Summary
Мы описываем качественного анализа для контроля бактериальной конкуренции при посредничестве
Protocol
1. Бактериальных штаммов и культур
- Инженер получателя кишечная палочка клетки (Prey, P) путем преобразования (с использованием стандартного лечения CaCl 2 или электропорации) 15 E. палочки DH5α клеток с плазмидой позволяющий-дополнения гена LacZ (табл. 1). Плита трансформированных клеток на Лурия-Bertani агаром (LBA, 1,5% агар), содержащих 5-бром-4-хлор-индолил-β-D-галактопиранозида (X-Gal) в дозе 40 мг / мл конечной концентрации и соответствующих антибиотиков. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи и на следующее утро выбрать для синих трансформантов (см. § 1.3).
- Расти синегнойной палочки донорских клеток, которые являются T6SS-активных (D +) или T6SS-неактивные (D-) (табл. 1) на LBA течение ночи при 37 ° C. В примере, представленном здесь мы использовали P. палочки Рец напрягать обладающихпостоянно активный H1-T6SS 16 и изогенных мутантов с делецией H1-T6SS кластера генов (табл. 1).
- На следующий день, готовить в течение ночи культуральной жидкости в колбе газированные путем посева ярко-синий клон среди E. палочки трансформантов (P) от пластины описаны в § 1.1, в 5 мл триптического соевого бульона (БСЭ) с добавлением соответствующего антибиотика. Вырастить при перемешивании при температуре 37 ° C. Приступить наравне с одной колонии (D +) и (D -) из табличке, описанной в § 1.2.
2. Анализ конкуренции
- Подготовка LBA пластин для следующего эксперимента день. Убедитесь, что эти пластины правильно сушат (либо рядом с горелкой Бунзена или в ламинарный шкаф потока). Подготовка "Анализ-вход" (A-Input) пластины для штаммов (D +), (D -) и (P (D - + P) и (D + + P). Разделяй и обозначения пластин соответственно.
- После ночного роста (см. § 1.3), измерение оптической плотности (OD 600 нм) входного бактериальной культуры (D - D + и P) и рассчитать объем необходимых для получения эквивалентной плотности клеток на 1 единицу OD 600 нм каждого штамма . Каждый «вход» культуре клеток (D - D + и P) первоначально собранные в 1,5 мл стерильного трубы Эппендорф.
- Центрифуга бактериальных образцов при 13000 оборотов в минуту в течение 1 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют гранул D - D +, и P культур, в 100 мкл свежей TSB осторожным пипетированием и прививать 10 мл каждая соответствуетсоответствующая деформации как одно пятно на кнопку "ввод" пластины (подготовленные в § 2.1).
- Привить "A-выход" пластины (подготовленные в § 2.1). Точнее, осторожно смешать 30 мкл (D +) с 30 мкл (Р) и 30 мкл (D -) с 30 мл (P) в двух отдельных труб Эппендорф (обратите внимание, что культуры использовали те, описанных в § 2.4) . Инокулировать 20 мкл смеси (D + / Р) и (D - / P) в виде отдельных пятен на "A-выход" пластины. Дайте высохнуть пятна около газовой горелки и поместите пластину в инкубаторе при температуре 37 ° C в течение соответствующего периода времени, в течение которого бактериальной убийство происходит. В случае P. палочки, эффективный бактериальный убийства наблюдается после 5 ч инкубации при сравнении с активными T6SS T6SS дефектных деформаций.
3. Качественные наблюдения тОн Бактериальные убийство
- Подготовка LBA пластины, содержащей 40 мкг / мл X-гал для считывания анализа. Пластинами будет называться "Считывание вход" или "R-вход" обнаружить изолированные бактерии или "считывание выхода" или "R-выход", чтобы определить смешанных бактериальных культур и, следовательно, читать убийства производительности. Эти пластины также должны быть правильно высушить. Разделите пластины в четыре равные части на спине и комментировать эти части 0, 10 -1, 10 -2 и 10 -3, обозначающий разведения бактериальной культуры обнаружить на агаром (см. § 3.3). Разведение позволит полу-количественной оценки синий / белый соотношение бактерий в том же месте.
- Соберите стерильной петлей отдельных бактериальных пятна от "входного" тарелка (см. § 2,4) и "выходом" тарелка (см. § 2,5) и ресуспендируют каждого места в различных трубах 1,5 мл Eppendorf, содержащий 1 мл TSB. Поместите в шейкер Eppendorf блок в течение 30 мин для ресуспендирования эффективнобактерии.
- Подготовить ряд в 5 раз 3 трубки Эппендорф, содержащий 900 мкл TSB и продолжить для каждого ресуспендированных место, чтобы десять раз серийных разведений до 10 -3. Убедитесь в том, чтобы изменить наконечники и вихрем 5 секунд между каждым шагом разведения.
- Приступить к кровянистые выделения из ваших бактериальных разведения подготовлен в § 3.3 на хорошо высушенные пластины LBA, содержащих 40 мкг / мл X-гал, начиная с самых разбавленных в неразбавленном подвески, что делает эти "R-вход" пластины для " -вход "пятен и" R-выход "пластины для" A-выходом "пятна (рис. 2). Vortex кратко каждую трубку, прежде чем приступить к кровянистые выделения держать однородной суспензии бактерий. Для воспроизводимости результатов, местная 20 мкл в трех экземплярах в квадранте (рис. 2). Относительная сухость вашей тарелке важно на данном этапе, поскольку пятна должны оставаться индивидуально разделенных на тарелке, а не скользить по отношению друг к другу.
Количественной оценки конкурентный анализ также возможно на этой стадии эксперимента. Вслед за шагом 3,3, распространились по 100 мкл разведения 10 -3 на пластинах LBA, содержащей 40 мкг / мл X-гал. Для воспроизводимости результатов, переходите к покрытие в трех экземплярах для каждого пятна от "выходом" пластины. Поместите разведении пластин при 37 ° C инкубаторе в течение ночи (соответствует 16 ч инкубации). Перейдем к подсчету синих колоний (P клетки, которые остались живы). Типичные результаты, полученные после 5 часов конкуренция показано на рисунке 3. - Оставьте пластину открытых (без крышки) в стерильную зону, чтобы поглощение жидкости в избыточных внутри каждого пятна.
- Поместите пластинку в 37 ° C инкубаторе в течение ночи. За это время инкубации, убийства, все еще происходит в смеси (D + / P), так как штаммы-прежнему находятся в контакте.
- Сфотографируйтеили сканирование пластин для выхода анализа (рис. 2). Где пятна остаются в основном синие это означает, что E. палочка не была убита P. палочки. Это тот случай, когда E. палочки, смешивают с T6SS дефектной P. палочки штамма (D-) (рис. 2, пластины в нижнем правом углу).
Representative Results
Типичные результаты приведены на рисунке 1 с деформациями и реагенты, описанные в таблице 1. Пластины показано на этом рисунке были проверены после инкубации в течение ночи. "Считывание-Input" тарелки показать серийный образец для разведения штаммов, используемых в этом анализе. Как и ожидалось, E. палочки охотятся пятна (P) гиперэкспрессией гена LacZ появляются синего цвета на среде с добавлением X-галлон, в то время как донор P. палочки штамма (D +, T6SS активной) и (D -, T6SS неактивные) остаются белыми. "Считывание-выход" пластины, на которой баланс между добычей и T6SS активной деформации (D + / P) была замечена показать исчезновения синего добычу таким образом, указав, что он был убит. Это свидетельствует о способности доноров вытеснять добычу. Сохранение синего цвета на (D - / P) пластина демонстрирует неспособность неактивных доноров T6SS, чтобы убить синего добычу.
Рисунок 1. Убийство E. палочки по T6SS-опытный P. палочки. P. палочки вводит токсинов в E. кишечной клетки-мишени в T6SS-зависимым способом (показано белой стрелкой). Два токсинов Tse1 и Tse3 (оранжевые и красные круги) вводят в E. периплазме палочки и ухудшают пептидогликана 9. Tse2 токсина (желтый круг) вводят в E. палочки цитоплазме и имеет бактериостатической активности 8,10. Комбинированное действие токсинов убивает клетки-мишени (вспышка молнии и черепа). Выживание клетки-мишени могут быть обнаружены путем наблюдения за деятельностью производится β-галактозидазы (см. также рис 2). P.eruginosa защищен от активности токсинов иммунитет белков Tsi1, TSI2 и Tsi3 (оранжевые, желтые и красные квадраты, соответственно), 8,9,10.
Рисунок 2. Анализ агар пластины для мониторинга T6SS зависит от бактериальных убийства На этом рисунке показано в верхней части "Считывание-Input" пластины, состоящие из последовательных разведениях D -., D +, и клетки P входа. Клетки P входных синего в связи с α-дополнения гена LacZ и таким образом производится β-галактозидазы, который расщепляет X-гал. В нижней части отображается "Считывание-выход" пластины, состоящие из последовательных разведений бактериальной сочетание между активным (+ D / P) (D - / P), T6SS доноров P. палочки штамма E. палочки добычу. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Количественное определение убийства Е. палочки П. палочки через 5 ч инкубации. график представляет подсчет КОЕ E. палочки описано в 3,4 шага. Приведенные результаты показывают, 3-кратная разница между T6SS + и T6SS-штаммов, предполагая, что большинство убийств происходит в течение 5 первые часы контакта.
Discussion
Метод, представленный в этой статье, позволяет визуальное наблюдение T6SS-опосредованной бактерицидные / бактериостаз деятельности. Анализ проводится на поверхности агара пластины. Ранее было показано, что T6SS-зависимых убийства анализ выполняется со смешанной бактериальной культуры жидкость не является эффективным, вероятно, из-за отсутствия устойчивых контактов между двумя бактериями 8. T6SS Считается, что работать с механизмом сродни той, которая используется бактериофагов для введения ДНК в клетки-мишени 17. В культуральной жидкости, трубы, как структура T6SS может сломать легче, между бактериальным контакт может быть потерян, и токсины, эффективно не доставлено.
С точки зрения времени инкубации, 5 первые часы контакта, который мы описываем между штамма донора и добычу достаточно, чтобы наблюдать бактериальных убийства между P. палочки и E. палочки, как показано на рисунке 3
Поскольку этот метод является цветом на основе техники, выходной результат может быть скомпрометирована пигментации донора штамма. Например, в случае P. палочка, некоторые штаммы продуцируют высокие уровни цветные пигменты, такие как пиоцианина и pyoverdine, которая может повлиять на анализ считывания, делая отличие от добычи довольно трудно. Другие хромогенных β-галактозидазы субстратов, таких как пурпурный-гал или красно-гал, могут быть использованы вместо X-галлон (табл. 1).
Анализ конкуренции могут воспользоваться другие гены репортер считывания. Например, подобный анализ был также выполняется с помощью зеленого флуоресцентного белка-меченных жертв 12.
Наш анализ, а не количественный, дает хорошее представлениеиз T6SS деятельности, поскольку она основана на выживание или убийстве репортера добычу. Эта техника представляет то преимущество, что легко и удобно для оценки бактерицидного / бактериостаз деятельности T6SSs от любых видов бактерий. До сих пор деятельность T6SS было показано в отношении грамотрицательных бактерий и не яркий пример T6SS чувствительных грамположительных бактерий, сообщалось еще 12. Очевидно также, что несовместимость в культуру различных видов бактерий для тестирования (например, рост температуры, кислорода, конкретные носители) должен быть рассмотрен.
Наш анализ также может быть использован для оценки, какие из T6SS компоненты являются абсолютно необходимыми, так как даже следы выделяется токсин может быть достаточно, чтобы убить жертву. Даже слабая активность T6SS может то, очевидно, быть обнаружен нашими анализа по сравнению со стандартной процедуре тестирования T6SS-зависимой секреции использованием супернатанта культуры и вестерн-блотанализа. Тем не менее, надлежащее колониеобразующих единицы (КОЕ) счета-прежнему необходимо для точной количественной оценки этой T6SS деятельности.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Wellcome Trust грант WT091939MA. Алена Filloux при поддержке Королевского общества.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS) |
Lab strain | Described in Reference 16 | |
| P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D-)(inactive T6SS) | This study | The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3', and 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3'. The Down fragment primers : 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3', 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' |
|
| E.coli DH5α | Invitrogen | 18258-012 | F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 |
| pBluescript II SK(+) | Agilent | 212205 | This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation. |
| X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Use at 40 μg/ml |
| Luria Bertani agar | Merck-chemicals | 1.10283.0500 | |
| TSB (casein soya bean broth) | Oxoid | CM109 | |
| Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| Scanner | Epson | V700 | |
| Spectrophotometer | WPA Biowave | CO8000 Cell Density Meter | |
| Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
| Red-gal | Research organics | 1364c | |
Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used. |
|||
References
- Filloux, A., et al. The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes. Microbiology. 154 (6), 1570 (2008).
- Cascales, E., Cambillau, C. Structural biology of type VI secretion systems. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102 (2012).
- Leiman, P. G., et al. Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers. Virol. J. 7, 355 (2010).
- Ballister, E. R., et al. In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733 (2008).
- Leiman, P. G., et al. Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154 (2009).
- Pukatzki, S., et al. Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508 (2007).
- Ma, A. T., et al. Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells. Cell Host Microbe. 5 (3), 234 (2009).
- Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25 (2010).
- Russell, A. B., et al. Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells. Nature. 475 (7356), 343 (2011).
- Li, M., et al. Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein. PLoS Pathog. 8 (4), e1002613 (2012).
- Zheng, J., et al. Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae. PLoS One. 6 (8), (2011).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathog. 6 (8), e23876 (2010).
- Murdoch, S. L., et al. The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors. J. Bacteriol. 193 (21), 6057 (2011).
- Boyer, F., et al. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources? BMC Genomics. 10, 104 (2009).
- Maniatis, T., et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring, NY. (1982).
- Mougous, J. D., et al. A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus. Science. 312 (5779), 1526 (2006).
- Records, A. R., et al. The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery. Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751 (2011).
- Hachani, A., et al. Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins. J. Biol. Chem. 286 (14), 12317 (2011).
