Umweltfreundliche kontrollierten Microtensile Testing von mechanisch-adaptive Polymer-Nanokomposite für Ex vivo Charakterisierung

Summary

Es wird ein Verfahren beschrieben, mit denen die In vivo Mechanische Verhalten des stimulierbaren Materialien als eine Funktion der Zeit überwacht. Die Proben werden getestet Ex vivo Mit einem Microtensile Tester mit Umwelt-Kontrollen, um die physiologische Umgebung zu simulieren. Diese Arbeit weiter fördert das Verständnis der In vivo Verhalten unseres Materials.

Abstract

Implantierbare Mikrovorrichtungen gewinnen große Aufmerksamkeit für mehrere biomedizinische Anwendungen ^1-4. Solche Geräte sind aus einer Reihe von Materialien, die jeweils ihre eigenen Vor-und Nachteile ^5,6 worden. Am bekanntesten ist, durch die Vorrichtung im Mikromaßstab Abmessungen wird ein hoher E-Modul erforderlich ist, um die Implantation in lebendes Gewebe zu erleichtern. Umgekehrt sollte die Steifigkeit der Komponente entsprechen der umliegende Gewebe induzierte lokale Dehnung ^7-9 minimieren. Deshalb haben wir vor kurzem entwickelt eine neue Klasse von bio-inspirierten Materialien, um diese Anforderungen durch die Reaktion auf Reize aus der Umwelt mit einer Veränderung der mechanischen Eigenschaften ^10-14 erfüllen. Genauer gesagt, zeigt unsere Poly (Vinylacetat) Nanoverbundwerkstoff (PVAc-NC) eine Verringerung der Steifigkeit, wenn sie Wasser und hohen Temperaturen (zB Körpertemperatur) ausgesetzt. Leider gibt es einige Verfahren, um die Steifigkeit der Materialien in vivo ¹⁵ und mech quantifizierenanischer Tests außerhalb des physiologischen Umgebung erfordert oft große Proben ungeeignet für die Implantation. Ferner kann Stimuli-responsive Materialien schnell wieder ihre anfängliche Steifheit nach Explantation. Daher haben wir eine Methode, mit der die mechanischen Eigenschaften des implantierten Mikroproben ex vivo gemessen werden entwickelt, mit simulierten physiologischen Bedingungen gehalten mit Feuchtigkeit und Temperaturkontrolle ^13,16,17.

Zu diesem Zweck wurde eine eigene Microtensile Tester ausgelegt für mikro-Proben ^13,17 mit weit variierenden Young-Module (Bereich von 10 MPa bis 5 GPa). Da unser Interesse sind bei der Anwendung von PVAc-NC als biologisch adaptierbare neuronalen Testsubstrat ein Werkzeug, das mechanische Charakterisierung von Proben im Mikromaßstab notwendig war. Dieses Tool wurde angepasst, um Feuchtigkeit und Temperatur-Steuerung, die Probe minimiert Trocknen und Kühlen ^{17 vorzusehen.} Als Ergebnis der Mechanikeral Eigenschaften des explantierten Proben eng entsprechen denen der Probe unmittelbar vor der Explantation.

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, das quantitativ in vivo mechanischen Eigenschaften, insbesondere der Young-Modul, der auf äußere Reize reagieren, mechanisch adaptive Materialien auf Polymerbasis zu bewerten. Dies geschieht, indem zunächst die Umgebungsbedingungen, die eine Änderung in der Probe mechanische Eigenschaften nach der Explantation, ohne zu einer Verringerung der Steifigkeit der unabhängig von dem durch Implantation minimiert erreicht. Die Proben werden dann für die Implantation, die Bearbeitung und Prüfung (Abbildung 1A) hergestellt. Jede Probe wird in der Großhirnrinde von Ratten, die hier als explantierten Rattenhirn, für eine bestimmte Dauer (Abbildung 1B) vertreten implantiert. An diesem Punkt wird die Probe explantiert und sofort geladen in die Microtensile Tester, und dann einem Zugtest unterworfen (Abbildung1C). Nachfolgende Datenanalyse bietet einen Einblick in das mechanische Verhalten dieser innovativen Materialien in der Umgebung der Hirnrinde.

Protocol

1. Probenvorbereitung

1. Bereiten PVAc-NC mit einer Dicke im Bereich von 25-100 um unter Verwendung einer Lösung Gießen und Kompressionstechnik ^10-12.
2. Halten Folie auf einen Siliziumwafer durch Erhitzen auf einer Heizplatte für zwei Minuten bei 70 ° C (über der Glasübergangstemperatur), um einen innigen Kontakt zwischen der Folie und dem Wafer zu fördern. Dieser Schritt stellt sicher, dass die hergestellten Folie flach und an den Si-Wafer, die zur ebenen Mikrobearbeitungsprozesse ist bleibt.
3. Muster des Films in der Probe Geometrien durch Laser-Mikrobearbeitung (VLS 3.50, VersaLASER). Stellen Sie die direkten CO _2-write Lasermikrobearbeitung Parameter auf 1,0% Leistung (0,5 W), 4,0% Geschwindigkeit (56 mm / s), und 1.000 Impulsen pro Zoll ^13,16.
4. Pattern Proben, die verwendet werden, um Umgebungsbedingungen ("setup samples") in Form von Hundeknochen Strukturen aufzubauen mit seitlichen Polster Abmessungen 1,5 x 1,5 mm ² und Querträger dim werdenmaße 300 x 3000 um ^2, mit einer Dicke, die der des ganzen Films (Abbildung 2).
5. Muster die Proben für ex vivo-Experimente ("Implantat Probe") in Balken 300 um x 6 mm, mit einer Dicke, die der des Films.
6. Vorsichtig lösen die Proben aus dem Wafer mit einer Rasierklinge und Pinzette.
7. Für Probenhandling bereiten individuell bearbeiteten Acryl Halter entwickelt, um als Teil der Grip-System in der Microtensile Tester dienen. Laser-geätzten Markierungen zeigen die Mittellinie des Halters und 1,5 mm vom Ende. Legen Sie eine kleine Menge Sekundenkleber Gel-Kleber auf der Mittellinie des Acryl-Halter und sorgfältig einhalten eine 1,5 mm Länge des Implantats Probe auf dem Halter und überlappen die markierte Mittellinie (Abbildung 3). Jedes Implantat Probe erfordert eine Acryl-Halter. Achten Sie darauf, dass der Klebstoff-Gel nur entlang der 1,5 mm Länge des PVAc-NC mit dem acr eingehalten bleibtylic Inhaber. Andernfalls kann der Klebstoff Gel mit dem mechanischen Verhalten der Probe stören.
8. Entfernen Feuchtigkeit aus allen Proben, indem sie in einem Exsikkator für mindestens 24 Stunden.
9. Die Länge, Breite und Dicke Abmessungen der Proben unter Verwendung eines optischen Mikroskops.

2. Stellen Umgebungsbedingungen

1. Legen Sie eine trockene Probe in das Setup Microtensile Tester (siehe Abbildung 4), erster Einklemmen zwischen den mobilen Griffe, dann zwischen den festen Griff.
2. Montieren einer Luftbürste mit einem mit Wasser gefüllten Behälter in einer festen Position, wobei die Düse in Richtung der Microtensile Probe gerichtet. Verbinden Sie die Airbrush mit einem Luftkompressor via Kunststoffschlauch. Mit der Airbrush Düse vollständig geschlossen ist, auf dem Luft-Kompressor einzuschalten.
3. Beginnen zyklischen Microtensile Testverfahren, abwechselnd Zugbelastung (positive Stamm) und Stauchung (negative Dehnung), die auf ter Probe, dennoch innerhalb des linear-elastischen Bereich der Spannungs-Dehnungs-Diagramm. Für PVAc-NC wird die aufgebrachte Belastung auf weniger als 2% begrenzt. In der benutzerdefinierten Microtensile Tester in diesen Experimenten verwendet wurde der Stamm Rate gesteuert werden, während die erforderliche Kraft, um diese Belastung zu erreichen, wurde gemessen. Alternativ kann eine andere Einrichtung umfassen Steuern der angelegten Kraft während des Messens der resultierende Stamm.
4. Schrittweise Erhöhung der Strömung aus der Luft Bürstdüse und überwachen die Steigung der Spannungs-Dehnungs-Diagramm als Funktion der Menge an Strom aus der Luft Pinsel. Der maximale Strom, der nicht bewirkt, dass eine signifikant (> 10%) Verringerung des Elastizitätsmoduls über einen Zeitraum von 60 Sekunden ist der Pegel, der für die ex vivo-Experimente verwendet wird. An dieser Stelle, die Feuchtigkeit, die nicht benetzen einen trockenen Probe (und damit zu einer Verringerung des Elastizitätsmoduls beitragen), und minimiert auch die Probe nach dem Trocknen zu biologischen Flüssigkeiten in vivo ausgesetzt worden ESTAblished.
5. Messen Sie die Temperatur in der Nähe der Probe. Eine ideale Lösung, würde ein Thermoelement mit Digitalanzeige und durchgeführt werden, während die Airbrush in Betrieb ist. Stellen Sie die Intensität und Abstand der Wärmestrahler so dass die Temperatur der Probe auf 37 ° C, um physiologische Bedingungen entsprechen gehalten wird.

3. Vergleichen Environmental Control zu Non-Environmental Control

1. Tauchen Setup Proben für mindestens 30 min in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Nach dieser Zeit wird die Probe vollständig gesättigt und hat auf seinen minimalen Elastizitätsmodul wurde bei einer gegebenen Temperatur reduziert.
2. Schnell laden einer Probe in die Microtensile Tester und beginnen zyklischen Microtensile-Test, mit dem Air-Brush-off, während die Probe trocknet. Damit wird festgelegt, wie schnell die Probe trocknet unter nicht kontrollierten Bedingungen.
3. Legen Sie eine zweite PBS-gesättigten Setup Probe in die Microtensile Tester, und beginnen zyklischen Microtensile-Testmit der Luft Pinsel auf. Damit wird festgelegt, wie schnell die Probe trocknet unter kontrollierten Umgebungsbedingungen.

4. Probe Implantation und Explantation

1. Bringen Implantat Probe zu einem Mikromanipulators Klemme und Position senkrecht zur kortikalen Gewebe.
2. Vor dem Einsetzen halten Gewebe ausreichend feucht mit Kochsalzlösung bis zur Homogenität des Gewebes Mechanik gewährleisten.
3. Senken Sie die Polymer Probe in der Hirnrinde mit den Mikromanipulators Hand steuert. Lassen Sie die Proben in kortikalen Gewebe, bis der Ziel-Implantat Zeit, im allgemeinen zwischen 1 und 30 min. Um Gewebe vor dem Austrocknen für Zeitpunkte verhindern, dass über 5 min, leicht dab das Gewebe alle 5 min mit einer Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen.
4. Während die Sonde in der Hirnrinde implantiert wird, bereiten die Microtensile Tester zum Laden des momentan implantierten Probe, indem die Antriebsstange mit der Null-Verschiebung Position von 3,0 mm von der stationären Klemme Probe. Legen Sie auch die Luft Bürstdüseder Flow-Einstellung und der Strahlungswärme auf die ordnungsgemäße Intensität bestimmen in Schritt 2.4.
5. Am Ende der angegebenen Zeit Implantat, heben Sie die Sonde aus der Rinde mit den Mikromanipulators Hand steuert. Sofort und sorgfältig, entfernen Sie die Probe aus dem Mikromanipulators Klemme und laden in die Microtensile Tester, wie detaillierter in Schritt 5.2 beschrieben.

5. Microtensile Prüfung von Proben Implant

1. Um Zeit zu sparen nach der Explantation, sicherzustellen, dass die Microtensile Tester komplett um das Implantat Probe vor der Implantation zu akzeptieren, wie in Schritt 4.4 beschrieben ist.
2. Unmittelbar nach Explantation, laden Sie die Probe zwischen den beiden Sätzen von Microtensile Tester Schellen. Da die Probe in einer Acryl-Halter entwickelt, um als der oberen Hälfte eine Klammer dienen montiert ist, das Implantat Probe Montage auf dem mobilen Grip, Probe nach unten. Es ist wichtig, dass die Probe so angebracht ist, daß der Stamm ist applIED nur entlang der Länge der Sonde zu vermeiden, dass Drehmoment auf die Probe während des Tests. Als solche muss die Probe auf die Mitte jeder Klemme montiert zu werden, und die Klammern müssen auf gleicher Höhe mit Bezug aufeinander.
3. Einstellen der Probenposition, dass der Abstand zwischen den Klemmen 3.0 mm, und das Ende der Sonde in der festen Klemme angeordnet ist. Diese 3,0 mm Länge zwischen den Klemmen ist die Messlänge der Probe und wird in späteren Berechnungen verwendet werden, um die Belastung der Probe zu bestimmen.
4. Unmittelbar nach dem Befestigen der Probe zwischen den beiden Klemmen und innerhalb von 2 Minuten der Explantation von Nervengewebe, den Motor ein in Zugrichtung, um die Probe mit einer konstanten Geschwindigkeit (10 um / sec welche hier) längliche, bei gleichzeitiger Messung und Aufzeichnung der Dehnung der Probe (mit einer Verschiebung Indikator Mitutoyu 543-561) und die damit verbundenen Kraft (mit einer Wägezelle, Transducer Techniques MDB-2.5) erforderlich, um die Probe belasten.
6. Wiederholen der Microtensile-Test für jede Probe und / oder jeden Satz von Bedingungen (dh Insertion Zeit).

6. Data Analysis

1. Konvertieren der rohen Dehnung Daten Engineering Belastung, die auf das Implantat Probe, indem der Abstand der Dehnung durch die ursprüngliche Meßlänge, wie in Gleichung 1 beschrieben, wobei ε die angelegte Spannung, t die Zeit ist, d der Verschiebung von der Mikrometer gemessen Indikator, und L ₀ die anfängliche Messlänge der Probe:
   (1)
2. Konvertieren Sie die rohe Kraft Daten an den Engineering-Stress auf die Probe, indem die Kraft (in Newton), von der transverse Querschnittsfläche, wie in Gleichung 2 beschrieben:
   (2)
   wobei σ ist die Belastung der Probe, F die Kraft durch die Lastzelle (in Newton) gemessen wird, ist w ₀ die anfängliche Breite der Probe, und t ₀ die anfängliche Dicke der Probe.
3. Zeichnen Sie die Spannung (σ [t]) vs Dehnung (ε [t])-Kurve für jede Probe mit Hilfe eines Computerprogramms, wie z. B. Microsoft Excel.
4. Trennen Sie das linear-elastischen Teil der Handlung und Nutzung von Software-basierten Kurvenanpassung Werkzeuge, um die beste Passform Linie auf diesen Teil zu finden. Die Steigung der Regressionsgeraden entspricht der Young-Modul der Probe. Die isolierten Teil des Grundstücks sollte mindestens 10 Spannungs-Dehnungs-Punkte und sollte von dem Teil des Grundstücks, wo die Steigung am größten ist, entnommen werden.
5. Für zyklische Tests, wird der Young-Modul muss für jeden Zyklus bestimmt werden. Dies kann automatisiert oder manuell durchgeführt.
6. Für die zyklische Versuche, Grundstück der Young-Modul von jedem Zyklus als Funktion der Zeit. Dies zeigt, wie die gemessenen Modul mit der Zeit verändert, die anzeigt, wie schnell ein Setup Probe benetzt oder getrocknet ist.
7. Für Implantat Proben entspricht jeder Probe und der Implantation ein Zyklus der zyklischen Tests. Messen des Young-Moduls unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren für jedes Implantat Probe beschrieben.
8. Zeichnen Sie das Elastizitätsmodul im Vergleich Implantat Zeit. An diesem Punkt können Vergleiche benchtop Untersuchungen usw. hergestellt werden

Results

Die mechanischen Eigenschaften nahezu alle polymeren Materialien, einschließlich unserer PVAc-NC, sind von unter Einwirkung von Umgebungsbedingungen. Vor allem sind dies die Einwirkung von Hitze und Feuchtigkeit. Wenn ein Material durch die Aufnahme von Feuchtigkeit plastifiziert wird, oder einer thermischen Übergang, wird eine Verringerung des Elastizitätsmoduls. Bei der Herstellung der Feuchtigkeit und der Temperatur-kontrollierten Umgebung für die ex vivo-Probe mechanische Charakterisierung, ist es wichtig, ...

Discussion

Die Weiterentwicklung der implantierbaren biomedizinischen mikro-elektromechanische Systeme (bioMEMS) für die Interaktion mit biologischen Systemen ist motivierend, die Entwicklung neuer Materialien mit maßgeschneiderten Eigenschaften hoch. Einige dieser Materialien sind so konzipiert, um eine Änderung der Materialeigenschaften in Reaktion auf einen Reiz in der physiologischen Umgebung gefunden aufweisen. Eine kürzlich entwickelte Klasse von Materialien reagiert auf das Vorhandensein von Wasserstoff-Bindung bildenden Fl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siliziumwafer	University Wafer		Mechanische Qualität
Extrudierte Acrylplatte	Professionelle Kunststoffe	SACR 062EF	Dicke 0,062 "
Rasierklinge	McMaster-Carr	3962A3
Pinzette	McMaster-Carr	8384A47	#5 Spitze
Sekundenkleber Gel	Loctite	130380
Luft Bürste	Snap-on Industrie	BF175TA
Kompressor	Paasche	B002YKN8YO	D500
Thermoelement	Omega	HH12A
Heizplatte	Cimarec	SP131325Q
CO2 Direktschreiblaser	VersaLaser	3.5
Exsikkator	Fisher Scientific	08-595
Lampe			Sonderanfertigung
Mikrozugprüfgerät			Sonderanfertigung