Der Comet Assay ist ein effizientes Mittel zur Feststellung von Einzel-und Doppelstrang-Brüche, einschließlich Alkali-labile Websites und DNA-DNA/DNA-protein Cross-Links auf der DNA in allen Zellen, einschließlich Neuronen im Hippocampus. Die Methode nimmt den Vorteil dieser differentielle Migration von DNA in einem elektrischen Feld aufgrund von Unterschieden in Menge an DNA-Schäden.
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Methodenartikel
Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine Reihe von Medikamenten gezielt die DNA Reparaturmechanismen und induzieren Zelle, indem sie DNA-Schäden zu töten. So wurden Prozesse direkt zu messen DNA-Schäden wurde ausgiebig evaluiert. Herkömmliche Methoden sind zeitaufwendig, teuer und erfordern ressourcenintensiv replizierende Zellen. Im Gegensatz dazu ist die Comet-Assay, eine einzelne Zelle Gelelektrophorese-Assay, ein schneller, nicht-invasiven, kostengünstigen, direkt und empfindliches Maß von DNA-Schäden und Reparatur. Alle Formen von DNA-Schäden sowie DNA-Reparatur kann an der einzelnen Zelle mit diesem leistungsstarken Technik visualisiert werden.
Das Prinzip des Comet Assay ist, dass intakte DNA ist hoch geordnete wohingegen DNA Schädigung unterbricht diese Organisation. Die beschädigten DNA sickert in der Agarose-Matrix und, wenn sie einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, wandert der negativ geladenen DNA zur Kathode, das positiv geladen ist. Die großen unbeschädigten DNA-Stränge sind nicht in der Lage zu weit vom Kern migrieren. DNA-Schädenentstehen kleinere DNA-Fragmente, die weiter als die intakte DNA reisen. Kometentest eine Bildanalyse-Software, misst und vergleicht die gesamte Fluoreszenzintensität der DNA im Zellkern mit DNA, die aus dem Nukleus migriert ist. Fluoreszenzsignal aus der migrierten DNA ist proportional zur DNA-Schäden. Längere heller DNA tail bedeutet erhöhte DNA-Schäden. Einige der Parameter, die gemessen werden Leitwerksmoment die ein Maß für sowohl der Menge an DNA und Verteilung der DNA im Schwanz, Schwanzlänge und Prozentsatz der DNA in dem Endstück ist. Dieser Test ermöglicht es, DNA-Reparatur als auch messen, da Auflösung von DNA-Schäden bezeichnet Reparatur stattgefunden hat. Die Grenze der Empfindlichkeit liegt bei etwa 50 Strangbrüche pro diploid Säugetierzellen 1,2. Zellen mit irgendwelchen DNA-schädigende Mittel, wie zum Beispiel Etoposid behandelt wird, kann als eine positive Kontrolle verwendet werden. So ist die Comet-Assay ist eine schnelle und wirksame Verfahren, um DNA-Schäden zu messen.
Protokoll
Ein. Cell Culture
- Kultur neuronalen Zellen und behandeln Sie sie nach Bedarf.
- Ernte Zellen in 15 ml Röhrchen: Aspirat Medien, mit Phosphat spülen Kochsalzlösung (PBS, Calcium und Magnesium befreit), fügen Trypsin, sammeln sich in 15 ml Röhrchen und neutralisieren Trypsin mit geeigneten serumhaltigen Medien.
- Spin bei 1.000 xg für 5 min.
- Absaugen Medien.
- Die Zellen in PBS.
- Spin bei 1.000 xg für 5 min.
- Absaugen Medien und resuspendieren Zellen in frischem PBS.
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämacytometers oder Ihre bevorzugte Zelle Zähler.
- Zellproben sollte unmittelbar v....
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Diskussion
Der Comet Assay hat die einzigartige Fähigkeit zur Analyse von einzelnen Zellen. Dies ist vorteilhaft bei der Identifizierung von Subpopulationen von Zellen, die differenzielle Reaktion auf zytotoxischen Mitteln demonstrieren. Einige praktische Einschränkungen zu berücksichtigen. Die Anzahl der Zellen, die einzeln ausgewertet werden kann je nach dem Individuum. Der Stichprobenumfang erhöht werden muss, wenn es Varianz in DNA-Schädigung innerhalb einer Population. Lebensfähigen Einzelzell-Suspension ist für diesen Assay .......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der IMPACT Award vom Department of Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, The Fighting Kinderkrebsstiftung und der Gabrielle 's Angel Foundation (zum ESY.) Unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalognummer | Kommentare (optional) |
| 1,5 ml Röhrchen | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-200.271 | |
| 10X TBE (Tris-Base, Borsäure, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml Tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminiumfolie | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Becher | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Zentrifugieren | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay-Software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Zylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis Kammer | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Zeiss Axio Vision- | Jede Fluoreszenzmikroskop mit Grünfilter genügt | |
| Hämazytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt | Promega | V2111 | |
| Mikrowelle | Sears | ||
| Phosphatgepufferter Kochsalzlösung, Calcium-freien, Magnesium kostenlos | HyClone | SH3025601 | |
| Stromversorgung | BioRad | 1645050 | |
| Kühlschrank | Sears | ||
| Herrscher | Staples | ||
| Gleiten | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Kochsalz | Sigma | S7653 | |
| Natriumhydroxid | Sigma | S5881 | |
| Natriumlaurylsarcosinat | Fisher Scientific | S529 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S7585 | |
| Tablett | Fisihrem Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Wirbel | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Wasserbad | Fisher Scientific | 154622Q |
Referenzen
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleu....
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Nachdrucke und Genehmigungen
