Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation In vivo Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC), zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren wurde verwendet, um die Expression stochastische Dynamik eines Transkriptionsfaktors, dem λ-Repressor CI folgen ¹.

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC) zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren macht es möglich, die Zahl der Proteinmoleküle in einer Zelle während sequentiell, fünfminütigen Zeitfenster produziert zählen. Es erfordert ein Fluoreszenzmikroskop mit Laseranregung Leistungsdichte von ~ 0,5 bis 1 kW / cm ^2, die empfindlich genug, um einzelne Moleküle fluoreszierende Protein in lebenden Zellen nachzuweisen ist. Das fluoreszierende Reporter in diesem Verfahren verwendet wird, besteht aus drei Teilen: eine Membran-Targeting-Sequenz, eine Fast-Reifung, gelb fluoreszierendes Protein und ein Protease-Erkennungssequenz. Der Reporter translatorisch an den N-Terminus eines Proteins von Interesse fusioniert ist. Zellen werden auf einer Temperatur-gesteuerten Mikroskoptisch gewachsen. Alle fünf Minuten werden fluoreszierende Moleküle in Zellen abgebildet (und später coUNTED durch die Analyse von Fluoreszenz-Bildern) und anschließend Lichtgeschädigte so dass nur neu übersetzt Proteine ​​in der nächsten Messung gezählt.

Fluoreszenzbilder aus diesem Verfahren kann durch Erfassen Fluoreszenzpunkte in jedem Bild, ihre Zuordnung zu einzelnen Zellen und dann Zuweisen Zellen Zelllinien analysiert werden. Die Anzahl von Proteinen innerhalb eines Zeitfensters in einer gegebenen Zelle erzeugt wird durch Dividieren der integrierten Intensität der Fluoreszenz von Flecken durch die durchschnittliche Intensität der einzelnen fluoreszierenden Moleküle berechnet. Wir verwendeten diese Methode zum Expressionslevel in dem Bereich von 0-45 Molekülen in einzelnen Zeitfenstern 5 min zu messen. Dieses Verfahren ermöglichte es uns, Rauschen in dem die Expression des λ-Repressor CI messen, und hat viele andere potentielle Anwendungen in Systembiologie.

Protokoll

Ein. Belastung Engineering Workflow

1. Legen Sequenzen kodiert (a) eine Membran-Lokalisierungssequenz, (b) eine schnell reifenden fluoreszierendes Protein und (c) eine Protease-Erkennungssequenz N-terminal zu und im Leserahmen mit einem Protein von Interesse (zB ein Transkriptionsfaktor). Wir verwendeten die Membran gezielt Tsr-Venus Reporter ² und fusioniert an die Protease Erkennungssequenz Ubiquitin (Ub), die Anzahl der Bakteriophage λ ausgedrückt Repressor CI Proteinmoleküle zählen. Einzelheiten über konstruierten wir das Fusionsprotein Tsr-Venus-Ub-CI, Ersetzen des Wildtyp-CI Kodierregion und Einbringen des Konstrukts in die E. coli-Chromosom mit λ Red Rekombination ^3, sind im Detail in ref beschrieben. Ein.
2. Überprüfen Sie alle Änderungen durch Sequenzierung.
3. Transformieren eines Plasmids, das eine Protease spezifisch für die Erkennungssequenz oben in einen Stamm, der die fluoreszierende Reporter und Protein von Interesse verwendetin translationale Fusion. Wir verwendeten die Protease UBP1, die sofort spaltet nach der C-terminale Rest ⁴ Ubiquitin.

2. Kultur Cells und Probe vorbereiten

1. Wählen Sie ein E. coli-Kolonie von Interesse aus einer frisch ausgestrichenen Agarplatte in 1 ml M9 Minimalmedium ⁵ mit 1X MEM Aminosäuren und geeigneten Antibiotika ergänzt. Inkubieren in einem Schüttler bei gewünschte Temperatur lange genug, um zu erreichen OD _600> 1,0 (optische Dichte bei 600 nm).
2. Verdünnen Sie die Kultur in 1 ml frischem M9-Medium mit geeigneten Antibiotika zur OD ₆₀₀ = 0,02. Inkubieren in einem Schüttler bei geeigneter Temperatur. Initial Zelldichte erhöht werden, wenn für die Tieftemperatur-Wachstum benötigt werden.
3. Wenn die OD ₆₀₀ = 0,2-0,3 (bei ​​37 ° C mit einem anfänglichen Zellkultur bei OD ₆₀₀ = 0,02, dies wird 3-4 Stunden dauern kann), beginnen die Vorbereitung der Agarosegel-Pad (Schritt 3).
4. Die Zellen sind zur Bildgebung bereit, wenn OD _{600 = 0,3-0,4.}
5. Übertragen 1 ml inkubierten Kultur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Zentrifuge bei 10.000 xg für 1 min in einem Tischgerät Mikrozentrifuge.
6. Überstand verwerfen und 1 ml frisches Medium M9 und das Pellet vorsichtig.
7. Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 Minute.
8. Wiederholen Sie Schritt 1,6 und 1,7. Überstand verwerfen.
9. Vorsichtig in 1 ml M9-Medien resuspendieren. Bis 100-fache zu geringen Zelldichten für timelapse Bildgebung sicherzustellen - Zellen können direkt für Mikroskopabbildanordnung oder verdünntem 10 verwendet werden. Beachten Sie, dass geringen Zelldichten wichtig sind für längere timelapse Bildgebung. Die Abbildungskammer (Schritt 4) während des Experiments abgedichtet. Durch exponentielle Wachstum der Zellen, können hohe anfängliche Zellkonzentration signifikant zum Abbau Sauerstoff in die Kammer nach längerer Wachstum in der Gel-Pad, wodurch fluoreszierende Protein Reifung und beeinflussen Zellwachstum.

3. Bereiten Sie die Agarose-Lösung

1. Wiegen 10-20 mglow-Schmelztemperatur Agarose in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Fügen Sie entsprechende Volumen M9 Minimalmedium ohne Antibiotika, um eine 3% igen Lösung herzustellen.
3. Erwärmen der Agarose-Lösung für 30 min bei 70 ° C zu schmelzen, Invertieren des Rohres zu gewährleisten, dass die Lösung vollständig geschmolzen und homogen ist. Das Gelkissen kann an diesem Punkt (Schritt 4) gegossen werden, oder die Temperatur kann auf 50 ° C gesenkt werden und dort für mehrere Stunden zur späteren Verwendung.

4. Bereiten Gel Pad auf der Kammer

1. Etwa 50 min vor der Bildgebung, spülen ein Microaqueduct Rutsche mit Wasser.
2. Lidspalt ein Deckglas reinigen (mit einem strengen Reinigungsverfahren wie das in ⁶ beschrieben) und Microaqueduct Schlitten mit sterilem Wasser und trocken durch Abblasen mit Druckluft.
3. Platzieren Sie die Gummidichtung auf den Schieber Microaqueduct so dass er die Ein-und Auslässe auf der Glasseite der Microaqueduct Schieber (deckt diese für Anwendungen im modifiziert werdenwelche Medien durch die Probe perfundiert). Anwenden 50 ul Agaroselösung (Schritt 3) in der Mitte des Schiebers Microaqueduct.
4. Ganz oben auf der Agarose-Lösung mit dem gereinigten, trockenen Deckglas.
5. Lassen Sie die Agarose-Lösung bei Raumtemperatur stehen für 30 min.
6. Unterdessen bereiten eine Zellprobe (Schritt 2).
7. Ziehen Sie vorsichtig die Glasabdeckung von der Spitze des Gel-Polster. Fügen Sie 1,0 ul gewaschene Zellkultur an die Spitze des Gel-Polster. Warten für ~ 2 Minuten für die Kultur von der Gel-Polster absorbiert werden. Es ist wichtig, nicht so lange zu warten, dass die Gel-Polster overdries, aber lang genug, dass die Zellen richtig auf das Gel Pad eingehalten werden. Das Ideal Wartezeit wird mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit variieren.
8. Während des Wartens, trocknen anderen vorgereinigte Deckglas.
9. Decken Sie die Probe mit dem neuen Deckglas sicherzustellen, dass das Deckglas und Microaqueduct Objektträgers ausgerichtet sind.
10. Montieren Sie den temperierten Klimakammer nach den Anweisungen des Herstellers.Es kann nun zur Abbildung auf Mikroskop (Schritt 5) verwendet werden.

5. Imaging und Erwerb von Timelapse Filme

1. Einschalten des Lasers und Mikroskop nach Herstellerangaben (zB der Laser muss möglicherweise aufgewärmt für ~ 0,5 Stunden vor dem Experiment).
2. Verriegeln Sie den zusammengesetzten Kammer auf die Bühne Einsatz am Mikroskop. Stellen Sie die Temperatur der Wachstumskammer und des Ziels Heizeinrichtung bei 37 ° C oder eine andere gewünschte Wachstumstemperatur.
3. Wenn Bildgebung oberhalb der Raumtemperatur, wird der Fokus oder die Gel-Polster in der Regel deutlich driften für ~ 15 min nach der anfänglichen Temperatur-Verschiebung. In der Praxis diese Zeit nutzen, um Bereiche von Interesse zu finden und zu ändern Bildgebung Script als notwendig für ein Experiment.
4. Finden Zellen auf dem Mikroskop und Speichern der Position einer jeden Zelle nach Zentrierung er innerhalb eines vordefinierten und ausgerichtet Bildgebungsregion. Mehr als eine Zelle in jeder Bildaufnahmezeit Fenster abgebildet werden. Für timelapse Abbildung über mirgendwelche Generationen, damit abgebildeten Zellen zunächst von anderen Zellen durch mindestens ein paar hundert um getrennt, so dass andere Kolonien nicht betreten wird die Bildgebungsregion während des Wachstums.
5. Passen Laseranregung Intensität, so dass fast alle fluoreszierende Moleküle Photobleichmittels innerhalb von 6 Aufnahmen (Abbildung 5).
6. Mit Hilfe eines automatisierten Imaging-Skript / journal erwerben timelapse Daten mit Hilfe des Algorithmus in der experimentellen Workflow in Abbildung 3 beschrieben.

Ergebnisse

Typische Ergebnisse aus einem Versuch CoTrAC Verfolgen der Herstellung des λ-Repressor CI sind in den 4 und 5 gezeigt. In diesem Experiment wurden 12 Kolonien in 5 min Intervallen abgebildet. Zu jedem Zeitpunkt wurde die erste Kolonie autofocused und zentralisiert innerhalb der Bildgebungsregion. Als nächstes wurde die mittig / fokussierte Position gespeichert und ein Hellfeld Bild erworben wurde. Die Stufe wurde dann von ~ 0,5 um entlang der z-Achse von der translozier...

Diskussion

Die CoTrAC Verfahren kann verallgemeinert werden, um die Produktion von anderen Proteinen, wo herkömmliche N-oder C-terminale Fusionen fluoreszierendes Protein-Protein-Aktivität zerstören kann messen. Die CoTrAC Strategie hat drei einzigartige Vorteile gegenüber den derzeitigen Methoden. Erstens sorgt co-translationale Fusion, daß ein Molekül des fluoreszierenden Reporter für jedes Molekül des Proteins von Interesse hergestellt wird, was eine genaue Zählung der Proteinproduktion in Echtzeit. Zweitens die Membran gezielt...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Agarose (Low Schmelztemperatur)	Lonza	50100
Milli-Q-H 2 O
5 × M9-Salze			Folgende Rezept in 9 beschrieben
20% Glucose
MgSO 4
CaCl 2
50 × MEM Aminosäurelösung	Invitrogen	11130-051
Temperatur-Controlled GrowthKammer Tischadapter	Bioptechs	FCS-2
Ziel Heater	Bioptechs	Modell hängt Mikroskopobjektiv
Microaqueduct Slide	Bioptechs	130119-5
Micro Deckgläser	VWR	40CIR-1	Kann schwierig sein Quelle; ebenfalls erhältlich von Bioptechs
Deckglas / slide Dichtung	Bioptechs	FCS2 0,75 mm
Fluoreszenzmikroskop	Verschiedene	Beispiel setup: Coherent Innova 308C Argon-Ionen-Laser, Olympus IX-81 Mikroskop Olympus PlanApo 100X NA 1,45 Ziel, Metamorph-Software	Muss Laseranregung, automatisierte xyz Bühne, Automatisierungs-Software in der Lage ist scripted Bildgebung und Autofokus, Optik in der Lage Resolvin habeng einzelner fluoreszierender Proteine
EM-CCD-Kamera	Verschiedene	Beispiel setup: Andor Ixon DU-898	Muss niedrig genug Lärm haben, einzelne fluoreszierende Proteine ​​über den Hintergrund erkennen