Ektopische Expression ist eine Technik, um die microRNAs Rolle in der Entwicklung des Gehirns aufzuklären. , Für bestimmte Bereiche mit in ovo Elektroporation ist jedoch eine Herausforderung. Hier zeigen wir einen effizienten Weg, um selektiv elektroporieren ventrale und dorsale Mittelhirn Regionen.
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Methodenartikel
In ovo Expression von microRNA in ventralen Mittelhirn-Küken
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Nicht-kodierende RNAs sind weitere Spieler in der Regulation der Genexpression. In ovo Elektroporation von bestimmten Bereichen Gezielte bietet ein einzigartiges Werkzeug für die räumliche und zeitliche Kontrolle der Eileiter microRNA Expression. Allerdings sind ventralen Hirnstrukturen wie ventralen Mittelhirn ziemlich schwierig, für alle Manipulationen zu erreichen. Hier zeigen wir, eine effiziente Möglichkeit zum ventralen Mittelhirn miRNA in elektroporieren mit dünnen Platinelektroden. Dieses Verfahren bietet einen zuverlässigen Weg, um bestimmte Bereiche des Mittelhirns und nützliches Werkzeug für In-vivo-Studien zu transfizieren.
Einleitung
Die Anerkennung der kleine nicht-kodierende RNAs als zusätzliche Spieler für die Genexpression eine neue Komplexität, um genomische Programmierung / Genregulation. Verschiedene Arten von nicht-kodierenden RNAs funktionelle Bedeutung in neuronalen Zellen, einschließlich der kleinen nicht-kodierenden RNAs 1-4. MicroRNAs (miR-oder miRNA) zeigen beispielsweise verschiedene und wechselnde Expressionsprofile in die Entwicklung des Gehirns 5. In ovo Elektroporation von Hühnerembryonen Gezielte bietet eine einzigartige Gelegenheit für zeitliche und räumliche Steuerung der Genexpression und der Silencing während der Entwicklung.
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Protokoll
1. Voraussetzungen für die In-ovo Elektroporation
- Vorbereiten des Vektorkonstrukt: miR Sense und Antisense-Primer wurden nach den Anweisungen des Ambion entworfen, geglüht und in ligiert ApaI / EcoRI verdaut pSilencer U6.1 Vektor. Nach einer erfolgreichen Transformation der erhaltenen Klone wurde angebaut und pSilencer Plasmid wurde durch alkalische Lyse isoliert mit einem Quiagen Midi Vorbereitung Kit.
- Elektroden: Die Elektroden können gekauft werden oder einfach gebaut 13 werden. Wir verwenden selbstgemachte Elektroden aus Platindraht (Φ = 0,2, 0,25 oder 0,5 mm Durchmesser) oder in einigen F....
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Ergebnisse
Der Umfang des Mittelhirns Bereich mit miR transfiziert ist durch die Expression von GFP aus einem Reportervektor zusammen mit der miR-Expressionsvektor (Abbildung 2) eingespritzt wird sichtbar. Verwendung von Platinelektroden mit einem Durchmesser von 0,5 mm und parallel zur Transfektion eines breiten Bereich entlang der DV-und AP-Achse, einschließlich Hinterhirn, Mittelhirn und Zwischenhirn manchmal (2A und B) angeordnet, um die AP-Achse des Mittelhirns führt normalerweise. Die Größe .......
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Diskussion
Dieses Video zeigt eine effektive Methode, um das Plasmid in die Neuroepithelzellen von bestimmten Bereichen des Mittelhirns Küken transfizieren. Rechteckige elektrische Impulse von Niederspannungs können DNA in Zellen der Küken Neuralrohr in ovo 6,16 einzuführen. Jedoch ist die Genauigkeit der DNA-Targeting oft durch die breiten elektrischen Feldes, das durch den relativ großen Elektroden (Φ = 0,5 mm) steigt behindert. Wir haben versucht, dieses Problem durch Verwendung von Elektroden im Durchmesser.......
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir erkennen K. Mikic, der auf die Anfangsphase des Films und M. Nicolescu für die miR-Bild beigetragen. C. Huber wurde von einer Gemeinschaft des IZKF der Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand von der Fortune-Programm der Universtitätsklinikum Tübingen unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Borosilcat-Glaskapillaren | Hartenstein | Modell: 0,9 mm | |
| Mikrokapillarabzieher | WPI, Berlin | Modell: Pul1-E | |
| Elektroporator | Intracel | Modell: TSSIC | |
| Stereomikroskop - Fluoreszenz | LEICA | Modell: MZFLIII | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Modell: Stemi | |
| Kamera und Software | Zeiss | Modell: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
Referenzen
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18....
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Nachdrucke und Genehmigungen
