In ovo Expression von microRNA in ventralen Mittelhirn-Küken

Zusammenfassung

Ektopische Expression ist eine Technik, um die microRNAs Rolle in der Entwicklung des Gehirns aufzuklären. , Für bestimmte Bereiche mit in ovo Elektroporation ist jedoch eine Herausforderung. Hier zeigen wir einen effizienten Weg, um selektiv elektroporieren ventrale und dorsale Mittelhirn Regionen.

Zusammenfassung

Nicht-kodierende RNAs sind weitere Spieler in der Regulation der Genexpression. In ovo Elektroporation von bestimmten Bereichen Gezielte bietet ein einzigartiges Werkzeug für die räumliche und zeitliche Kontrolle der Eileiter microRNA Expression. Allerdings sind ventralen Hirnstrukturen wie ventralen Mittelhirn ziemlich schwierig, für alle Manipulationen zu erreichen. Hier zeigen wir, eine effiziente Möglichkeit zum ventralen Mittelhirn miRNA in elektroporieren mit dünnen Platinelektroden. Dieses Verfahren bietet einen zuverlässigen Weg, um bestimmte Bereiche des Mittelhirns und nützliches Werkzeug für In-vivo-Studien zu transfizieren.

Einleitung

Die Anerkennung der kleine nicht-kodierende RNAs als zusätzliche Spieler für die Genexpression eine neue Komplexität, um genomische Programmierung / Genregulation. Verschiedene Arten von nicht-kodierenden RNAs funktionelle Bedeutung in neuronalen Zellen, einschließlich der kleinen nicht-kodierenden RNAs ^1-4. MicroRNAs (miR-oder miRNA) zeigen beispielsweise verschiedene und wechselnde Expressionsprofile in die Entwicklung des Gehirns ^5. In ovo Elektroporation von Hühnerembryonen Gezielte bietet eine einzigartige Gelegenheit für zeitliche und räumliche Steuerung der Genexpression und der Silencing während der Entwicklung.

Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte der Durchführung ektopische Expression von miRs in bestimmten Bereichen des Mittelhirns mit Küken in ovo Elektroporation ^10.06. Um eine dauerhafte Wirkung dieser kleinen nicht-kodierenden RNAs in den Zellen zu gewährleisten, wurden die DNA-Sequenz miRs in mono-oder bi-cistronischen Vektoren kloniert. Für die in-ovo Elektroporation, miR enthält vector in das Mittelhirn Neuralrohr, indem die Embryos nach einem kleinen Fenster in der Eierschale injiziert. Bestimmte Bereiche des Mittelhirns kleine Plus (Anode) und minus (Kathode) zu transfizieren Platinelektroden werden an bestimmten Positionen angeordnet. Zur ventralen Mittelhirn Transfektion wird die Anode unter dem ventralen Mittelhirn linken und der Kathode über der rechten Hälfte des Mittelhirns vor dem Anlegen eines Stroms angeordnet. Die Öffnung in der Eierschale ist mit Klebeband geschlossen und Embryonen werden, solange für jede Analyse erforderlich inkubiert. Dieses Verfahren wurde ursprünglich von Muramatsu et al. ⁶ beschrieben und Momose et al. ⁸ zum spezifischen Bereich der Transfektion verbessert.

Schematische Übersicht.

1. Der Embryo im Ei wird durch Schneiden ein kleines Fenster in th ausgesetzte Eierschale.
2. Das gelöste Vektor (en) in das Mittelhirn unter Verwendung einer Mikrokapillare injiziert.
3. Zwei Elektroden - parallel oder unter und über dem Embryo gelegt - erzeugen einen gepulsten elektrischen Feld.
4. Das elektrische Feld zeitlich erzeugt Poren in der Zellmembran, die den Eintritt in die Zelle durch die negativ geladene DNA (oder RNA) zu erleichtern zogen Anode ^11,12.

Protokoll

1. Voraussetzungen für die In-ovo Elektroporation

1. Vorbereiten des Vektorkonstrukt: miR Sense und Antisense-Primer wurden nach den Anweisungen des Ambion entworfen, geglüht und in ligiert ApaI / EcoRI verdaut pSilencer U6.1 Vektor. Nach einer erfolgreichen Transformation der erhaltenen Klone wurde angebaut und pSilencer Plasmid wurde durch alkalische Lyse isoliert mit einem Quiagen Midi Vorbereitung Kit.
2. Elektroden: Die Elektroden können gekauft werden oder einfach gebaut ¹³ werden. Wir verwenden selbstgemachte Elektroden aus Platindraht (Φ = 0,2, 0,25 oder 0,5 mm Durchmesser) oder in einigen Fällen eine noch kleinere Wolframdrahtelektrode (Φ = 0,1 mm) ⁸ je nachdem, welchen Bereich wir elektroporieren möchten. Ein Versengen des Gewebes zu vermeiden, in der Regel verwendet man je näher an das Gewebe je dünner die Elektroden. Für breite Elektroporation von Mittelhirn, verwenden wir 0,5 mm Platindrähte mit einem Messing / Edelstahl-Rohr gelötetWelle und einen Elektrodenhalter mit einem Abstand von 3-5 mm (Fig. 1) befestigt. Bestimmte Bereiche Elektroporation, verwenden wir 0,25 mm Platindraht Anoden und 0,2 mm Platindraht oder 0,1 mm Wolfram für die Kathode mit einem ungefähren Abstand von 1 mm oder weniger.
3. Lösungen: Sind die folgenden Lösungen bereit:
   1. Autoklavierte Huhn Ringer, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g KCl, 0,24 g CaCl2, lösen sich in 1 L destilliertem Wasser).
   2. PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,24 g KH ₂ PO 4, 1,44 g Na ₂ HPO _4, lösen sich in 1 Liter destilliertem H ₂ O).
   3. Fast Green: Stammlösung 10 mg / ml destilliertem H ₂ O
   4. Langsam trocknende Tinte (weniger Schellack und damit weniger Vergiftung für den Embryo). Hinweis: Eine blaue dichroitische Filter auf ein Glasfaserlampe befestigt, wie in Canto-Soler und Adler ¹⁴ beschrieben wird der Kontrast und die Notwendigkeit beseitigen, um Tinte zu injizieren.

Fig. 1 ist. Schematische Darstellung der Elektroden und Elektrodenhalter. (A, B, C) ​​Platindraht wurde auf eine Seite eines Edelstahlrohrwelle verlötet. Ein Loch wurde in die andere Seite der Rohrwelle gebohrt so dass Pin Stecker können fit in. (A) Rot und Blau farbigen Drähte wurden an die Pin-Stecker verbunden. Am anderen Ende wurde der Draht zu Bananenstecker, die mit den Steckdosen der Elektroporator arbeiten ausgestattet. (A, C) Der Platindraht wurde in einen Engel von 90 ° gebogen. Eine Schicht Nagellack isoliert die Welle über der Kurve.

2. Vorbereitungen unmittelbar vor In-ovo Elektroporation

1. Bereiten Sie das folgende Material:
   1. Verdünnte Tinte mit Huhn Ringer 01.06, fügen Antibiotika-Antimykotika-Lösung (100x von GIBCo) 1:100.
   2. Bereiten Vektorlösung: 1-2 ug / ul pro spezifische DNA in H ₂ O mit Fast Green (1:20) ergänzt.
   3. Sterilisieren Zangen, Scheren, Nadelwolframelektroden und mit 70% Ethanol.
   4. Ziehen Mikropipetten für die Nukleinsäure-Injektion aus Borosilikatglas Kapillaren (Länge zu Außendurchmesser: 100 mm x 0,9 mm). Wir verwenden eine einfache Abzieher PUL-1 (WPI, Berlin) mit den in Tabelle 1 gezeigten Einstellungen.
   5. Die Parameter des Elektroporators wie in Tabelle 2 gezeigt.

Parameter	Werte
Wärme	350
Ziehen	100
Geschwindigkeit	50
Verzögerung	200

Tabelle 1. Einstellungen für die PUL-1

Parameter	Werte
Frequenz	50 Hz
Verzögerung	20-50 ms *
Breite	20 msec
Spannung	8-25 V *
Puls	3-5 mal
* Je nach Elektrodendurchmesser und Entfernung. Bittemit berücksichtigen bei der Änderung einer der Parameter.

Tabelle 2. Einstellungen für den Impuls Stimulator

2. Bereiten Hühnerembryonen für die Elektroporation:
   1. Befruchteten Hühnereiern auf ihre längere Seite Inkubation bei 37 ° C mit 65% Luftfeuchtigkeit für 39 Stunden, Embryonen zwischen Hamburger & Hamilton (HH) erwerben Stufen ¹⁵ 9-11. Der Embryo setzt sich am obersten Teil des Eies, so sollten Sie es mit einem Bleistiftstrich markieren.
   2. Desinfizieren Sie die Eier mit 70% Ethanol.
   3. Durchbohren das Ei an der breiteren Seite, wo die Luft Hohlraum sein sollte.
   4. Entfernen Sie 1-2 ml Eiweiß. Dadurch wird der Embryo aus der Eierschale lösen.
   5. Cello-Band der Eierschale zu Granatsplitter fallen auf den Embryo zu vermeiden. Verwenden Sie eine Schere, um ein kleines Fenster in der Eierschale auf der Bleistiftlinie geschnitten.
   6. Spritzen Sie ein bisschen Tinteunter dem Bereich opaca, um den Embryo zu visualisieren.
   7. Machen Sie einen Schnitt in die Dotterhaut mit einem geschärften Wolfram-Nadel, um eine bessere Zugänglichkeit des Embryos für die Nukleinsäure-Injektion und Elektroporation zu erreichen.

3. Elektroporation und Inkubation

1. Fügen Sie ein paar Tropfen warmen Ringer-Lösung auf die Embryonen. Dadurch werden die Embryonen zu senken, eine Überhitzung zu vermeiden, Verkleben der Elektroden an das Gewebe und ein Medium für den Strom zwischen den beiden Elektroden.
2. Spritzen Sie die Vektorlösung in das Lumen des Neuralrohrs in Mittelhirn-Ebene. Wenn Ihr DNA-Expressionsvektor keine Reporter-Gen (zB EGFP) enthält, fügen Sie ein etwas niedriger konzentrierten Reportergenvektor (1 ug / ul miR-Expressionsvektor zu 0,9 ug / ul Reportergenvektor) zu der DNA-Lösung. Dadurch wird sichergestellt, dass Sie transfizierten Zellen später ⁸ zu erkennen. Wir nutzen die so genannte pCAX Vektor, eine Art Geschenk herm C ¹³ Krull.
3. Für ein breites Transfektion des Mittelhirns, legen Sie die links Elektroden und des Embryos auf der Höhe des Mittelhirns. Der Abstand zwischen den Elektroden sollte etwa 3-5 mm betragen. Die anderen Einstellungen sind 15V, 20 ms und 50 ms Impulse Verzögerung für HH 10. Ändern der Position der beiden Elektroden leicht entlang der dorso-ventralen (DV) Achse des Mittelhirns sichert eine eine breite Transfektion von Zellen der DV Achse Transfektion.
4. Für ventralen Transfektion, fügen Sie einige Ringer, um den Kopf aus der Dottermembran zu erhöhen und legen Sie die Anode unter ventralen Mittelhirn. Wenn der Kopf nicht steigen drücken Sie die Elektrode unter der Membran, die Dotter und Embryo trennt, um der sengenden Neuralrohr zu vermeiden. Die Kathode sollte über dem Mittelhirn dorso-lateral gegenüber der Anode angeordnet werden. Berühren Sie nicht das Neuralrohr. Wir Transfektion der linken ventralen Hälfte des Mittelhirns, Schwierigkeiten mit der Herzentwicklung zu vermeiden. Der Abstand zwischen den Elektrodenetwa 1-0,5 mm, der Rest der Einstellungen 10 V, 20 msec und 50 msec Breite Verzögerung.
5. Bewerben einen Tropfen Kochsalzlösung auf der Embryonen, um es abzukühlen und entfernen Luftblasen.
6. Verschließen Sie die Eier mit dem Band und Inkubation für mindestens 4 Stunden, die Mindestzeit für Vektorausdruck erforderlich.

4. Fixierung von Hühnerembryonen

1. Entfernen Sie die Embryonen aus ihren Eiern.
2. Saubere Embryonen unter einem Stereomikroskop und inwieweit der Transfektion mit einem Fluoreszenzstereomikroskop.
3. Fix die Embryonen über Nacht in 4% PFA bei 4 ° C Weiter mit Schneiden und / oder Färbung (in-situ-Hybridisierung, Immunhistochemie), um Änderungen in der transfizierten Bereich zu analysieren.

Ergebnisse

Der Umfang des Mittelhirns Bereich mit miR transfiziert ist durch die Expression von GFP aus einem Reportervektor zusammen mit der miR-Expressionsvektor (Abbildung 2) eingespritzt wird sichtbar. Verwendung von Platinelektroden mit einem Durchmesser von 0,5 mm und parallel zur Transfektion eines breiten Bereich entlang der DV-und AP-Achse, einschließlich Hinterhirn, Mittelhirn und Zwischenhirn manchmal (2A und B) angeordnet, um die AP-Achse des Mittelhirns führt normalerweise. Die Größe ...

Diskussion

Dieses Video zeigt eine effektive Methode, um das Plasmid in die Neuroepithelzellen von bestimmten Bereichen des Mittelhirns Küken transfizieren. Rechteckige elektrische Impulse von Niederspannungs können DNA in Zellen der Küken Neuralrohr in ovo ^6,16 einzuführen. Jedoch ist die Genauigkeit der DNA-Targeting oft durch die breiten elektrischen Feldes, das durch den relativ großen Elektroden (Φ = 0,5 mm) steigt behindert. Wir haben versucht, dieses Problem durch Verwendung von Elektroden im Durchmesser...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Borosilcat-Glaskapillaren	Hartenstein		Modell: 0,9 mm
Mikrokapillarabzieher	WPI, Berlin		Modell: Pul1-E
Elektroporator	Intracel		Modell: TSSIC
Stereomikroskop - Fluoreszenz	LEICA		Modell: MZFLIII
Stereomikroskop	Zeiss		Modell: Stemi
Kamera und Software	Zeiss		Modell: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8