Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle

Zusammenfassung

Cilia-generated Fluidströmung in Kupffer-Vesikel (KV) steuert links-rechts Strukturierung des Zebrafisch-Embryos. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Modulation Genfunktion spezifisch in Zellen KV. Darüber hinaus zeigen wir, wie fluoreszierende Kügelchen in KV liefern Strömung zu visualisieren.

Zusammenfassung

Inneren Organen wie Herz, Gehirn und Darm entwickeln Links-Rechts-(LR) Asymmetrien, die kritisch für ihre normale Funktion ¹ sind. Motile Zilien sind bei der Festlegung LR Asymmetrie in Wirbeltierembryonen, einschließlich Maus, Frosch und Zebrafisch ^2-6 beteiligt. Diese "LR Zilien, Generate asymmetrischen Fluidströmung, die erforderlich sind, um eine konservierte asymmetrischen Nodal (TGF-β-Superfamilie) Signalkaskade in der linken Seitenplatte Mesoderm, die vermutlich LR Strukturieren Informationen zum Entwickeln Organen ⁷ bereitzustellen wird auslösen soll. Somit, um Mechanismen LR Strukturieren zu verstehen, ist es wichtig, Gene, die die Organisation des LR Flimmerzellen, die Motilität und die Länge von LR Zilien und ihrer Fähigkeit, stabile asymmetrische Strömung erzeugen regulieren identifizieren.

In der Zebrafisch-Embryos werden LR Flimmerhärchen in Kupffer-Vesikel (KV) ^2,4,5 entfernt. KV ist aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen umfaßt monociliateddass ein mit Flüssigkeit gefüllten Hohlraum umschließen. Schicksal Mapping hat gezeigt, dass KV aus einer Gruppe von ~ 20-30 Zellen als dorsalen Vorläuferzellen (DFCs), die an der dorsalen Rand Blastoderm wandern während epiboly Stufen ^8,9 bekannt abgeleitet ist. Während der frühen Somiten Stufen, um DFCs Cluster und differenzieren sich in Flimmerepithelzellen KV in der Schwanzknospe des Embryos ^10,11 bilden. Die Fähigkeit, zu identifizieren und zu verfolgen DFCs-in Kombination mit optischen Transparenz und rasche Entwicklung des Zebrafisch-Embryos-make Zebrafisch KV ein hervorragendes Modell System LR Flimmerzellen studieren.

Interessanterweise behalten Vorläuferzellen des DFC / KV Zellstammbaums cytoplasmatischen Brücken zwischen dem Eigelb Zelle bis zu 4 Stunden nach der Befruchtung (HPF), während zytoplasmatische Brücken zwischen dem Eigelb Zelle und andere embryonalen Zellen schließen nach 2 hpf ^8. Unter Ausnutzung dieser zytoplasmatischen Brücken, entwickelten wir ein Stadium-spezifische Injektion Strategie Morpholino Oligonucleotide liefernotides (MO) ausschließlich DFCs und Knockdown die Funktion eines gerichteten Gens in diesen Zellen ^12. Diese Technik schafft chimären Embryos in dem Genfunktion in dem DFC / KV Linie entwickeln im Kontext eines Wildtyp-Embryos wird geklopft. Um asymmetrische Strömung in KV analysieren, injizieren wir fluoreszierenden Mikrokügelchen in den KV Lumen und aufzeichnen bead Bewegung mit Videomikroskopie ^2. Fluidströmung einfach visualisiert und können durch die Verfolgung bead Verschiebung im Laufe der Zeit quantifiziert werden.

Hier mit dem stufenspezifischen DFC-Zielgens Knockdown Technik und Injektion von fluoreszierenden Mikrokugeln in KV zu fließen visualisieren stellen wir ein Protokoll, das einen effektiven Ansatz, um die Rolle eines bestimmten Gens während KV Entwicklung und Funktion charakterisieren bereitstellt.

Protokoll

Übersicht der Stage-Specific Zebrafisch Embryo Injections

Antisense Oligonukleotide Morpholino (MO), die zu einer gezielten mRNA binden und stören Proteinexpression von diesem Transkript, sind weit verbreitet in Knockdown Gen verwendet (Loss-of-function) Studien im Zebrafisch ^13,14. Gene Tools, LLC bietet MOs, die entweder mit Carboxyfluorescein (emittiert grüne Fluoreszenz) oder Lissamin (emittiert rote Fluoreszenz) getaggt sind, MO in injizierten Embryonen durch Fluoreszenzmikroskopie zu erkennen. Durch Einspritzen von MO in den Dotter Zelle in verschiedenen Stadien des Zebrafisches Entwicklung ist es möglich, die MO nach bestim....

Ergebnisse

Stufenspezifischen MO Injektionen stellen einen nützlichen Ansatz Genfunktion in bestimmten Kompartimenten des Embryos zu analysieren. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der Injektion Strategien verwendet werden, um Genfunktion in DFC / KV Zellen und wie zu testen, um fluoreszierende Beads einzuführen, um den Fluidstrom zu visualisieren in KV. Die Verteilung der fluoreszierenden MO in erfolgreichen stufenspezifischen injizierten Embryonen ist schematisch in den 1D-F un.......

Diskussion

Mit stage-spezifischen Injektionen MO dem DFC / KV Zelllinie Ziel ist ein nützlicher Ansatz zur Zell-Autonomie der Genfunktion zu studieren und zu vermeiden pleiotrope Phänotypen verursacht durch die globale Gen knockdown. Allerdings können diese Injektionen technisch anspruchsvoll. Injektion von MO zwischen den 256-Zelle und 1000-Zellen-Stufen können in drei möglichen Ergebnissen führen: 1) die MO bleibt aggregiert an der Injektionsstelle, 2) die MO diffundiert während des Eigelbs und tritt DFC / KV Zellen oder 3) das .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz / Material	Firma	Katalog-Nummer
Standard Control Oligo-Lissamine getaggt	Gene Tools, LLC
Benutzerdefinierte Rock2b Morpholino Oligo	Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 Mikron Microspheres	Polysciences, Inc.	24054