Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Summary

Ein neuartiges Protokoll für die mechanische Aufbereitung von Hoden Zellsuspensionen von Nagetier Material, die Vermeidung Enzyme und Reinigungsmittel, beschrieben. Das Verfahren ist sehr einfach, schnell, reproduzierbar und macht gute Qualität Zellsuspensionen, die sich für Durchfluss Sortier-und RNA-Extraktion sind.

Abstract

Mammalian Hoden sehr komplexe Organe, die mehr als 30 verschiedenen Zelltypen, einschließlich somatischen Zellen und Hoden verschiedenen Stadien der Keimbahn-Zellen enthalten. Diese Heterogenität ist ein wichtiger Nachteil bezüglich der Studie von den Basen der Säuger Spermatogenese, als reiner oder angereicherter Zellpopulationen in bestimmten Stadien der Entwicklung der Spermien für die meisten molekularen Analysen ¹ benötigt.

Verschiedene Strategien wie Staput ^2,3, zentrifugale Elutriation ¹ und Durchflusszytometrie (FC) ^4,5 wurden eingesetzt, um angereichert oder gereinigt Hoden Zellpopulationen zu erhalten, um differentiellen Genexpression Studien zu ermöglichen.

Es ist erforderlich, dass die Zellen in Suspension für die meisten Anreicherung / Reinigung möglich sind. Im Idealfall wird die Zellsuspension werden Vertreter des ursprünglichen Gewebes, haben einen hohen Anteil an lebensfähigen Zellen und nur wenige multinucleates - die dazu neigen, wegen der Form,Syncytial Natur des Samenepithels ^6,7 - und der Mangel Zellklumpen ^1. Frühere Berichte hatten bewiesen, dass Hoden Zellsuspensionen von einem ausschließlich mechanischen Verfahren hergestellt leichter verklumpt als diejenigen trypsinierten ^1. Auf der anderen Seite, enzymatische Behandlungen mit RNasen und / oder Disaggregation Enzyme wie Trypsin und Collagenase führen zu Makromolekülen Abbau, was für die bestimmten Downstream-Anwendungen ist. Der ideale Prozess sollte so kurz wie möglich und beinhalten minimale Manipulation, um so eine gute Erhaltung der Makromoleküle von Interesse, wie mRNAs zu erreichen. Diese Protokolle zur Herstellung von Zellsuspensionen aus festen Geweben sind in der Regel zeitaufwendig, sehr bedienerabhängige und wahlweise beschädigen bestimmten Zelltypen ^1,8.

Das Protokoll hier vereint die Vorteile einer hoch reproduzierbar und extrem kurzen mechanischen Aufschluss mit dem einbsence der enzymatischen Behandlung, was eine gute Qualität Zellsuspensionen, die für die durchflusszytometrische Analyse und Sortierung ⁴ und anderweitige Genexpressionsstudien ⁹ verwendet werden kann.

Protocol

1. Herstellung von Zellsuspensionen

1. Sacrifice die Probe entsprechend den Empfehlungen der Fachausschüsse wie IACUC oder gleichwertig verwendet werden (in Uruguay, Nationale Kommission für Tierversuche [CNEA]). In unserem Fall wurde eine Überdosis Pentobarbital verabreicht.
2. Präparieren Sie die Hoden nach der Norm zulässigen Verfahren und legen Sie sie in einem 96 mm Glas Petrischale auf Eis, mit 10 ml eiskaltem DMEM ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum.
3. Entfernen Sie die Tunica albuginea und schneiden Sie die entkapselten Hoden in quadratische Stücke von 2 - 3 mm auf jeder Seite.
4. Diese Stücke werden dann in einem Medimachine eine automatisierte mechanische Mühle, wo das Gewebe in einer austauschbaren Einheit, die eine perforierte Edelstahlsieb und ein Metall Rotor aufgeschlüsselt verarbeitet wird. 5 dieser Stücke in einem 50 um Einweg-Einheit, Schalter auf der disaggregator und Prozess - Um dies zu tun, Platz 1 ml kaltem DMEM und 4 ergänzt für 50 Sekunden die folgenden, einfachen Anweisungen des Herstellers.
5. Wiederherstellen der resultierende Zellsuspension aus der Aufschlüsselung Gerät mit einer 3 - 5 ml Spritze ohne Nadel.
6. Man filtriert durch ein 50 um Nylon-Mesh, vorher eingeweicht mit 0,5 ml DMEM ergänzt.
7. Filtern Sie die Suspension wieder mit einem getränkten 25 um Nylon-Mesh und auf Eis stellen.
8. Zählen in einer Neubauer-Kammer und stellen zelluläre Konzentration auf 1 - 2 x 10 ⁷ Zellen / ml mit DMEM ergänzt. Mindestens 4 x 10 ⁷ Zellen / Gramm Hoden Material werden üblicherweise erhalten.
9. Schließlich, fügen NDA (2-naphthol-6 ,8-disulfonsäure Dikaliumsalz) bis zu einer Endkonzentration von 0,2%, um Zelle Verklumpung verhindern.
10. Optional: Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen der Hoden Zellsuspensionen mit einem kommerziell erhältlichen Kit Lebensfähigkeit für tierische Zellen, nach den Anweisungen des Herstellers.

2. Durchflusszytometrieanalyse

ve_content "> Wir haben ein Becton-Dickinson FACSVantage Durchflusszytometer mit einer kohärenten Argon-Ionen-Laser Resonanz bei 488 nm für die Analyse von Zellen mit hohen Konzentrationen von Propidiumiodid (PI) gefärbt emittieren eingesetzt wird. ausgestellt (PI Eintritt in unfixierten Zellen unter Stress wurde an anderer Stelle ^9,10) gerichtet.

1. Für PI-Färbung, fügen Fluorochrom in einer Endkonzentration von 50 ug / ml der Zellsuspension, und Inkubation für 10 min bei 0 ° C in der Dunkelheit.
2. Laserleistung bis 100 mW und einen 575/26 Bandpass-Filter verwendet wird, um PI-emittierten Fluoreszenz in FL2 sammeln eingestellt.
3. Wir führen FC Messungen mit einem 70 um Düse. Für die Sortierung Spermatozyte Populationen gesetzt Sortierung Modus Normales-R oder normal-C, unter Verwendung von 3 sortiert Tropfen als Umschlag. Halten Sie Probe und Sammlung Röhrchen bei 3-4 ° C unter Verwendung einer Kühleinheit. Einstellen Probe Differential an Zellen mit einer Geschwindigkeit von 500 bis 1500 pro Sekunde zu analysieren.
4. Verwenden CellQuest Software (BD) zu analysieren,die folgenden Parameter: forward scatter (FSC-H); Seitwärtsstreuung (SSC-H); insgesamt emittierten Fluoreszenz-oder Puls-Bereich (FL2-A) und Dauer der Fluoreszenz-Emission oder Puls-Weiten (FL2-W).

Alternativ haben wir die vitalen Farbstoff Hoechst 33342 in einer Endkonzentration von 5 ug / ml eingesetzt und inkubiert 10 min bei 37 ° C im Dunkeln. Zelle Analyse wurde mittels eines MoFlo Zytometer (DakoCytomation), ausgestattet mit einem UV-Anregungswellenlänge Laser, der bei 25 mW und mit einer Düse 70 um erfolgt. Datenmanipulation wurde mit Summit v4.3 Software (DakoCytomation) durchgeführt.

Results

Ein Beispiel für ein gut aufgeschlüsselten Zellsuspension aus Rattenhoden mit dem hier beschriebenen Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

Im Vergleich zur enzymatischen Behandlungen ^6,8 und den zuvor beschriebenen mechanischen Aufschluss Verfahren ² ist die hier vorgestellte viel schneller beinhaltet weniger Handhabung ist leicht reproduzierbar (nicht bedienerabhängige) und macht knapp Zelltrümmer (insbesondere im Vergleich zu anderen mechanischen ...

Discussion

Die optimierte hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Herstellung von Zellsuspensionen aus Nagetier Hodengewebe in einem sehr schnellen und reproduzierbaren Weise vermeiden Enzym und Reinigungsmittel Behandlung und das Beibehalten der guten Integrität der Zelle und Art Proportionen. Die Kürze des Verfahrens (die 15 min Spannweite umfasst Hoden Dissektion, Schneiden von Gewebe und Verarbeitung), Aufwand ist minimal, und das Fehlen von enzymatischen Behandlungen sind nur einige der wichtigsten Vorteile. All dies würde...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medimachine System	BD	340587
Medicon Einheit (50 μ m)	BD	340591
Filcon-Einheit (50 μ m)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fötales Kälberserum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
H– chst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stammlösung 5 mg/ml; verwendet in einer Endkonzentration von 5 μm; g/ml
Propidiumiodid	Sigma-Aldrich	287075	Stammlösung 1 mg/ml; verwendet in einer Endkonzentration von 50 μm; g/ml