Summary
Een niet-invasieve middelen voor het succes van transplantatie myoblast evalueren beschreven. De methode maakt gebruik van een verenigd fusie reportergen samengesteld uit genen waarvan de expressie kan worden afgebeeld met verschillende beeldvormende technieken. Hier maken we gebruik van een
Abstract
Duchenne spierdystrofie (DMD) is een ernstige genetische neuromusculaire aandoening die bij 1 op de 3500 jongens en wordt gekenmerkt door progressieve spierdegeneratie 1, 2. Bij patiënten, het vermogen van resident spier satelliet cellen (SC) om beschadigde myovezels regenereren steeds inefficiënt 4. Daarom transplantatie van spier progenitorcellen (MTR) / myoblasten van gezonde proefpersonen is een veelbelovende therapeutische benadering van DMD. Een belangrijke beperking van het gebruik van stamceltherapie is echter een gebrek aan betrouwbare beeldvormende technologieën voor langdurige bewaking van geïmplanteerde cellen en voor evaluatie van de doeltreffendheid. We beschrijven een niet-invasieve, real-time benadering van het succes van transplantatie myoblast evalueren. Deze methode maakt gebruik van een verenigd fusie reportergen samengesteld uit genen (vuurvliegluciferase [schommelingen], monomere rood fluorescerend eiwit [mrfp] en sr39 thymidinekinase [sr39tk]), waarvan de expression kunnen worden afgebeeld met verschillende beeldvormende technieken 9, 10. Een verscheidenheid van beeldvormende technieken, met inbegrip van positron emissie tomografie (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetische resonantie beeldvorming (MRI), optische beeldvorming, en hoge frequentie 3D-echografie zijn nu beschikbaar, elk met unieke voordelen en beperkingen 11. Bioluminescentie (BLI) studies, bijvoorbeeld, hebben het voordeel dat ze relatief lage kosten en hoge doorvoer. Het is om deze reden dat, in deze studie gebruik van de vuurvlieg luciferase (schommelingen) reportergen sequentie vervat in het fusiegen en bioluminescentie (BLI) voor de korte termijn lokalisatie levensvatbare C2C12 myoblasten om na implantatie in een muis model van DMD (spierdystrofie op het X-chromosoom [mdx] muis) 12-14. Belangrijker BLI geeft ons een middel om de kinetiek van gemerkte MTR na implantatie onderzocht, en is nuttig voor herhaaldelijk volgen cellen over time en volgende migratie. Onze reporter-gen aanpak verder stelt ons in staat om meerdere beeldvormende technieken in een enkel levend onderwerp samen te voegen die, gezien de tomografische natuur, fijne ruimtelijke resolutie en de mogelijkheid om op te schalen naar grotere dieren en mensen 10,11, zal PET vormen de basis van de toekomstige werkzaamheden die wij suggereren kan vergemakkelijken een snelle vertaling van methoden die zijn ontwikkeld in de cellen om preklinische modellen en klinische toepassingen.
Protocol
1. Instandhouding en vermeerdering van C2C12 myoblasten
- C2C12 myoblasten plaat in een 75 cm2 fles en handhaven cellen in hoge glucose Dulbecco's Modified Eagle's Serum (HG-DMEM) aangevuld met foetaal bovine serum (FBS) tot een eindconcentratie van 10%. Sta niet toe dat cellen confluent worden op elk gewenst moment, omdat dit de myoblastic bevolking afbreken. Medium worden om de andere dag Opmerking:. Altijd warm medium tot 37 ° C in een waterbad voor gebruik.
- Wanneer myoblasten voor ca. 80% confluente, passage cellen om een nieuwe fles. Zuig kweekmedium. Was de cellen met 4-5 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) om alle sporen van kweekmedium, die trypsine-remmende serum te verwijderen. Even uitspoelen de cellaag met 2-3 ml 0,25% (w / v) trypsine-EDTA-oplossing om de hechtende myoblasten van de fles los. Aspireren trypsine en plaats kolf in incubator bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Tijdens deze incubatietie, bereidt u een nieuwe fles met 9 ml HG-DMEM/10% FBS medium. Na behandeling met trypsine, voeg 10 ml compleet medium voor cellen en pipet 4-5 keer om de verzameling van alle cellen op de middellange. Voeg 1 ml celsuspensie de nieuwe kolf en incuberen in 5% CO2 bij 37 ° C.
2. C2C12 celtransfectie
- Zodra cellen tot 50% confluentie transfecteren volgens instructies van de fabrikant van Invitrogen. Kort Combineer 90 pi Lipofectamine 2000 reagens met 4,5 ml OPTI-MEM medium. In een andere buis, samen 36 ug CMV-trifusion reportergen DNA met 4,5 ml OPTI-MEM. Flick elke buis te combineren en wacht 5 minuten. Combineer de inhoud van beide buizen voorzichtig en incubeer bij kamertemperatuur gedurende precies dertig minuten Opmerking:. Een tweede kolf moeten worden vastgesteld voor getransfecteerde cellen die alleen Lipofectamine en OPTI-MEM ontvangen als een negatieve controle.
- Verwijderen medium van C2C12 cellen en voeg 15,5ml vers HG-DMEM/10% FBS medium. Toevoegen transfectiemedium aan totale volume 20 ml.
- Toestaan cellen overnacht transfecteren minstens 20 uur bij 37 ° C.
- De volgende dag, aspireren transfectie medium en voeg 10 ml HG-DMEM/10% FBS.
- Bekijk cellen onder een omgekeerde fluorescentie microscoop. Geven zowel helderveld en rode fluorescentie beelden (met behulp van een TRITC filter kubus; mrfp ex / em: 584/607 nm). Tel het aantal RFP tot expressie brengende cellen bekeken onder fluorescentie gedeeld door het totaal aantal cellen bekeken onder helderveld voor meerdere gebieden te transfectie efficiëntie leiden.
3. Beoordeling van de Cel Overlevingsvermogen / MTT-test
- Een dag voor transfectie plaat 1x10 5 C2C12 cellen in ieder putje in een 24-well plaat. Cellen worden uitgeplaat in 500 ul volume in HG-DMEM/10% FBS.
- Volgende dag transfecteren myoblasten nachts zoals eerder beschreven. Volg de fabrikant suggesties voor transfectie reagent volumes voor een 24-well plaat. Incubeer een reeks kommetjes met Lipofectamine (geen DNA) als controle. Alles cellen onder fluorescentie om adequate transfectie opgetreden.
- Transfectiemedium verwijderd en incubeer myoblasten met 5 mg / ml thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) in HG-DMEM/10% FBS. Toevoegen D-luciferine acht van de getransfecteerde putjes en incubeer bij 37 ° C gedurende vier uur.
- Verwijder medium uit putten. Oplosbaar blauw formazan kristallen door toevoeging 180 ul isopropanol aan elke well. Schudden bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Vermijden neerslag pipetoplossing in een 96-well plaat en lees absorptie bij 575 nm.
4. Bereiding van myoblasten voor transplantatie
- Verwijder medium, wassen myoblasten met HBSS, en trypsinize cellen zoals beschreven in 1.1.
- Resuspendeer cellen in 4 ml compleet medium.
- Met behulp van een hemocytometer, tel cellen om volumes met 10 6 myoblasten genereren. Pipetteer volume in steriele 1,5 ml microbuisjes. Een transfectie-efficientie van ~ 10%, deze waarden blijkt dat 100.000 luciferase tot expressie brengende cellen detecteerbaar zijn op de GE ExploreOptix scanner na transplantatie.
- Bereiken van een uiteindelijk injectievolume van 15 ul, bevattende 10 6 C2C12 cellen. Eventueel gecentrifugeerd bij 2000 rpm microbuizen een minuut. Zorgvuldig aspireren supernatant met een pipet. Resuspendeer cellen in 15 ul van HG-DMEM ontbreekt FBS.
5. Cell Implantatie
- Verdoven muis met 2% isofluraan / 2% O 2. Pluk haar van de dorsale achterste lidmaat gebied. Anesthesie te handhaven op 1,5% isofluraan / 2% O 2.
- Zorg ervoor dat C2C12 myoblasten zijn goed opgeschort. Met de muis in een liggende positie, uit te breiden het achterste lidmaat en het gebruik van een insuline spuit om cellen direct te injecteren in de laterale kop van de gastrocnemius spier in een hoek van 30 °. Injecteer getransfecteerde myoblasten in de rechter achterpoot ledemaat en ongetransfecteerde myoblasten into de contralaterale (links) achterste ledematen.
- Voer een basislijn bioluminescentie scan: Snel muis over te dragen aan het podium in de optische scanner, het leggen van de muis in een buikligging. Sluit de verdoving lijn. Om ervoor te zorgen de muis onder narcose blijft, moet een tweede persoon aanwezig te zijn voor het aansluiten van de verdoving lijn, terwijl de andere plaatsen van het dier in de scanner.
- Voorzichtig uit te breiden het achterste lidmaat zodat het gebied van de injectie zichtbaar is. Tape achterpoten op zijn plaats met een zachte lijm zoals medische tape.
- Sluit de tank en voorkomen dat licht het inwendige van de scanner openen, omdat dit het gedetecteerde achtergrondsignaal verhogen. De scanner moet worden ingesteld op de parameters die in de instructies van de fabrikant is voor bioluminescentie beeldvorming. In het bijzonder zorgen voor "geen laser" is geselecteerd.
- Teken een region of interest (ROI) rond de geplukte gebied en begin te scannen.
6. Injectie van Fluc Substraat, D-luciferine, in Mdx muis
<ol>7. BLI naar Luc-expressie mediterrane partnerlanden Target na de implantatie in muismodellen van DMD
- Na opname periode weer verdoven muis, zoals beschreven in 5.1.
- Transfer terug de muis om de optische scanner en voer een scan bioluminescentie op dezelfde wijze als de achtergrond scan.
- Hoewel een 20 min opname periode moet maximale intensiteit van het signaal te verschaffen, kan een volgende scan worden uitgevoerd.
- Na voltooiing van het beeld acquisitie, offeren de muis volgens de richtlijnen van uw Institutionele Animal Ethics Committee en de Canadese Raad van Animal Care (CCAC). Onmiddellijk i Isoleer achterste ledematen spieren en plaatsn 10% formaline om vast te stellen voor paraffine inbedding. Voer immunohistochemie kleuring voor luciferase tot intramusculaire injectie van myoblasten bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij 50-60% confluentie, C2C12 myoblasten werden voorbijgaand getransfecteerd met bovengenoemde fusie reporter genconstruct uit vuurvlieg luciferase [fluc] monomere rode fluorescente eiwit [mrfp] sr39 en thymidine kinase [sr39tk] (Figuur 1A). Transfectie efficiëntie werd berekend via fluorescentiemicroscopie (fig. 1B, C), gebruik makend van de mrfp sequentie in onze reporterconstruct. Cell overlevingskansen werd niet beïnvloed door etikettering met de BLI substraat, D-luciferine (Figuur 1D). Na transfectie werden ongeveer 100.000 mrfp tot expressie myoblasten intramusculair geïmplanteerd in de gastrocnemius spieren van mdx muizen (voorheen bepaald, manuscript ingediend) 100000 getransfecteerde cellen werden eveneens geïmplanteerd in de contralaterale achterpoot als controle. Onmiddellijk na cel implantatie werden muizen intraperitoneaal (IP) met 150 mg / kg D-luciferin. Na een opname periode van ~ 20 minuten werden muizen afgebeeld op een klein dier optische scanner (GE ExplorOptix zwarte doos die is ingericht voor levende dieren bioluminescentie en fluorescentie). Zoals eerder aangetoond, zowel in vitro en na implantatie (manuscript submitted) opname van D-luciferine specifiek is voor fluctuaties expressie myoblasten, zonder detecteerbare bioluminescentie in getransfecteerde cellen (Figuur 2). Immunohistochemie bevestigd intramusculaire transplantatie van myoblasten (figuur 3)
Figuur 1 Schematische van CMV-trifusion reporter construct (A). Helderveld / fluorescentiebeelden van C2C12 myoblasten getransfecteerd met het trifusion reporterplasmide (B, C), MTT assay C2C12 cel overlevingskansen beoordelen na labeling met BLI substraat, D-lucifer in (D).
Figuur 2. Bioluminescentie beeldvorming (BLI). Een regio van belang (ROI) is gevestigd op de geplukte achterste ledematen gebied waar myoblasten worden geïnjecteerd (A) te omsluiten. Bioluminescentie niet wordt gedetecteerd tijdens een scan achtergrond (B). Op 23 min na injectie van D-luciferine, is een duidelijk signaal gedetecteerd van de rechter achterpoot ledematen waar luciferase-expressie myoblasten worden geïnjecteerd. Geen bioluminescentie wordt gedetecteerd in de contralaterale achterste ledematen geïnjecteerd met niet-getransfecteerde myoblasten (C). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
upload/50119/50119fig3.jpg "/>
Figuur 3. IHC met een vuurvlieg luciferase antilichaam bevestigt intramusculaire implantatie van getransfecteerde C2C12 cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie hebben we beschreven een snelle en betrouwbare moleculaire beeldvorming, reporter-gen benadering van niet-invasieve doelwit myoblasten / mediterrane partnerlanden na transplantatie. Hoewel deze studie toont aan korte lokalisatie van getransplanteerde MTR via bioluminescense imaging (BLI), de manier waarop cellen gericht kan in feite eenvoudig worden toegepast op een longitudinale beoordeling van cel aanslaan, door de implantatie van cellen die stabiel express het reportergen. Daartoe heeft onze fractie gegenereerd transgene muis lijnen die de verenigde reportergen koesteren. Alleen cellen die het reportergen oxideren D-luciferine om fotonen te produceren voor beeldvorming met BLI. Omdat oxidatie van D-luciferine is afhankelijk van genexpressie, is een krachtige techniek waarmee niet-invasieve beeld levensvatbare getransplanteerde cellen. Spierweefsel geoogst van deze transgene muizen en satelliet-cellen (SC's) geïsoleerd via FACS kan inderdaad targeted na implantatie in mdx muizen. Bovendien kunnen we hun differentiatie status volgen door het gebruik van een spier-specifieke promotor, verder verhooging het nut en het belang van moleculaire beeldvormingstechnieken, zoals hierin voorgesteld, op het gebied van research DMD (manuscript ingediend). Naast de snelheid en lage kosten, BLI is niet giftig, waardoor het een aantrekkelijke keuze voor beeldvorming gebruikte kleine dieren. Deze eigenschap, evenals de hoge specificiteit zal onschatbare waarde zijn in raffinage myoblast vervangende therapieën in preklinische modellen ziekte van Duchenne spierdystrofie alvorens naar klinisch toepasbare studies waarbij technologieën zoals PET.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Sanjiv Gambhir bedanken voor de gave van de fluc/mrfp/sr39tk reportergen. Dit werk werd gefinancierd door De Stem Cell Network (SCN) van Canada, en The Jesse's Journey Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E.
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
