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Methodenartikel

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

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DOI:

10.3791/50076

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23. Juni 2013

 ,  , 
1The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Zusammenfassung

Schutz gegen Infektionskrankheiten durch das Immunsystem vermittelt 1,2. T-Lymphozyten sind die Master Koordinatoren des Immunsystems, der Regulierung der Aktivierung und Antworten mehrerer Immunzellen 3,4. T-Zell-Aktivierung ist abhängig von der Erkennung von Antigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) angezeigt. Die T-Zell-Antigen-Rezeptor (TCR) ist spezifisch für jedes T-Zell-Klon und bestimmt Antigenspezifität 5. Die Bindung des TCR auf das Antigen induziert die Phosphorylierung von Komponenten des TCR-Komplexes. Um den T-Zell-Aktivierung zu fördern, müssen dieses Signal von der Membran in das Zytoplasma und den Zellkern transduziert Einleiten verschiedenen entscheidenden Reaktionen wie Einstellung der Signal-Proteinen an die TCR; APC Website (Immunsynapse), deren molekulare Aktivierung Zytoskelett-Umlagerung Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration, und Veränderungen in der Genexpression 6,7. Die richtige initiation und Beendigung der Aktivierungssignale ist entscheidend für die entsprechenden T-Zell-Reaktionen. Die Aktivität der Signalproteine ​​ist abhängig von der Bildung und Auflösung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, posttranslationale Modifikationen wie Protein-Phosphorylierung die Bildung von Protein-Komplexe, Protein Ubiquitin und die Rekrutierung von Proteinen an verschiedenen zellulären Seiten 8. Das Verständnis, das Innenleben des T-Zell-Aktivierung ist entscheidend sowohl für die immunologische Forschung und klinische Anwendungen.

Verschiedene Tests wurden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, aber biochemische Assays, wie dem weit verbreiteten Co-Immunopräzipitation Methode nicht zulassen Protein Lage zu sein, erkannt und somit auch keine Beobachtung wertvolle Einblicke in die Dynamik zellulärer Mechanismen. Zusätzlich können diese Masse Assays kombinieren üblicherweise Proteine ​​aus verschiedenen Zellen, die möglicherweise in verschiedenen Stadien der ter untersucht zellulären Prozess. Dies kann sich nachteilig auf die zeitliche Auflösung. Die Verwendung von Echtzeit-Bildgebung lebender Zellen ermöglicht sowohl die räumliche Verfolgung von Proteinen und die Fähigkeit, zeitlich zwischen Signalwege zu unterscheiden, damit Licht auf die Dynamik des Prozesses 9,10. Wir stellen ein Verfahren zur Echtzeit-Bildgebung von Signalisierungs-Komplexbildung bei T-Zell-Aktivierung. Primären T-Zellen oder T-Zell-Linien, wie Jurkat sind mit Plasmiden, die für Proteine ​​von Interesse fusioniert an monomeren fluoreszierenden Proteine ​​transfiziert verhindert unphysiologische Oligomerisierung 11. Live-T-Zellen werden in einem Deckglas vorbeschichtet mit T-Zell-aktivierende Antikörper 8,9, die dem CD3/TCR Komplex bindet und induziert T-Zell-Aktivierung unter Überwindung der Bedarf an speziellen aktivierende Antigene fallen gelassen. Aktivierten Zellen werden ständig mit der Verwendung der konfokalen Mikroskopie abgebildet. Imaging Daten werden analysiert, um quantitative Ergebnisse, wie die Ausbeute colocalization Koeffizient der Signal-Proteinen.

Protokoll

1. T-Zell-Transfektion

  1. Bereiten Sie die aktivierten Amaxa Nucleofector Lösung durch Mischen des Kits "Nachtrag" Lösung des Nucleofector Lösung. Die aktivierte Lösung kann bei 4 ° C für bis zu drei Monate gelagert werden.
  2. Wachsen Jurkat-T-Zellen in Kulturmedium [10% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 2 mM L-Glutamin in RPMI]. Optimalerweise sollten die Zellen 1-2 Wochen nach dem Auftauen verwendet werden. Mit Zellkulturen in der logarithmischen Wachstum ist entscheidend für hohe Transfektionseffizienz und das Überleben der Zelle. Alternativ, mit geringfügigen Modifikationen, dieses Protokoll mit primären T-Zellen verwendet werden, wie zuvor 8 beschrieben. Es sollte betont werden, dass die Dauer der Aktivierung von primären T-Zellen ist länger als die von Jurkat-T-Zellen (~ 30 min), montiert ein Mikroskoptisch Inkubation zu verwenden ist, um CO 2, Feuchtigkeit und Temperatur während der gesamten, werden Aktivierung.
  3. Sammeln Sie 510 × 6 log-Phasen-T-Zellen pro Transfektion in einer 15-ml-Tube.
  4. Zentrifuge Zellen für 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur.
  5. Bei der Zentrifugation Herstellung einer 6-Well-Platte. Füllen man gut für jede Transfektion mit 5 ml Kulturmedium und Pre-Inkubation bei 37 ° C.
  6. Sammeln Sie die Rohre aus der Zentrifuge und den Überstand verwerfen. Zellpellet in 1 ml RPMI.
  7. Zentrifuge Zellen für 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur.
  8. Während des Laufs wird, bereiten Sie die Transfektion Lösung. In einer Vertiefung einer 96-Well-Platte, mischen aktiviert 100 ul Amaxa Nucleofector Lösung in Stufe 1 mit 5 ug DNA des Plasmids von Interesse Codieren eines fluoreszenzmarkierten Protein hergestellt. Optimalerweise sollte DNA-Konzentration größer als 1 g / ml, um zu vermeiden Verdünnen der Transfektion Lösung.
  9. Gut mischen durch vorsichtiges Pipettieren.
  10. Nach der Zentrifugation der Zellen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand während alle nicht disturbing das Pellet.
  11. Pipettieren Sie die DNA / Transfektionslösung zweimal.
  12. Fügen Sie die DNA / Transfektionslösung dem Pellet.
  13. Übertragen Sie die Zellen an die Amaxa Küvette.
  14. Setzen Sie die Küvette in die Amaxa Nucleofector Gerät.
  15. Verwenden Sie den H-10 Amaxa Transfektion Einstellung für die Elektroporation (für Jurkat) oder T-23 (für die primäre T-Zellen).
  16. Entfernen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator.
  17. Nach der Elektroporation wurden sorgfältig den Überstand mit der Zellsuspension in den 6-well-Platte mit einer Pasteurpipette. Ein Pellet aus Zelltrümmern bilden. Vermeiden Sie die Übertragung der Pellets.
  18. Inkubieren der Zellen für 24 Stunden bei 37 ° C.
  19. Übertragen 2,5 ml Zellsuspension aus jeder Vertiefung in eine neue gut. Fügen Sie 2,5 ml warmem Kulturmedium (siehe Schritt 2) in jede Vertiefung.
  20. Nach 72 h, übertragen die Zellen in ein steriles Röhrchen und zentrifugieren 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und ersetzen Sie es with Kulturmedium mit der Säugetierzelle Selektionsantibiotikum die für das verwendete Plasmid (Anwendung einer geeigneten Konzentration der Antibiotika, verwendeten wir G418 und / oder Hygromycin in Konzentrationen von 1,3 mg / ml und / oder 0,2 mg / ml) ergänzt. Kultur die Zellsuspension in einem frischen gut. Alternativ können Zellen, die transient transfiziert und 48 abgebildet h nach der Transfektion. Transient transfizierte Zellen herzustellen, Co-Transfektion der Zellen mit den beiden Plasmiden gleichzeitig mit Schritt 8 fortgesetzt normalerweise zu Schritt 20, und fahren direkt mit Schritt 23 fort. Man beachte, dass in diesem Fall wird die Zellen sofort verwendet werden, und in der Regel ihre Fluoreszenzintensität ist heterogen und nicht notwendigerweise hoch.
  21. Wachsen die Zellen mit Kulturmedium mit der entsprechenden Auswahl Antibiotikum ergänzt. Teilen Sie die Zellen und ergänzen sie mit Antibiotika ergänzt Kulturmedium nach Bedarf.
  22. Nach 2 Wochen, ob erfolgreiche Transfektion mit dem Einsatz von FACS (Grippeorescence-activated cell sorting) wie folgt:
  23. Sammeln 10 6 transfizierten Zellen 10 6 mock-transfizierten Zellen (negative Kontrolle) und 10 6 Zellen, die bekanntermaßen stabil exprimieren fluoreszenzmarkierten Proteins. Wenn Zellen mit mehr als einem fluoreszierenden Protein (siehe Schritt 27), transfiziert werden, verwenden mehrere, einzeln markierten Zelllinien als positive Kontrollen.
  24. Zentrifuge Zellen für 7 min bei 400 × g bei Raumtemperatur.
  25. Überstand verwerfen. Die Zellen in 500 ul FACS-Puffer (PBS w / o Ca 2 + und Mg 2 +, 5% FCS, 0,05% Natriumazid).
  26. Mit einer analytischen FACS, um zelluläre Fluoreszenz überprüfen. Vergleichen der Fluoreszenz der transfizierten Zellen mit dem der negative und positive Kontrollen.
  27. Um die Zellen mit einem zusätzlichen, fluoreszenzmarkierten Protein, wiederholen Sie die Schritte 3-26 mit den transfizierten Zellen transfiziert.
  28. Zellen, die hohe Niveaus der Fluoreszenz verwendet werden. Optimalerweise mindestens 50%die Zellen in der Kultur sollte stark fluoreszierend. Handy Fluoreszenz kann durch Zellsortierung via FACS erhöht werden.

Etwaige zusätzliche markierte Proteine ​​müssen unterschiedlichen Fluorophoren fusioniert werden und auf Plasmiden für verschiedene Selektionsantibiotika codiert werden. Selektionsmedium für Zellen mit mehr als einem Plasmid transfiziert ist mit allen geeigneten Antibiotika ergänzt werden.

2. T-Zell-Spreading Assay Vorbereitung

  1. Verwenden Sie Lab-Tek II Deutsch Deckglas System 4 Kammer-Objektträgern. Achten Sie darauf, nicht versehentlich zerkratzen die innere Oberfläche der Kammern, mit einer Pipettenspitze zB während der Herstellung oder Verwendung.
  2. Bereiten 50-ml Objektträgervorbereitung Lösung: Nehmen Sie 4,6 ml 12 M (37%) HCl, fügen 38,5 ml 100% Ethanol und 6,9 ml doppelt destilliertes Wasser.
  3. Füllen Sie jede Kammer der Rutsche mit 500 ul Objektträgervorbereitung Lösung.
  4. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
  5. Saugen Sie die Kammers, Trocknen sie vollständig.
  6. Inkubieren Sie die unbedeckten Folien für 1 Stunde bei 45 ° C bis vollständig trocken.
  7. Bereiten 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung durch Verdünnen 0,1% Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich) in doppelt destilliertem Wasser.
  8. Bewerben 500 ul zu jeder Kammer.
  9. Den Objektträger für 15 min bei Raumtemperatur.
  10. Saugen Sie die Kammern, Trocknen sie vollständig.
  11. Inkubationszeit von 3 h bei 45 ° C bis vollständig trocken.
  12. Beschichtete Objektträger gespeichert für mehrere Monate bei Raumtemperatur trocken sein.
  13. Bereiten Sie eine aktivierende Antikörper-Lösung. Verwenden Sie ein Anti-CD3-Antikörper: entweder HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) oder UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 ug / ml in 400 ul PBS pro Kammer. Diese Lösung sollte kurz vor der Präparation der Objektträger hergestellt werden.
  14. Füllen Sie jede Kammer mit 400 ul des aktivierenden Antikörper-Lösung.
  15. Den Objektträger für 2 Stunden bei 37 ° C oder, vorzugsweise, über Nacht bei 4 ° C.
  16. Entfernen Sie die aktivierende Antikörper solution und sofort abwaschen die Kammer zweimal mit 300 ul PBS. Ab diesem Zeitpunkt sicher, dass die Kammern mit Puffer gefüllt bleiben.
  17. Bewahren Sie die PBS-gefüllten Folie bei 4 ° C. Wir empfehlen die Verwendung der vorbereiteten Objektträger Kammern innerhalb 1 Woche.

3. T-Zell-Aktivierung und Imaging

  1. Bereiten Bildgebung buffer [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml FCS, 38.75 ml RPMI ohne Phenolrot]. Imaging-Puffer bei 4 ° C nach der Filtration gespeichert werden.
  2. Aktivieren Sie die Zeiss LSM 510 Meta Mikroskop. Halte das Mikroskop beheizbare Einbaurahmen bis 37 ° C. Wählen Sie "Expert-Modus".
  3. Klicken Sie auf den "Acquire" und öffnen Sie die folgenden Registerkarten: Laser; Mikroskopie; Konfiguration; Scan; Time Series.
  4. Aktivieren Sie die benötigten Lasern. Zur Anregung von MCFP und mYFP setzte der Argon / 2 Laser auf "Standby" für 5 min, dann auf "on".
  5. Wenn Sie diesen Live-Cell-Imaging-Test vor durchgeführt haben, mit den gleichen Fluorophoren, öffnen Sie die resultierende LSM-Datei, klicken Sie auf die "Wiederverwendung" icon, und von Schritt 9 fort. Andernfalls mit Schritt 6 fort.
  6. Definieren Kanäle mit Filter geeignet für die Anregung und Emission der fluoreszierenden Proteine ​​verwendet.
  7. In der "Scan Control" Fenster wählen Sie die Option Z-Stack.
  8. Geben Sie die folgenden Scan-Parameter: Anzahl der Scheiben: 5; Intervall: 0,5 um; Aktuelle Scheibe: 3.
  9. Bereiten Sie eine Accublock Digitale Dry Bath (Labnet) bei 37 ° C in der Nähe des Mikroskops.
  10. Wärmen Sie die Imaging-Puffer auf 37 ° C.
  11. Bereiten Sie das gespeicherte Bild durch Absaugen des PBS, und ersetzt sie mit 600 ul Puffer warmen Bildgebung.
  12. Den Objektträger bei 37 ° C Halten Sie die Folie in den Inkubator, bis Stufe 13, für mindestens 15 min.
  13. Sammeln Sie 5 x 10 5 transfizierten T-Zellen.
  14. Zentrifuge Zellen für 2 min bei 400 × g.
  15. Überstand verwerfen.
  16. Die Zellen in 1 ml warmen Imaging-Puffer, und übertragen Sie sie auf einer 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen.
  17. Legen Sie die test Rohr auf der Accublock Digitale Dry Bath.
  18. Nehmen Sie die erwärmte Folie aus dem Inkubator und klebe sie auf die erwärmte Mikroskop Einbaurahmen.
  19. Klicken Sie auf die "VIS"-Symbol.
  20. Mischen Sie die Zellsuspension und entfernen 1-2 ul.
  21. Legen Sie die Spitze der Pipette in das abbildende Puffer über dem unteren Rand der Folie. Vermeiden Sie ein Verkratzen der Folie.
  22. Seed die Zellen gegenüber dem Ziel der Öffnung.
  23. Sofort beginnen visuell Verfolgung der fluoreszierenden Zellen, wie sie absteigen. Markieren Sie eine Zelle, die eine hohe Fluoreszenz zeigt in beiden Kanälen.
  24. Bevor die Zelle erreicht die Oberfläche der Folie, aktivieren Sie die LSM-Modus.
  25. Sehen nur ein Anregungslaser. Wählen Sie einen Laser, für die Sie eine DIC-Kanal.
  26. Set Zoom auf 1 setzen. Klicken Sie auf die "Fast XY"-Symbol. Klicken Sie auf das Symbol "Stop". Mit dem Crop-Werkzeug, wählen Sie eine ROI auf die Zelle zentriert.
  27. Set Zoom bis 3. Klicken Sie auf die "Fast XY"-Symbol und dann manuell den Fokus optimal sehen die Zelle. Klicken Sie auf "Stop" icon.
  28. Sehen alle benötigten Anregungslaser.
  29. Starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf das "StartT"-Symbol. Bild der Zelle für die Gesamtheit der Ausbreitung Verfahrens (üblicherweise 5 min). Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf das Symbol "Stop".
  30. Speichern Sie die Datei.
  31. Um zusätzliche Zellen zu erwerben, klicken Sie auf "VIS"-Symbol. Wenn es Zellen, die noch nicht in Kontakt mit dem Schlitten hat die unten kommen, aus dem Schritt 23 fort. Vermeiden Bildgebung von Zellen, die bereits die Verbreitung Prozess begonnen haben. Ansonsten gehen Sie zu Schritt 32.
  32. Wenn die beobachteten slide Bereich ist meist frei von Zellen, fügen Sie eine weitere Teilmenge von Zellen (weiter bei Schritt 20). Ansonsten gehen Sie zu Schritt 33.
  33. Um zusätzliche Zellen erwerben, bewegen Sie den Schieber, so dass der Bereich oberhalb des Objektivs Öffnung frei von Zellen ist.
  34. Einen weiteren hinzufügen Aliquot von Zellen (und fahren Sie mit Schritt 20).
  35. Nach Durchführung aller die gewünschte Bildgebung, öffnen Sie eine gespeicherte Datei LSM.
  36. Klicken Sie auf "Galerie", "Zeit + Z" und "Subset".
  37. Wählen Sie die Relevantent Zeitbereich und Z-Stack.
  38. Speichern Sie die neue Datei.
  39. Führen Sie die Schritte 35-38 für alle Imaging-Dateien.

4. Imaging Data Analysis

  1. Öffnen Sie die Dateien mit Imaris LSM Software (Bitplane AG, Zürich Schweiz).
  2. Klicken Sie auf "übertreffen". Klicken Sie auf "Image Processing"-Menü und wählen Sie "Wechseln von Zeit und Z". Dies wird in den richtigen Beschneiden des Bildes zu unterstützen.
  3. Klicken Sie auf den "Bearbeiten"-Symbolleiste, und wählen Sie die "Crop 3D"-Option aus dem Dropdown-Menü. Das Bild zuschneiden, um nur die Umgebung der Zelle gehören. Wir schlagen vor, Zuschneiden eines 300 × 300 Pixel Platz auf der Zelle zentriert. Beachten Sie, dass die Form und Lage der Zelle mit der Zeit ändern. Die Beobachtung der t-Achse, stellen Sie sicher, dass die Zelle in der Region zugeschnitten ist zu allen Zeitpunkten.
  4. Klicken Sie auf "Image Processing"-Menü und wählen Sie "Wechseln von Zeit und Z", um die ursprüngliche zeitliche Trennung des Bildes wiederherzustellen.
  5. Drücken Sie die "Coloc"-Taste auf der Haupt-Symbolleiste. Wählen Sie "Bauzeit Dep. Coloc ". Imaris berechnet automatisch Intensität Schwellenwerte für jeden Kanal zu jedem Zeitpunkt.
  6. Sehen Sie sich die Ergebnisse der Kolokalisationsanalyse indem Sie "Channel Statistics". Exportieren Sie die Daten, indem Sie auf "Export".
  7. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 6 für jeden abgebildeten Zelle. Es empfiehlt sich, mindestens 50 Zellen in dieser Art und Weise analysiert werden.
  8. Berechnen Sie den Mittelwert Pearson Kolokalisation Koeffizienten und deren Standardfehler oder Abweichung.

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Ergebnisse

Wir präsentieren ein Beispiel für Live-T-Zell-Bildgebung und Analyse. Vor dem Imaging Experiment wurden SLP76 defizienten T-Zellen (J14) mit der Verwendung von FACS auf die Expression der fluoreszierenden Proteine ​​(Abbildung 1) zu bestimmen, analysiert. T-Zellen mit den markierten Signalproteine ​​MCFP-Nck und SLP76-mYFP transfiziert wurden Aktivieren Folien aufgebracht und abgebildet während T-Zell-Spreizung (Abbildung 2). Gesammelte Bilder zeigen die Dynamik von Protein-Lokalisierun...

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Diskussion

Die Regulation und Funktion von mehreren zellulären Prozessen abhängig von der Bildung und Auflösung von Protein-Protein-Interaktionen. Mikroskopische Bildgebung ermöglicht die Echtzeit-Tracking von fluoreszierend markierten Proteinen in lebenden Zellen. Kolokalisation markierter Proteine ​​deuten auf eine direkte oder indirekte Wechselwirkung zwischen den Proteinen und kann verwendet werden, um Erkenntnisse durch biochemische Methoden wie Immunpräzipitation erhalten verstärken. Im Gegensatz zu biochemischen Methoden er...

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Offenlegungen

Wir haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Danksagungen

Die Autoren danken Sophia Fried für die technische Unterstützung. MBS dankt den folgenden Organisationen für ihre Unterstützung der Forschung: Die Israel Science Foundation für Finanzhilfen no.1659/08, 971/08 1503/08 und 491/10, die Ministerien für Gesundheit & Science Zuschüsse Nr. 3-4114 und 3-6540, die Israel Cancer Association durch das Anwesen des verstorbenen Alexander Smidoda und die Taubenblatt Family Foundation für die Bio-Medizin Exzellenz Zuschuss.

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Materialien

Ausrüstung
Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenz/Material
Amaxa humanes T-Zell-Nukleofector-KitLonzaVCA-1002
Anti CD3 (UCHT1-Klon) BioLegend300432
Falcon FACS RöhrchenBecton Dickinson352058
FCSHyCloneSV30160.03
G418Calbiochem345810
Deutsches Deckglassystem 4-Kammer-Objektträger Lab-Tek II155382
HClBio Lab8410501
Hepes Biological Industries03-025-1B
HygomycinEnzoALX-380-306
L-Glutamin SigmaG7513
PBS (10X)SigmaD1408
Penicillin-Streptomycin SigmaP0781
Poly-L-Lysin 0,1 % (w/v) in H2OSigmaP8920
RPMISigmaR87589
NatriumazidSigmaS2002<
Accublock digitales TrockenbadLabnetD1105A
ZentrifugeEppendorfCentrifuge 5810 R
KonfokalmikroskopZeissLSM 510 Meta
Beheizbarer Montagerahmen - Heizeinsatz P S PeCon130-800-031
TempModule S (erforderlich für den beheizbaren Montagerahmen)Zeiss411860-9010-000
ElektroporationsgerätAmaxaNucleofector I
Fluoreszenzaktivierter ZellsortiererBecton DickinsonFACSVantage SE
BildanalysesoftwareBitplane7.0.0
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Referenzen

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  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3(2012).

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Nachdrucke und Genehmigungen

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