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Ein. Klonierung und Construct Design-
Klonen die Sequenzen von Interesse in der PMM-Peptid-Vektor (die auf Wunsch zur Verfügung gestellt werden) mit HindIII und BamHI Restriktionsstellen (siehe Abbildung 1). Die doppelsträngige DNA-Insert sollte aufzunehmen, in der folgenden Reihenfolge: eine HindIII-Stelle; eine einzige Codon für Methionin CNBr-Spaltung, die E. coli-Codon-optimierte kodierende Sequenz, einen Stoppcodon, eine BamHI-Stelle. Alle anderen Methionine im Peptid sollten beseitigt werden und die Dipeptidsequenz Asp-Pro sollte vermieden werden, da es auch in sauren Bedingungen gespalten werden.
Ein einzigartiges Cysteinrest sollten in jedem Peptid-Sequenz entsprechend der gewünschten Positionierung des Disulfid Vernetzungsdichte im fertigen Komplex eingeführt werden, und alle anderen Cysteinen sollte zu Serin mutiert werden. Das Plasmid trägt eine Kanamycin-Resistenzkassette zur Auswahl.
2. Die Expression von trpLE-peptide Fusion
- Make-up und Sterilfilter M9/Kan minimal Wachstumsmedium (0,1 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / l NaCl, 1 g / l NH 4 Cl, 4 g / l Glucose, 50 mg / l Kanamycinsulfat). Supplement mit Centrum Komplett von A bis Zink, B-Vitamine und Spurenelemente liefern: 1 Tablette in 40 ml H 2 O mit dem Mischen für 30 min, Zentrifuge, um unlösliches Material und Sterilfilter die orangefarbene Überstand zu entfernen. Lagerung der Stammlösung bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 2 Wochen und verwenden 4 ml / L in M9.
Hinweis: 15 N-angereicherten NH 4 Cl, 13 C-angereicherte Glukose oder anderen stabilen Isotopen-markierten Vorstufen können in M9-Medium in dieser Phase aufgenommen werden, falls gewünscht. - Beimpfen von 100 ml Vorkultur aus frisch transformierten BL21 (DE3)-Stamm E. coli in M9/Kan Medium. Wachsen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 200 rpm.
- Am nächsten Morgen, überprüfen Sie die OD 600 der Starter-Kultur - dies sollte im Bereich von 2 oder größer sein. Verdünnen Sie die 100 ml Starterkultur in 1 L Gesamtvolumen von Centrum-ergänzt M9 Medium. Aufgespalten in zwei 2 L Schikanekolben (500 ml Kultur in jedem Kolben) und wachsen bei 37 ° C unter Schütteln bei 140 rpm, bis die OD 600 erreicht 0.6.
- Stellen Sie den Schüttler Temperatur auf 18 ° C und weiter Schütteln für 1 Stunde, so dass Kulturen vollständig abkühlen, bevor Induktion.
- Nehmen Vorinduktion Probe für die SDS-PAGE-Analyse (Äquivalent von 50 ul aus einer Kultur bei OD 600 = 1), dann Hinzufügen von IPTG bis zu 0,1 mM Endkonzentration um die Expression des trpLE-Peptid-Fusion zu induzieren. Weiter wachsen bei 18 ° C/140 rpm über Nacht (16-20 h) unter IPTG-Induktion.
3. Inclusion Body Vorbereitung und Nickel Matrix Binding
- Die endgültige OD 600 der Übernachtungen Ausdruck Kulturen in Minimalmedium ist variabel und should zwischen 2,5 und 5,0 liegen. Eine Probe für die SDS-PAGE-Analyse (Äquivalent von 50 ul aus einer Kultur bei OD 600 = 1) und zu sammeln Zellen durch Zentrifugation für 20 min bei 5.000 x g beträgt.
- Zellpellet aus 1 l-Kultur in 50 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Zellsuspensionen können eingefroren für spätere Verarbeitung werden.
- Lysieren Zellen durch Beschallung auf Eis bei maximaler Ausgangsleistung für 1 min und Rest auf Eis für 5 min. Wir verwenden eine Misonix Sonicator 3000 (max Leistung 600 Watt) mit einem ½-Zoll-High-intensity austauschbaren Spitze. Wiederholen Beschallung / Kühlung für drei Zyklen.
- Sammeln unlöslicher Einschlusskörper (IB) Material durch Zentrifugation für 15 min bei 20.000 × g und der Überstand verworfen. Ein loses, dünne Schicht aus helleren Zelltrümmern kann sichtbar auf der Oberseite des dichten IB-Pellet, dies kann weggewaschen werden unter Verwendung von Wasser oder Pufferlösung unter leichtem Schütteln. Schritte 3.3 und 3.4 wiederholt werden, um die Reinheit des IB Fraktion zu verbessern, sobald desired. Proben von Pellet und Überstand Material sollte für die SDS-PAGE-Analyse getroffen werden, um trpLE-TM Fusion Lokalisation an inclusion bodies bestätigen.
- Aufzulösen IB Pellets in Guanidin-Lösung (6 M Guanidin HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME) unter Verwendung von 25 bis 50 ml pro Liter Kultur verarbeitet. Dieser Schritt wird mehrere Stunden unter Rühren und gelegentliche milde Ultraschallbehandlung erfordern.
- Deaktivieren Sie das IB Lysat durch Zentrifugation für 1 Stunde bei 75,000-100,000 xg und 20 ° C. Den Überstand umfüllen und durch ein 0,2 &mgr; m-Membran.
- Kombinieren der freiwerdenden IB Lysat, in einem 50 ml konischen Röhrchen oder einen größeren Behälter, die sicher geschlossen werden kann, mit Nickel Affinitätsharz, das mit Wasser und äquilibriert um Guanidin-Lösung gewaschen wurde. Verwenden Sie 3-4 ml angesiedelt Harzes pro Liter der Kultur für Fusionen, die zu einem ähnlichen Grad auszudrücken, wie trpLE-DAP12TM hier (Abbildung 3, Spur 2) gezeigt, verarbeitet. Batch bind durch Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur t emperatur unter leichtem Rühren.
4. On-Column-oxidative Vernetzung
- Legen Sie das IB-Lysat / Nickel Harzsuspension in ein leeres Schwerkraft Säule mit porösem Bett Unterstützung, indem kontinuierlich, bis das gesamte Volumen fließt. Sammeln und beiseite der Durchfluss, die gegebenenfalls noch ungebundenen Fusionsprotein.
- Waschen Nickel Harz durch Schwerkraftfluß mit 5 Bettvolumina Harnstofflösung (8 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl), enthaltend 5 mM β-ME.
- Waschen Sie die Nickel-Harz nochmals mit 5 Bettvolumina Harnstofflösung ohne β-ME.
- Wäscht den Nickel-Harz ein drittes Mal mit 5 Bettvolumen von Harnstoff-Lösung, die mit 20 pM CuSO 4 und 2 mM oxidiertes Glutathion ergänzt wurde. Nach diesem Waschen, schließen Sie die Spalte Steckdose und inkubieren 30 min bei Raumtemperatur auf maximal Disulfidbindungsbildung ermöglichen.
5. TFA Elution und Quantifizierung
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ACHTUNG: Trifluoressigsäure (TFA) verursacht schwere Verbrennungen bei Berührung mit der Haut und Dämpfe sind stark reizend Concentrated TFA sollte nur in einem zugelassenen chemischen Abzugshaube mit Augenschutz und Nicht-Latex-Handschuhe verwendet werden Überprüfen Sie die chemische Kompatibilität aller.. verwendeten Materialien Polypropylen ist kompatibel mit allen Schritten dieses Protokolls.
- Auswaschen oxidierende Harnstofflösung mit 10 Bettvolumina Wasser und trocknen Sie die Säulenbett durch Anlegen eines Vakuums Zeile der Spalte Steckdose.
- Schließen Sie die Säulenauslass und fügen 1,5 Bettvolumina ordentlich (99-100%) TFA. Rühren Sie die Nickel-Harz mit einem kleinen Spatel noch Einwirkung von Säure zu gewährleisten und Inkubation für 5 min. Öffnen des Säulenauslaß und sammelt das saure Eluat Unterdrucksetzen vorsichtig mit einer Spritze oder Druckluftleitung ggf. zum Ausschieben gesamte Flüssigkeit.
- Wiederholen Sie den Säureelution Schritt mit weiteren 1,5 Bettvolumina ordentlich TFA. Arbeiten Sie schnell bei diesem Schritt um eine vollständige Auflösung des Beade vermeidend Agarosematrix. Proteinausbeute kann an dieser Stelle gemäß dem Lambert-Beer-Gleichung und dem theoretischen molaren Extinktionskoeffizienten des trpLE-Peptid-Sequenz bestimmt werden. Verdünnen einer Probe des TFA-Eluat (1.20 bis 01.50) in Trifluorethanol (TFE) und Messung der Absorption bei 280 nm, mit TFA / TFE bei gleicher Verdünnung als Blindprobe.
6. CNBr Verdauung
ACHTUNG: Bromcyan (CNBr) ist extrem giftig und sollte nur in einem zugelassenen chemischen Abzugshaube behandelt werden. PSA einschließlich Schutzbrille, Kittel und Nicht-Latex-Handschuhe sind zwingend erforderlich. CNBr reaktiv ist gegenüber Feuchtigkeit und auf Raumtemperatur vor dem Öffnen. Kontaktieren Sie Ihren institutionellen Safety Office Anweisungen zur Neutralisierung / Entsorgung von CNBr-kontaminierten Lösungen und Materialien.
- Verdünnen des sauren Eluats auf 80% TFA endgültige Konzentration durch tropfenweise Zugabe von Wasser unter Mischen sanft. Wenn ein Niederschlag bildet, eindd zurück ein kleines Volumen (0,5 bis 1 ml) von reinem TFA bis die Lösung klar, dann wieder richtig zu 80% mit Wasser. Nehmen Sie eine 5 ul pre-Digest Probe für SDS-PAGE-Analyse, das Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lyophilisieren die Probe sofort.
- Fügen CNBr Kristalle etwa 0,2 g / ml, wobei darauf zu achten die giftige Chemikalie sicher wiegen in geschlossenen, vorgewogenen Rohren oder mit einer Waage in der chemischen Abzugshaube. Vorsichtig mischen, bis sie vollständig aufgelöst. Spül-und versiegeln das Reaktionsgefäß unter Schutzgas (Stickstoff oder Argon-Strom) und inkubieren 3-4 Stunden bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt.
- Nehmen Sie eine 5 ul post-Digest Probe für SDS-PAGE-Analyse und frieren und lyophilisiert sofort. Übertragen des Digest Reaktion auf eine Regeneratcellulose Dialysekassette oder Schlauch (Celluloseacetat wird in konzentrierter Säure auflöst) mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3,5 kDa oder weniger, je nach der Größe des erwarteten Peptid-Komplexes. Dialysieren über Nacht auf 4 l Wasser in derLaborabzug zur Verringerung der TFA-Konzentration und zersetzen nicht umgesetztes CNBr. Lassen Sie Platz in der Dialyse Kassette oder Schläuche für eine signifikante Zunahme des Volumens (so viel wie zwei-bis drei-fach) während Dialyse über Nacht.
- Entfernen der dialysierten Reaktionslösung mit suspendierten Niederschlag aus der Dialyse-Kassette oder Schlauch (meiste Protein auszufällen wird, wenn die Konzentration verringert wird TFA) und übertragen die Suspension auf 50 ml konischen Röhrchen. Einfrieren und lyophilisieren, um Wasser und Spuren von CNBr / TFA zu entfernen. Dieser Schritt ist wahrscheinlich erfordern mehrere Tage.
ACHTUNG: Sowohl die dialysierten Digest Reaktion und die Dialyse Wasser sollte weiterhin als giftig und behandelt / entsorgt mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. - Proben der Kulturen aus Vorinduktion und Ernte Stufen Einschlusskörper Überstand und Pellet, TFA-Eluat und CNBr-verdaute Material kann durch SDS-PAGE analysiert werden. Planen Proben durch Erhitzen auf 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS sample Puffer. TFA Eluat und verdauen Proben sollten sowohl in reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen hergestellt werden, um Produkt-Identifikation und Bewertung von oxidativen Vernetzung zu erleichtern.
- Trennen der Proben auf einem 12% NuPAGE Bis-Tris vorgegossenen Acrylamidgel unter Verwendung MES-SDS Laufpuffer für eine optimale Auflösung der kleinsten Digest Produkte.
7. Reversed-Phase HPLC Aufreinigung von Disulfid-vernetztes Peptid-Komplexen
- Man löst bis zu 100 mg lyophilisiertes Digest Produkte in 2-3 ml Ameisensäure und ordentlich Last auf einem präparativen Maßstab (21,2 x 150 mm) Agilent Zorbax SB-300 C3 PrepHT Spalte in Lösungsmittel A (typischerweise 10-20% Acetonitril oder 5 -10% Isopropanol in Wasser mit 0,1% TFA).
- Eluieren die Digest-Produkten in einem Gradienten von Lösungsmittel B (Acetonitril oder Isopropanol mit 0,1% TFA) über mindestens 5 Säulenvolumen. Siehe die Diskussion um Vorschläge für die Auswahl der optimalen Gradienten Bedingungen für verschiedene Peptidsequenzen.
- Nehmen50-100 ul-Proben von jedem HPLC-Fraktion für die SDS-PAGE-Analyse und frieren und lyophilisiert sofort. Entfernung von Lösungsmittel HPLC erfolgt rasch und sollte in 1-2 h abgeschlossen.
- Planen lyophilisiert HPLC-Proben für SDS-PAGE durch Erhitzen auf 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS-Probenpuffer ohne Reduktionsmittel. Cool und aufgeteilt jeder Probe gleichmäßig in 2 Mikrozentrifugenröhrchen, Zugabe von 100 mM DTT, einer von ihnen und Nachwärmsysteme kurz.
- Trennungen reduzierten und nicht reduzierten HPLC-Proben auf einem 12% NuPAGE Bis-Tris vorgegossenen Acrylamidgel mit MES-SDS Laufpuffer wie oben. Klein, hydrophobe Peptide oft nicht nehmen Coomassie gut färben und kann nicht an ihren erwarteten Molekulargewichten laufen. Jedoch sollte Vergleich reduzierten und nicht reduzierten Proben zu erleichtern Identifizierung der vernetzten Peptidprodukte und Beurteilung der Reinheit.
- Analysieren der Kandidaten-Peptid-haltigen Fraktionen durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie (siehe Diskussion) zur Identifizierung der interessierenden Spezies und bestätigen die erwartete Masse.
- Kombinieren, einfrieren und lyophilisieren HPLC-Fraktionen, die das reine, vernetzten TM-Peptid-Komplex und einen Trockengewicht des Endprodukts an Ausbeute zu bestimmen. Fraktionen mit hoher Isopropanol Inhalte dürfen nicht eingefroren bleiben. Wenn Peptidfraktionen trocknen auf einem Film anstatt einem flauschigen lyophilisierten Produkts, wieder auflösen den Film vollständig in einem kleinen Volumen von reinem Hexafluorisopropanol (HFIP), einfrieren und lyophilisieren erneut. Der HFIP-behandeltes Produkt sollte eine kleine, weiße Kegel, einfach gekippt wird und abgewogen werden.