Summary
Vi beskriver et kvalitativt assay til overvågning af bakteriel konkurrence medieret af
Abstract
Type VI sekretionssystemer (T6SSs) er molekylære nanomaskiner tillader gramnegative bakterier at transportere og tilføre proteiner i en lang række af målceller 1,2. Den T6SS består af 13 centrale komponenter og viser strukturelle ligheder med halen-rør af bakteriofager 3. Fagen anvender et rør og en punkteringsindretningen til at gennemtrænge cellekappe af målbakterier og injicere DNA. Det foreslås, at T6SS er en omvendt bakteriofag indretning skabe en specifik bane i bakteriecellen kuvert at drive effektorer og toksiner til overfladen. Fremgangsmåden kan træffes yderligere, og T6SS enhed kunne perforere andre celler, som bakterien er i kontakt, hvorved indsprøjtning af effektorer til disse mål. Halen røret og punkteringsindretningen dele af T6SS er lavet med HCP og VgrG proteiner, henholdsvis 4,5.
Alsidigheden af T6SS er blevet demonstreret gennem studies under anvendelse af forskellige bakterielle patogener. De Vibrio cholerae T6SS kan omforme cytoskelettet af eukaryote værtsceller ved injektion af en "udviklet" VgrG bærer en C-terminal actin tværbinding domæne 6,7. Et andet slående eksempel blev for nylig dokumenteret ved hjælp af Pseudomonas aeruginosa, som er i stand til at målrette og dræbe bakterier i en T6SS-afhængig måde, derfor fremme etableringen af bakterier i specifikke mikrobielle nicher og konkurrencepræget miljø 8,9,10.
I sidstnævnte tilfælde har tre T6SS-udskilte proteiner, nemlig Tse1, Tse2 og Tse3 blevet identificeret som toksiner injiceret i den pågældende bakterie (figur 1). Donorcellen er beskyttet mod den skadelige virkning af disse effektorer via en anti-toksin mekanisme, medieret af de Tsi1, Tsi2 og Tsi3 immunitet proteiner 8,9,10. Denne antimikrobielle aktivitet kan overvåges når T6SS-dygtige bakterier dyrkes sammen på sOlid overflader i konkurrence med andre bakteriearter eller med T6SS-inaktive bakterier af samme art 8,11,12,13.
De tilgængelige data understregede en numerisk tilgang til den bakterielle konkurrence-assay, herunder tidskrævende CFU optælling, der i høj grad afhængig antibiotiske beslutningstagere. I tilfælde af antibiotikaresistente stammer som P. aeruginosa, kan disse metoder være upassende. Desuden med identifikation af omkring 200 forskellige T6SS loci i mere end 100 bakterielle genomer 14, er en bekvem screening særdeles ønskelig. Vi udviklede et assay, der er let at anvende og kræver standard laboratorieudstyr og-reagenser. Fremgangsmåden giver en hurtig og kvalitativ teknik til at overvåge T6SS-bakteriedræbende / bakteriostase aktivitet ved hjælp af et reporter-stamme som en bytte (i dette tilfælde Escherichia coli DH5a), der tillader a-komplementering af lacZ-genet. Samlet set er denne fremgangsmåde grapHIC og muliggør hurtig kortlægning af T6SS-relaterede fænotyper på agarplader. Denne forsøgsprotokol kan tilpasses til andre stammer eller bakterielle arter under hensyntagen til særlige betingelser, såsom vækstmedium, temperatur eller tid for kontakt.
Protocol
1. Bakteriestammer og kulturer
- Konstruere en Escherichia coli recipientcelle (Prey, P) ved at omdanne (under anvendelse af standard CaCl2 behandling eller elektroporering) 15 E. coli DH5a celler med et plasmid tillader a-komplementering af lacZ-genet (tabel 1). Pladen de transformerede celler på Luria-Bertani agarplader (LBA, 1,5% agar) indeholdende 5-brom-4-chlor-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) ved 40 mg / ml slutkoncentration og passende antibiotika. Inkuber ved 37 ° C natten over, og den følgende morgen selektere for blå transformanter (se § 1.3).
- Dyrke Pseudomonas aeruginosa donorceller, der er T6SS-aktive (D +) eller T6SS-inaktive (D-) (tabel 1) på LBA natten over ved 37 ° C. I eksemplet præsenteres her brugte vi en P. aeruginosa retS stamme besidderen grundlæggende aktiv H1-T6SS 16 og en isogen mutant med en deletion af H1-T6SS genklynge (tabel 1).
- Den næste dag, forberede en overnatskultur flydende kultur i beluftet kolbe ved at inokulere en lys blå klon blandt E. coli-transformanter (P) fra pladen beskrevet i § 1.1, i 5 ml Tryptic Soy Broth (TSB) suppleret med de passende antibiotika. Vokse under omrøring ved 37 ° C. Fortsæt ligeledes med en enkelt koloni af (D +) og (D -) fra pladen beskrevet i § 1.2.
2. Konkurrence-assay
- Forbered LBA-plader for den næste dag eksperimentet. Sørg for, at disse plader er korrekt tørret (enten i nærheden af bunsenbrænder eller i lagdelt stinkskab). Forbered en "Assay-input" (A-indgang) plade til stammerne (D +), (D -), og (P (D - + P) og (D + + P). Opdel og mærke pladerne i overensstemmelse hermed.
- Efter vækst natten (se § 1,3), måler den optiske densitet (OD 600 nm) af input bakteriekultur (D -, D + og P) og beregne volumen, der kræves for at opnå en celletæthed svarende til 1 enhed OD 600 nm af hver stamme . Hver "input" cellekultur (D -, D + og P) er grundlæggende opsamles i en steril 1,5 ml Eppendorf-rør.
- Centrifuger de bakterielle prøver ved 13.000 rpm i 1 min ved stuetemperatur og kassér supematanten.
- Resuspendere pellets D -, D + og P-kulturer i 100 ul frisk TSB ved forsigtig pipettering og inokulere 10 ml af hver tilsvarenderende stamme som en enkelt plet på "A-input" plade (fremstillet i § 2,1).
- Podes på "A-output" plade (fremstillet i § 2,1). Mere præcist, bland forsigtigt 30 fil af (D +) med 30 pi (P) og 30 pi (D -) med 30 ml (P) i to separate Eppendorf-rør (bemærk, at de anvendte kulturer er beskrevet i § 2.4) . Inokulere 20 ul af blandingerne (D + / P) og (D - / P), som de enkelte steder på "A-output" plade. Lad pletterne tørre nærheden af en bunsenbrænder og placere pladen i en inkubator ved 37 ° C i et passende tidsrum, hvor den bakterielle drab finder sted. I tilfælde af P. aeruginosa, er en effektiv bakteriel drab observeret efter 5 timers inkubering når man sammenligner en T6SS aktive med en T6SS defekt stamme.
3. Kvalitativ Observation af than Bakteriel Killing
- Forbered LBA plader indeholdende 40 ug / ml X-gal for udlæsningen af analysen. Pladerne vil blive kaldt "Udlæsning input" eller "R-input" til at spotte isolerede bakterier eller "Udlæsning output" eller "R-output" til at spotte blandede bakteriekulturer og dermed læse det dræbende ydeevne. Disse plader skal også være ordentligt tørret. Opdel pladen i fire lige store dele på ryggen og anmærke disse dele 0, 10 -1, 10 -2 og 10 -3, udpegning af fortyndinger af bakteriekultur til at spotte på agarpladerne (se § 3,3). Fortyndingen vil give en semikvantitativ vurdering af den blå / hvid bakterier forholdet i det samme sted.
- Saml med en steril loop de individuelle bakterielle spots fra "A-input" plade (se § 2,4) og "A-output" plade (se § 2,5) og resuspender hver plet i særskilte 1,5 ml Eppendorf-rør indeholdende 1 ml TSB. Anbring i en Eppendorf ryster blok i løbet af 30 min at resuspendere effektivtbakterier.
- Der fremstilles en serie på 5 gange 3 Eppendorf-rør indeholdende 900 pi TSB og videre for hver resuspenderet plet til ti gange serielle fortyndinger op til 10 -3. Sørg for at ændre pipettespidser og vortex 5 sekunder mellem hver fortynding skridt.
- Fortsæt til spotting af dine bakterielle fortyndinger fremstillet i § 3,3 om veltørrede LBA plader indeholdende 40 pg / ml X-gal ved at starte med den mest fortyndede til ufortyndet suspension, hvilket gør disse de "R-input" plader til "A -input "pletter og" R-output "plader for" A-output "pletter (figur 2). Vortex kortvarigt hvert rør før du fortsætter til spotting at holde en homogen bakteriel suspension. For reproducerbarhed af resultaterne, spot 20 ul in triplo i en kvadrant (figur 2). Den relative tørhed af din tallerken er vigtigt på dette tidspunkt, da pletterne er nødt til at forblive individuelt adskilt på tallerkenen og ikke glider mod hinanden.
En kvantificering af kompetitivt assay er også muligt på dette tidspunkt af eksperimentet. Efter trin 3.3, spredes 100 pi fortyndings 10 -3 til LBA plader indeholdende 40 ug / ml X-gal. For reproducerbarhed af resultaterne, skal du fortsætte til en plating i tre eksemplarer for hver plet fra "A-output" plade. Placere fortynding pladerne i en 37 ° C inkubator natten over (svarende til 16 timers inkubering). Fortsæt til optællingen af de blå kolonier (P-celler, der forblev i live). Typiske resultater opnået efter 5 timer af konkurrencen er vist i figur 3.. - Forlade pladen åben (ikke låg) i en steril zone for at tillade absorption af væsken i overskud i hver plet.
- Pladen anbringes i en 37 ° C inkubator natten over. Under denne inkubering tid, er drab stadig forekommer i blandingen (D + / P), idet begge stammer er stadig i kontakt.
- Tag et billedeeller scanne dine plader til output analyse (figur 2). Hvor spots stort set blå indikerer det, at E. coli er ikke blevet dræbt af P. aeruginosa. Dette er tilfældet, når E. coli blandes med en T6SS-defekt P. aeruginosa stamme (D-) (figur 2, pladen nederst til højre).
Representative Results
Typiske resultater er vist i figur 1 med stammerne og reagenser beskrevet i tabel 1. Pladerne er vist i denne figur blev scannet Efter inkubation natten over. De "Readout-Input"-plader viser en seriefortynding mønster for de stammer, der anvendes i dette assay. Som forventet E. coli bytte pletter (P) overekspression af lacZ-genet forekommer blå på medier suppleret med X-gal, mens donor P. aeruginosa stammer (D +, T6SS aktiv) og (D -, T6SS inaktiv) forbliver hvid. De "Udlæsning-output" plader, som mix mellem bytte og en T6SS aktiv stamme (D + / P) er blevet spottet vise forsvinden af den blå bytte således indikerer den er blevet dræbt. Dette viser evnen af donoren til at udkonkurrere byttet. Den fortsatte den blå farve på (D - / P) plade demonstrerer den manglende evne af et inaktivt T6SS donor at dræbe den blå bytte.
Figur 1. Drab af E. coli ved T6SS-dygtige P. aeruginosa. P. aeruginosa sprøjter giftstoffer i E. coli målcelle i en T6SS-afhængig måde (vist med hvid pil). To toksiner Tse1 og Tse3 (orange og røde cirkler) er sprøjtet ind i E. coli periplasmaet og forringer peptidoglycan 9. The Tse2 toksin (gul cirkel) injiceres i E. coli cytoplasma og har en bakteriostatisk aktivitet 8,10. Den kombinerede virkning af de giftstoffer dræber målcellerne (lyn og kraniet). Det overlevelsen af målceller kan påvises ved at overvåge aktiviteten af den producerede β-galactosidase (se også figur 2). P. aeruginosa er beskyttet mod aktiviteten af de giftstoffer, som immunitet proteinerne Tsi1, Tsi2 og Tsi3 (orange, gule og røde firkanter, henholdsvis) 8,9,10.
Figur 2. Agarplade assay til overvågning T6SS-afhængig bakteriel drab På denne figur er vist på den øverste del en "Timer-Input"-plader bestående af serielle fortyndinger af D -., D + og P inputceller. P inputceller er blå på grund af α-komplementering af lacZ-genet og således producerede β-galactosidase, som spalter X-gal. I den nedre del er vist en "Timer-Output" plader bestående af seriefortyndinger af det bakterielle blanding mellem en aktiv (D + / P) (D - / P), T6SS donor P. aeruginosa stamme med E. coli bytte. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Kvantificering af drab af E. coli by P. aeruginosa efter 5 timers inkubering. Grafen viser CFU optælling af E. coli er beskrevet i 3,4 trin. Resultaterne præsenteret her viser en 3-fold forskel mellem T6SS + og T6SS-stammer, hvilket antyder, at det meste af drabet finder sted under de 5 første timers kontakt.
Discussion
Den metode præsenteres i denne artikel giver mulighed for en visuel observation af T6SS-baktericid / bakteriostase aktivitet. Assayet udføres på overfladen af en agarplade. Det er tidligere blevet vist, at T6SS-afhængige drab-assay udført med blandet bakteriel flydende kultur ikke er effektivt, sandsynligvis på grund af manglen på stabil kontakt mellem de to bakterier 8. The T6SS menes at operere med en mekanisme, beslægtet med den, som bakteriofager at injicere DNA i målceller 17. I flydende kultur kan den rørlignende struktur af T6SS brækker lettere, kan inter-bakteriel kontakt gå tabt, og toksiner er ikke effektivt leveret.
Med hensyn til inkubationstider, er de 5 første timer af kontakt, vi beskriver mellem donor stamme og bytte tilstrækkeligt at bemærke bakteriel drab mellem P. aeruginosa og E. coli, som illustreret i figur 3
Da denne metode er en farve baseret teknik kan produktionen resultater blive kompromitteret af pigmentering af donor-stammen. For eksempel i tilfælde af P. aeruginosa, visse stammer producerer høje niveauer af farvepigmenter som pyocyanin og pyoverdine, som kan forstyrre assayet udlæsning, at skelne fra bytte relativt vanskelig. Andre chromogene β-galactosidase-substrater, såsom magenta-gal eller det røde-gal, kan anvendes i stedet for X-gal (tabel 1).
The kompetitivt assay kan gøre brug af andre reportergener for udlæsningen. For eksempel har lignende assay ligeledes udført ved anvendelse af grønt fluorescerende protein-mærket byttedyr 12.
Vores analyse, mens ikke kvantitativ, giver en god indikationDen T6SS aktivitet, da den er baseret på overlevelsen eller aflivning af et reporter-bytte. Denne teknik har den fordel at være nem og bekvem at evaluere den baktericide / bakteriostase aktivitet af T6SSs fra alle bakteriearter. Hidtil har aktiviteten af T6SS vist imod gram-negative bakterier og nogen klar eksempel på T6SS-følsomme grampositive bakterier er blevet rapporteret endnu 12. Det er også klart, at uforenelighed i kulturen af de forskellige bakteriearter at prøve (f.eks væksttemperatur, iltnings, specifikke medier) betragtes.
Vores analyse kan også anvendes til at vurdere, hvilke af de T6SS komponenter er absolut nødvendigt, da selv spor af et udskilt toksin kan være tilstrækkelig til at dræbe byttet. Selv svage aktivitet af T6SS kunne så tydeligt påvises ved vores assay, sammenlignet med standard procedure test T6SS-afhængig sekretion ved hjælp af kultursupernatant og Western blotanalyse. Imidlertid er en passende kolonidannende enheder (CFU) optælling stadig behov for nøjagtig kvantificering af denne T6SS aktivitet.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Wellcome Trust tilskud WT091939MA. Alain Filloux er støttet af Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS) |
Lab strain | Described in Reference 16 | |
| P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D-)(inactive T6SS) | This study | The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3', and 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3'. The Down fragment primers : 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3', 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' |
|
| E.coli DH5α | Invitrogen | 18258-012 | F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 |
| pBluescript II SK(+) | Agilent | 212205 | This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation. |
| X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Use at 40 μg/ml |
| Luria Bertani agar | Merck-chemicals | 1.10283.0500 | |
| TSB (casein soya bean broth) | Oxoid | CM109 | |
| Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| Scanner | Epson | V700 | |
| Spectrophotometer | WPA Biowave | CO8000 Cell Density Meter | |
| Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
| Red-gal | Research organics | 1364c | |
Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used. |
|||
References
- Filloux, A., et al. The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes. Microbiology. 154 (6), 1570 (2008).
- Cascales, E., Cambillau, C. Structural biology of type VI secretion systems. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102 (2012).
- Leiman, P. G., et al. Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers. Virol. J. 7, 355 (2010).
- Ballister, E. R., et al. In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733 (2008).
- Leiman, P. G., et al. Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154 (2009).
- Pukatzki, S., et al. Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508 (2007).
- Ma, A. T., et al. Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells. Cell Host Microbe. 5 (3), 234 (2009).
- Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25 (2010).
- Russell, A. B., et al. Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells. Nature. 475 (7356), 343 (2011).
- Li, M., et al. Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein. PLoS Pathog. 8 (4), e1002613 (2012).
- Zheng, J., et al. Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae. PLoS One. 6 (8), (2011).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathog. 6 (8), e23876 (2010).
- Murdoch, S. L., et al. The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors. J. Bacteriol. 193 (21), 6057 (2011).
- Boyer, F., et al. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources? BMC Genomics. 10, 104 (2009).
- Maniatis, T., et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring, NY. (1982).
- Mougous, J. D., et al. A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus. Science. 312 (5779), 1526 (2006).
- Records, A. R., et al. The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery. Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751 (2011).
- Hachani, A., et al. Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins. J. Biol. Chem. 286 (14), 12317 (2011).
