Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Félix Legendre; Neal Cody; Carole Iampietro; Julie Bergalet; Fabio Alexis Lefebvre; Gaël Moquin-Beaudry; Olivia Zhang; Xiaofeng Wang; Eric Lécuyer

doi:10.3791/50057

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Methodenartikel

Whole Berg RNA Fluorescent

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DOI:

10.3791/50057

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30. Januar 2013

Félix Legendre^*¹^,² , Neal Cody^*¹ , Carole Iampietro¹ , Julie Bergalet¹ , Fabio Alexis Lefebvre¹^,² , Gaël Moquin-Beaudry¹^,² , Olivia Zhang¹ , Xiaofeng Wang¹ , Eric Lécuyer¹^,²

¹Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), ²Department of Biochemistry, Université de Montréal

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine ganze-mount fluoreszierende In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll für die Bestimmung der Expression und Lokalisation Eigenschaften von RNAs während der Embryogenese in der Fruchtfliege ausgedrückt, Drosophila melanogaster.

Zusammenfassung

Beurteilung der Expression eines Gens, sowie der subzellulären Lokalisation Eigenschaften seiner transkribierte RNA, sind wesentliche Merkmale für das Verständnis seine biologische Funktion während der Entwicklung. RNA in situ Hybridisierung (RNA-ISH) ist eine leistungsfähige Methode zur Visualisierung von RNA Verteilung Eigenschaften verwendet, sei es bei den Organismen, Zellen oder subzellulären Ebene ^1. RNA-ISH basiert auf der Hybridisierung einer markierten Nukleinsäure-Sonde (z. B. Antisense-RNA, Oligonukleotiden) komplementär zu der Sequenz eines mRNA oder eines nicht-kodierende RNA Ziel von Interesse ² basiert. Da das Verfahren erfordert Primärsequenz Information allein zur sequenzspezifischen Sonden zu erzeugen, kann es allgemein zu einem breiten Spektrum von Organismen und Gewebeproben ³ angewendet werden. In der Tat, eine Reihe von großen ISH Studien durchgeführt wurden, um die Genexpression zu dokumentieren und RNA Lokalisation Dynamik in verschiedenen Modellorganismen hat sich auf das führteAufbau wichtiger Community-Ressourcen ^4-11. Während eine Vielzahl von Sonden-Markierung und zum Nachweis Strategien im Laufe der Jahre entwickelt worden sind, bieten die kombinierte Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nachweisreagenzien und enzymatische Signalverstärkung Schritte signifikante Verbesserungen der Empfindlichkeit und Auflösung des Verfahrens ^12. Hier beschreiben wir eine optimierte Fluoreszenz in situ Hybridisierung Verfahren (FISH) unter Verwendung Tyramid Signalverstärkung (TSA), die RNA Expression und Lokalisation Dynamik inszeniert Drosophila-Embryonen zu visualisieren. Das Verfahren wird in 96-well PCR-Platte-Format, das erleichtert die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Zahl von Proben durchgeführt.

Protokoll

Ein. RNA Probe Vorbereitung

Übersicht: Der folgende Abschnitt beschreibt die erforderlichen Schritte zum Digoxigenin (DIG)-markierten RNA-Sonden für FISH machen. Der erste Schritt beinhaltet das Klonen oder PCR Amplifikation einer Sequenz entsprechend der transkribierten Region eines Gens von Interesse, die verwendet werden, um eine Sequenz-spezifische Sonde erzeugt wird. Dies kann durch Klonieren der erste Genabschnitt in ein Plasmid, in dem die multiple Klonierungsstelle von Bakteriophagen Promotorelemente (T7, T3 oder SP6), die dann als Matrize für eine PCR mit flankierenden Primer dienen, die die Promotor-Sequenzen flan....