Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Zusammenfassung

Astrozyten wurden erkannt, vielseitige beteiligten Zellen in grundlegender biologischer Prozesse, die wichtig für die normale Entwicklung des Gehirns und Funktion, und das zentrale Nervensystem Reparatur sein. Hier präsentieren wir ein schnelles Verfahren zur reinen Maus Astrozytenkulturen erhalten, um die Biologie dieser wichtigen Klasse von zentralen Nervensystems Zellen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Astrozyten sind eine reiche Zelltyp im Gehirn von Säugetieren, aber es bleibt noch viel über ihre molekularen und funktionellen Eigenschaften erlernt werden. In vitro Astrozyten Zellkultur-Systeme können verwendet werden, um die biologischen Funktionen dieser Gliazellen im Detail zu studieren. Dieses Video-Protokoll zeigt, wie reine Astrozyten durch Isolierung und Kultivierung von gemischten kortikalen Zellen der Maus Welpen zu erhalten. Die Methode basiert auf der Abwesenheit von lebensfähigen Neuronen und der Trennung von Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia, die drei wichtigsten glialen Zellpopulationen des zentralen Nervensystems, in Kultur. Repräsentative Bilder in den ersten Tagen der Kultur zeigen die Gegenwart einer gemischten Zellpopulation, und zeigen den Zeitpunkt, wann Astrozyten konfluent werden und sollte von Mikroglia und Oligodendrozyten getrennt werden. Darüber hinaus zeigen wir, Reinheit und astrozytären Morphologie der Astrozyten mit immunzytochemische Färbungen für gut etabliert undneu beschriebenen Astrozyten Marker. Diese Kultur kann leicht verwendet werden, um reine Maus Astrozyten und Astrozyten-konditioniertem Medium zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Astrozyten Biologie erhalten.

Einleitung

Astrozyten sind eine sehr reichliche Zelltyp im zentralen Nervensystem (ZNS). Das Verhältnis von Astrozyten mit Neuronen ist 1:3 im Cortex von Mäusen und Ratten, während es 1,4 Astrozyten pro Neuron im menschlichen Hirnrinde ¹ sind. Das Interesse an Astrozytenfunktion hat sich in den letzten Jahren zugenommen. Eine wichtige Funktion der Astrozyten ist ihre Rolle bei der Bereitstellung von strukturellen und metabolischen Unterstützung Neuronen ^2,3. Neu entdeckte Rollen für Astrozyten decken ein breites Spektrum von Funktionen. Dazu gehören Führen des Migration von Axonen und die Entwicklung bestimmter Neuroblasten während der Entwicklung ^4-6....

Protokoll

Ein. Isolierung und Beschichtung von Mixed kortikalen Zellen

Mixed kortikalen Zellen Isolierung für Astrozytenkulturen kann mit P1 bis P4 Maus Welpen werden. Um eine ordnungsgemäße Astrozyten Dichte zu erreichen ist es notwendig, 4 Maus pup Kortex pro T75 Zellkulturflasche verwenden. Daher werden in der folgenden Volumina Protokoll für ein Zellpräparat unter Verwendung von 4 Maus Jungtieren berechnet.

1. Vor Beginn des Verfahrens Dissektion, vorwärmen 30 ml Astrozyten Kulturmedien (DMEM, hohe Glucose + 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum + 1% Penicillin / Streptomycin; siehe Tabelle) bis 37 ° C Mantel ein T75-Flasche mit 20....

Ergebnisse

Nach Isolierung des gesamten Gehirn der Maus (Abbildung 1A), das Kleinhirn und die Riechkolben müssen entfernt (Abbildung 1B) werden. Die Rinden werden mit der Maus Hirnstamm (1C) und der Hirnhäute der einzelnen Kortex (1D) geschält werden sorgfältig entfernt (1E). Hirnhäute sind offensichtlich durch die meningea und unvollständige Entfernung führt zur Verunreinigung der endgültigen Astrozyten Kultur meningealen Zellen und Fibroblasten........

Diskussion

Die beschriebene Methode ist hier auf der Astrozyten Kultur Zubereitung von Nagetieren neonatalen Gehirn, die ursprünglich von McCarthy und de Vellis in 1980 ²⁷ beschrieben ist. Die modifizierte Methode der Isolierung und Kultivierung von kortikalen Astrozyten aus postnatalen P1 bis P4 Maushirn hier vorgestellten ist schnell, liefert reines primären Astrozyten und ist hoch reproduzierbar. Diese Technik kann leicht übertragen Astrozyten aus anderen Spezies, wie zB von Ratte oder Schwein und von anderen Hirnreg.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name der Arbeitslösung	Firma	Katalog-Nummer	Endkonzentration
			Astrocyte Kulturmedien
DMEM, high glucose	Life Technologies	31966-021
FBS, hitzeinaktiviertes	Life Technologies	10082-147	Endkonzentration: 10%
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122	Endkonzentration: 1%
			Lösung für Hirngewebe digestion
HBSS	Life Technologies	14170-088
2,5% Trypsin	Life Technologies	15090-046	Endkonzentration: 0,25%
			Andere
70% (Vol / Vol) Ethanol	Roth	9065,2
Poly-D-Lysin	Millipore	A-003-E	50 ug / ml
Wasser	PAA	S15-012	Zellkultur
PBS	PAA	H15-002	Zellkultur
0,05% Versuchenpsin-EDTA	Life Technologies	25300-062
0,45 um Sterilfilter	Sartorius	16555
3,5 cm Petrischale	BD Falcon	353001
15 ml-Falcon-Röhrchen	BD Falcon	352096
50 ml-Falcon-Röhrchen	BD Falcon	352070
75 cm 2 Zellkulturflasche	BD Falcon	353136
Pinzette, feine	Dumont	2-1032; 2-1033	# 3c; # 5
Pinzette, flache Spitze	KLS Martin	12-120-11
13 cm chirurgische Scheren	Aesculap	BC-140-R
Stereomikroskop	Leica		MZ7.5
Stereomikroskop + Kamera	Leica		MZ16F; DFC320
Microscope + Kamera	Zeiss, Canon		Primo Vert; PowerShot A650 IS
Zentrifugieren	Eppendorf	5805000.017	Centrifuge5804R
Orbitalschüttler	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Wasserbad	Julabo		SW20, 37 ° C