Summary
Неинвазивных средств для оценки успеха пересадки миобластов описано. Метод использует единый ген-репортер слияния состоит из генов, экспрессия которых могут быть выявлены различные методы визуализации. Здесь мы воспользуемся
Abstract
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является тяжелой генетической нервно-мышечные расстройства, которое поражает 1 из 3500 мальчиков и характеризуется прогрессирующей дегенерацией мышц 1, 2. У пациентов, способности резидентных клеток спутниковой мышцы (ПК) для восстановления поврежденных мышечных волокон становится все более неэффективной 4. Таким образом, пересадка мышц клетки-предшественники (ПДК) / миобластов у здоровых людей является перспективным терапевтическим подходом к DMD. Основным ограничением к использованию стволовых клеток, однако, является отсутствие надежных технологий визуализации для долгосрочного мониторинга имплантированных клеток, а также для оценки ее эффективности. Здесь мы описываем неинвазивным, в режиме реального времени подход к оценке успешности трансплантации миобластов. Этот метод использует единый ген-репортер слияния состоит из генов (люциферазы светляков [флуктуаций], мономерного красного флуоресцентного белка [mrfp] и SR39 тимидинкиназы [sr39tk]), чьи Expression могут быть отображены различные методы визуализации 9, 10. Различные методы визуализации, включая позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ), магнитно-резонансная томография (МРТ), оптических изображений, и высокая частота 3D-УЗИ теперь доступны, каждый со своими уникальными преимуществами и ограничениями 11. Биолюминесценции изображений (BLI) исследования, например, имеют то преимущество, что относительно низкой стоимости и высокой пропускной способностью. Именно по этой причине, что в этом исследовании, мы используем люциферазы светляков (флуктуации), репортер последовательности генов, содержащихся в геном синтеза и биолюминесценции изображений (BLI) для краткосрочных локализации жизнеспособной C2C12 миобластов после имплантации в мышь модель DMD (мышечная дистрофия на Х-хромосоме [MDX] мышь) 12-14. Важно отметить, что BLI предоставляет нам средства для изучения кинетики меченого ПДК после имплантации, а также будет полезна для отслеживания клетки неоднократно в течение тIME и последующие миграции. Наш корреспондент гена подход также позволяет нам объединить несколько методов визуализации в единый субъект жизни; учитывая томографических природы, прекрасные пространственным разрешением и способностью масштабироваться до более крупных животных и человека 10,11, ПЭТ лягут в основу будущей работы, которую мы предлагаю может способствовать быстрому переводу методы, разработанные в клетки доклинических моделях и клинического применения.
Protocol
1. Техническое обслуживание и распространения C2C12 миобластов
- Плита C2C12 миобластов в 75 см 2 колбы и поддержания клеток в сыворотке высокий уровень глюкозы в Дульбекко изменения Орла (HG-DMEM) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) до конечной концентрации 10%. Не допускайте клетки, чтобы стать вырожденная в любое время, так как это разрушает myoblastic населения. Средний должна быть изменена каждый день. Примечание: всегда тепло среднего до 37 ° С на водяной бане до использования.
- Когда миобластов становятся примерно 80% вырожденная, прохождение клеток в новую колбу. Аспирируйте культуральной среде. Вымойте клеток с 4-5 мл Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS), чтобы удалить все следы культуральной среде, которая содержит трипсин-ингибирующие сыворотки. Сполоснуть слой клеток с 2-3 мл 0,25% (вес / объем) трипсина-EDTA решение отделить приверженцем миобластов из колбы. Аспирируйте трипсина и место колбу в инкубаторе при температуре 37 ° C в течение 5 мин.
- Во время этой инкубацииния, подготовить новую колбу с 9 мл среды HG-DMEM/10% FBS. После трипсинизации, добавить 10 мл полной среды для клеток и пипетки 4-5 раза обеспечивать сбор всех клеток в среде. Добавить 1 мл клеточной суспензии на новую колбу и инкубировать в 5% CO 2 при 37 ° C.
2. C2C12 трансфекции клеток
- Как только клетки достигали 50% слияния, трансфекции в соответствии с инструкциями производителя из Invitrogen. Короче говоря, объединить 90 мкл липофектамина 2000 реагента с 4,5 мл OPTI-MEM среде. В другой трубке, объединить 36 мкг CMV-trifusion ген-репортер ДНК с 4,5 мл OPTI-MEM. Флик каждую пробирку, чтобы объединить и подождите 5 мин. Объединить содержимое обеих труб, аккуратно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение ровно тридцать минут. Примечание: второй колбе также должны быть созданы для нетрансфицированных клетки, которые получают только Lipofectamine и OPTI-MEM, чтобы служить в качестве отрицательного контроля.
- Удалить среды от C2C12 клеток и добавить 15,5мл свежего HG-DMEM/10 средних% FBS. Добавить трансфекции среднего довести общий объем до 20 мл.
- Разрешить клетки для трансфекции в течение ночи, по крайней мере 20 часов при 37 ° C.
- На следующий день, аспирации трансфекции среду и добавляют 10 мл HG-DMEM/10% FBS.
- Просмотр клетки под перевернутой флуоресцентного микроскопа. Захват и светлого поля и красный флуоресцентные изображения (с помощью фильтра TRITC куба; mrfp EX / EM: 584/607 нм). Подсчитайте количество RFP-клеток, экспрессирующих рассматривать под флуоресценции, поделенное на общее число клеток рассматривать при ярком поле для нескольких полей зрения для получения эффективность трансфекции.
3. Оценка сотового Живучесть / МТТ
- За день до трансфекции, пластины 1x10 5 C2C12 клеток в каждую лунку в 24-луночный планшет. Клетки должны быть покрыты в 500 мкл объемы в HG-DMEM/10% FBS.
- На следующий день, трансфекции миобластов ночь, как описано выше. Следите предложения производителей для трансфекции ReageNт объемах для 24-луночный планшет. Инкубируйте множество скважин с Lipofectamine только (без ДНК) в качестве контроля. Просмотр клетки под флуоресценции для обеспечения надлежащего трансфекции произошло.
- Удалить среднего трансфекции и инкубировать миобластов с 5 мг / мл тиазолил тетразолия бромид (МТТ) в HG-DMEM/10% FBS. Добавить D-люциферин до восьми трансфецированных скважин, и инкубировать при 37 ° C в течение четырех часов.
- Удалите среду из скважины. Растворения синие кристаллы формазана путем добавления 180 мкл изопропанола в каждую лунку. Встряхнуть при 37 ° С в течение 15 мин.
- Как избежать любой осадок, пипетки раствор в 96-луночный планшет и измерить оптическую плотность при 575 нм.
4. Подготовка миобластов для трансплантации
- Удалите среду, вымыть миобластов с HBSS, и trypsinize клеток, как указано в п. 1.1.
- Повторное приостановить клеток в 4 мл полной среды.
- Использование гемоцитометр, подсчета клеток для создания томов, содержащих 10 6 миобластов. Внесите т.UME в стерильных пробирок 1,5 мл. При трансфекции КПД ~ 10%, эти значения указывают, что 100000 люцифераза-экспрессирующие клетки обнаруживаются на сканер GE ExploreOptix после пересадки.
- Достичь конечного объема инъекции 15 мкл, содержащей 10 6 C2C12 клеток. Если необходимо, центрифуги микропробирок при 2000 оборотов в минуту в течение одной минуты. Осторожно супернатант с пипеткой. Повторное приостановить клеток в 15 мкл HG-DMEM не хватает FBS.
5. Сотовые Имплантация
- Anesthetize мышь с 2% изофлурана / 2% O 2. Срывать волос от спины задние конечности области. Поддержание анестезии на 1,5% изофлурана / 2% O 2.
- Убедитесь, C2C12 миобластов хорошо приостановлено. С помощью мыши в положении лежа, расширение задних конечностей и использовать инсулиновый шприц для введения клеток непосредственно в боковые головки икроножной мышцы на 30 ° угол. Inject трансфицированных миобластов в правой задней конечности и нетрансфецированных Int миобластовO контралатеральной (слева) задних конечностей.
- Выполните проверку базовых биолюминесценции: быстро передать мыши этап в оптический сканер, заложив мыши в положении лежа. Подключите анестетика линии. Для обеспечения мыши остается под наркозом, второй человек должен быть настоящим подключить анестетика линии в то время как в других местах животного в сканер.
- Осторожно продлить задних конечностей таким области инъекции видна. Лента задние конечности в месте с мягким клеем, таких как медицинские ленты.
- Закройте камеру и убедитесь, что свет не может получить доступ к внутренней части сканера, так как это приведет к увеличению фонового сигнала обнаружено. Сканер должен быть установлен на параметры, включенные в вашей инструкции производителя для биолюминесценции изображений. В частности, обеспечить "не лазер" выбран.
- Нарисуйте области интереса (ROI) по всему сорвал область и начать сканирование.
6. Инъекции Fluc основания, D-люциферин, в мышь Mdx
<OL>7. BLI к цели Люк-выражающий ПДК После имплантата в мышиных моделях DMD
- После поглощения период, анестезию мыши снова, как описано в пункте 5.1.
- Передача мышь обратно к оптическим сканером и выполнить другую проверку биолюминесценции в том же порядке, что и фонового сканирования.
- Хотя 20 мин период поглощения должны обеспечить максимальную интенсивность сигнала, последующая проверка может быть выполнена.
- После завершения захвата изображений, пожертвовать мыши в соответствии с руководящими принципами, установленными вашим Институциональные животных Комитета по этике и канадского Совета по уходу за животными (ССАС). Изолировать задних мышц конечностей и сразу же яп 10% формалине, чтобы исправить для заливки парафином. Выполните иммуногистохимии окрашивание люциферазы, чтобы подтвердить внутримышечных инъекций миобластов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
По 50-60% слияния, C2C12 миобласты были временно трансфицировали с вышеупомянутыми слияния репортер генной конструкции состоят из люциферазы светляков [флуктуаций], мономерного красного флуоресцентного белка [mrfp] и SR39 тимидинкиназы [sr39tk] (рис. 1а). Эффективность трансфекции была рассчитана с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 1B, C), используя mrfp последовательность в наш корреспондент построить. Сотовые живучесть не был затронут маркировки с подложкой BLI, D-люциферин (рис. 1D). После трансфекции, около 100.000 mrfp экспрессирующих миобласты были имплантированы внутримышечно в икроножной мышце мышей MDX (определяется ранее, рукопись представлена); 100000 нетрансфицированных клетки были имплантированы так же в противоположную заднюю конечность в качестве контроля. Сразу же после имплантации клетки мышам вводили внутрибрюшинно (IP) с 150 мг / кг D-lucifeРин. После поглощения периодом ~ 20 мин, мышей были обследованы на небольшое животное оптическим сканером (GE ExplorOptix черный ящик, который оборудован для живых животных биолюминесценции и флуоресценции). Как уже говорилось выше, как в пробирке и после имплантации (рукопись представлена) поглощение D-люциферин конкретно к флуктуации выражения миобластов, не обнаруживаемых биолюминесценции в нетрансфицированных клетки (рис. 2). Иммуногистохимия подтвердил внутримышечного трансплантации миобластов (рис. 3)
Рисунок 1 Схема CMV-trifusion репортер конструкции (A);. Светлое / флуоресцентных изображений из C2C12 миобластов трансфицировали trifusion репортера плазмиды (B, C); МТТ-анализа для оценки C2C12 клетки живучести после маркировки с BLI подложки, D-Люцифера В (D).
Рисунок 2. Биолюминесценции изображений (BLI). Области интереса (ROI) обращается заключить сорвал задние конечности области, где миобластов вводят (A). Биолюминесценция не обнаружена во время фонового сканирования (B). На 23 мин после инъекции D-люциферин, ясное сигнал от правой задней конечности, где люциферазы, экспрессирующих миобластов вводят. Нет биолюминесценции обнаружен в контралатеральной задней конечности вводят нетрансфицированных миобластов (C). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
upload/50119/50119fig3.jpg "/>
Рисунок 3. IHC использованием антител люциферазы светляков подтверждает, внутримышечных имплантации трансфицированных C2C12 клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы описали быстрый и надежный молекулярной визуализации, ген-репортер подход к неинвазивным целевой миобластов / ПДК после трансплантации. Хотя это исследование демонстрирует краткосрочные локализации пересаженного ПДК по bioluminescense томография (BLI), манера, в которой клетки направлены может, в самом деле, легко применить к продольной оценки клеточного приживления, через имплантацию клеток, которые стабильно экспресс ген-репортер. Для этого, наша группа вызвала трансгенных линий мышей, которые укрывают единого гена-репортера. Только клетки, экспрессирующие ген-репортер окислять D-люциферин для получения фотонов для визуализации с помощью BLI. Так как окисление D-люциферин зависит от экспрессии генов, это мощная технология, с которой неинвазивно изображения жизнеспособной пересаженных клеток. Мышечная ткань собирают из этих трансгенных мышей и сателлитных клеток (СК), изолированных с помощью FACS действительно может быть targeteг после имплантации мышам MDX. Кроме того, мы можем отследить их дифференциация состояния с помощью мышц-промотора, далее повышая полезность и важность молекулярных технологий визуализации, такие как представленный здесь, в области исследования DMD (рукопись представлена). В дополнение к своей быстротой и низкой стоимостью, BLI является нетоксичным, что делает его привлекательным выбором для частого изображения мелких животных. Эта особенность, а также его высокая специфичность, будет иметь неоценимое значение в совершенствовании терапии миобластов замены в доклинических моделях болезни мышечная дистрофия Дюшенна прежде чем перейти к клинически применимый исследований, связанных с технологиями, такими как PET.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Sanjiv Gambhir за дар гена-репортера fluc/mrfp/sr39tk. Эта работа финансировалась по сети стволовых клеток (SCN) из Канады, и путешествие фонда Джесси.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E.
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
