern.
  4. Bewertung zwischen 50 und 100 Tieren pro Folie unter Verwendung eines aufrechten Fluoreszenzmikroskop mit 10X, 40X und 63X vergrößernden Objektiven und GFP / RFP Filter. Erstens, suchen Tiere unter 10X Vergrößerung mit Hellfeldbeleuchtung. Zweitens, suchen Sie die AWC Neuron durch Ausschalten des bright-Beleuchtung und mit dem RFP-Filter. Die (p) odr-1 :: dsRed Laufwerken Ausdruck in AWB und AWC Neuronen. Die AWC Neuronen haben ausgeprägte ovale Zellkörper wie mit AWB Zellkörpern, die kleiner und kreisförmig sind (Abbildung 2).
  5. Sobald die AWC Zellkörper gefunden wurde, dem GFP-Filter einschalten und notieren Sie die Lokalisierung von GFP: EGL-4 als Kern-oder zytoplasmatisch. Verwendung eines Zählers kann der Experimentator zu halten suchen in das Okular während Scoring die Folie. Anmerkung: Schritte 5,1-5,5 sind mindestens 3-mal auf verschiedenen Tagen wiederholt, um statistisch signifikante Daten (Fig. 1-2) zu erzeugen.

6. Die Überwachung EGL-4 während der Erholung von Langzeit-Geruch Anpassung GFP-markierten

  1. Nach Schritt 3,5, teilen die Bevölkerung pyIs500 Tieren in mehrere Aliquots und Gäste für nukleare gegenüber zytoplasmatische GFP :: EGL-4 in der AWC zum Zeitpunkt Null (dh nach 80 min Exposition) und multiple nachfolgenden Zeitpunkten (Abbildung 3).
  2. Übertragen sowohl die Steuerung (-ve) und experimentelle (+ ve) Tieren mit Einweg-Glas-Pipetten auf NGM-Platten.
  3. Damit sich die Tiere für verschiedene Zeitspannen erholen und erneut zu prüfen, die Lokalisierung von GFP :: EGL-4in AWC zu jedem Zeitpunkt wie in den Schritten von 5,1 bis 5,5.

7. Materialien

NGM-Platten:; 3 g Natriumchlorid (NaCl), 2,5 g Bacto-Pepton 21 g Bacto-Agar: Für 1 L 1 L ddH 2 0 hinzuzufügen. Autoclave Media. Nach dem Autoklavieren, kühlen den Agar, bis die Temperatur liest 54 ° C. Fügen Sie die folgenden Lösungen: 25 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer, 1 ml 1 M Magnesiumsulfat (MgSO 4), 1 ml 1 M Calciumchlorid (CaCl 2), 1 ml Cholesterin in Ethanol (5 mg / ml Stammlösung).

1 M Dibasic K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Für 500 ml: In 400 ml ddH 2 O löst man 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Lautstärke auf 500 L mit ddH 2 O. Filtern sterilisieren mit einem 500 ml Sterile Filter Unit.

1 M Einbasisches KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Für 1 L: In 800 ml ddH 2 O löst 136,1 g Einbasisches KH 2 PO 4. Lautstärke auf 1 l mit ddH 2 O. Filtern sterilisieren mit einem 500 ml Sterile Filter Unit.

1 M Kaliumphosphat (K 3 PO 4) Puffer pH 6,0: Für 1 L: In einem 1 L Sterile Filter Unit, fügen Sie 868 ml von 1 M Einbasisches KH 2 PO 4. Lassen Sie das Gerät filtern durch, dann fügen Sie 132 ml von 1 M Dibasic K 2 HPO 4. Lassen Sie das Gerät, um alle Flüssigkeit zu filtern. Filter entfernen Gerät und pH-Wert auf 6,0. Lagerung bei Raumtemperatur.

S-Basal: Für 1 L: 50 ml 1M K 3 PO 4-Puffer, pH ~ 6,0, und 20 ml 5M NaCl aq. Füllen auf 1 l mitddH 2 O. Autoklavieren Solution.

M9: Für 1 L: 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O. Füllen auf 1 l mit ddH 2 0. Sterilisieren durch Autoklavieren.

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Ergebnisse

Ein Beispiel für die Lokalisierung von GFP :: Muster EGL-4in der AWC vor und nach längerer Exposition Geruch ist in Abbildung 2 gezeigt. Vor verlängerte Geruch Belichtung GFP :: EGL-4 wird in das Cytosol der AWC (2B) lokalisiert, und nach 80 min Geruch Exposition GFP :: EGL-4 ist mit dem Kern der AWC (2D) lokalisiert. Auf der Verhaltensebene werden die Tiere mit zytosolischen GFP :: EGL-4 in AWC zu einer punktförmigen Quelle des Geruchs (- beachten Sie die Chemotaxis In...

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Diskussion

Der Geruch nukleärer Eingabe eines GFP-markierten EGL-4-Molekül hier beschriebenen bietet eine robuste molekulare Auslesen der olfaktorischen Anpassung in C. elegans. Die Geruchs-induzierte nukleäre Translokation Assays sind einfach und erfordern nur ein paar Tage Vorbereitungszeit. Die pyIs500 Tier, das wir für diese Assays aufgebaut haben, drückt eine Markierung, die die AWC Neuron als auch als Ausdruck der GFP-markierten EGL-4-Protein leuchtet. So fühlen wir, dass ein Experimentator mit wenig bis ga...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Wir möchten Scott Hamilton, und die Mitglieder der O'Halloran Labor für sorgfältige Lektüre des Manuskripts danken. Wir danken auch unseren anonymen Gutachter für gute Vorschläge und aufschlussreiche Kommentare.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
Bacto Agar Difco DF0140-07-4 NGM-Platten
Kochsalz Fisher Chemical S671-10 NGM-Platten
Bacto Pepton Difco DF0118-07-2 NGM-Platten
Kaliumphosphat Dibasic Fisher Chemical S375-500 S-Basal-Puffer und NGM-Platten
Kalium monobasisches Fisher Chemical P285-500 S-Basal-Puffer und NGM-Platten
Kimwipes - Small Kimberly-Clark LS2770
Ethanol 100% Gold Shield ChemicalCo. 43196-115 Verdünnen Gerüche für Chemotaxis-Assays
Kalziumchlorid Sigma-Aldrich C8106-500G NGM-Platten
Magnesiumsulfat MP Biomedicals 150.136-500G NGM-Platten
Natriumazid 99% Fisher Scientific ICN10289180 Narkose
Agarose - UltraPure Invitrogen 16500-500 Agarose-Pads
Benzaldehyd Sigma-Aldrich B1334-100G AWC Geruch
Butanon, ACS Grade Sigma-Aldrich 360.473-500ML AWC Geruch
Reaktionsgefäße - 1,5 ml Colored Denville LS8147
Pasteur Pipette Einweg Glas 5-3/4 " Fisher Scientific 13-678-20B
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 UV-Integration
Filter Vacuum Bottle - 500 ml Nalgene 09-740-25B

Referenzen

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