Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

Zusammenfassung

Kv-Kanal Dysfunktion ist mit Herzrhythmusstörungen verbunden. Um zu untersuchen, die molekularen Mechanismen, die zu solchen Arrhythmien nutzen wir eine systematische Protokoll zur Isolierung von atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten aus Kv Kanal Nebenleistungen Untereinheit Knockout-Mäusen führen. Isolierte Herzmuskelzellen kann dann sofort für zellulare elektrophysiologische Studien, biochemischen oder Immunfluoreszenz (IF)-Assays verwendet werden.

Zusammenfassung

KCNE Gene für eine kleine Familie von Kv-Kanal zusätzlichen Untereinheiten, die heteromeren Komplexe mit Kv-Kanal alpha-Untereinheiten bilden, um ihre funktionellen Eigenschaften zu modifizieren kodieren. Mutationen in KCNE Gene bei Patienten mit Herzrhythmusstörungen wie das Long-QT-Syndrom und / oder Vorhofflimmern gefunden. Allerdings bleibt die genaue molekulare Pathophysiologie, die zu diesen Krankheiten führt unklar. In früheren Studien die elektrophysiologischen Eigenschaften der Krankheit Mutationen in diesen Genen haben meist in heterologen Expressionssystemen untersucht worden und wir können nicht sicher sein, ob die berichteten Effekte können direkt in nativen Kardiomyozyten übersetzt werden. In unserem Labor setzen wir daher einen anderen Ansatz. Wir direkt zu untersuchen die Auswirkungen von KCNE Deletion in isolierten Herzmuskelzellen aus Knockout-Mäusen durch zelluläre Elektrophysiologie - eine einzigartige Technik, die wir beschreiben, in dieser Ausgabe des Journal of Visualized Experiments. Die Herzen von genetically entwickelt KCNE Mäusen schnell ausgeschnitten und montiert auf einem Langendorff-Apparatur durch Aorten Kanülierung. Freiem Ca ^{2 +} in dem Myokard durch EGTA gebunden und Dissoziation von Herzmuskelzellen wird dann durch retrograde Perfusion der Koronararterien mit einem spezialisierten niedrigen Ca ^{2 +-Puffer,} der Kollagenase erreicht. Atria, freien rechtsventrikulären Wand und die linke Herzkammer kann dann durch mikrochirurgische Techniken getrennt werden. Calcium wird dann langsam wieder auf isolierte Herzmuskelzellen in einem mehrstufigen Waschvorgangs zugegeben umfassend. Atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten gesundes Aussehen ohne spontane Kontraktionen werden dann sofort an elektrophysiologische Untersuchungen durch Patch-Clamp-Technik oder andere biochemische Analysen innerhalb der ersten 6 Stunden nach der Isolierung unterzogen.

Protokoll

Ein. Tierische Anästhesie und Organentnahmen

1. Betäuben die Maus durch intraperitoneale (ip) Injektion von Ketamin (200 mg / kg KG) und Xylazin (20 mg / kg KG).
2. Um anticoagulate injizieren 250 IU Heparin ip die Blutgerinnung und Thrombusbildung zu vermeiden.
3. Warten Sie, bis tiefe Narkose erreicht ist, die durch Areflexie gekennzeichnet. Um Areflexie, Test Cornealreflex durch leichtes Berühren der Hornhaut oder Testflug Reflex Schwanz kneifen überprüfen.
4. Übertragen Sie die Maus auf OP-Tisch und fixieren Sie sie in Rückenlage.
5. Inzision der Haut und der Bauchwand unterhalb der xiphoid und führen Clamshell Thorakotomie: Erweitern Sie den Schnitt auf beiden Seiten entlang der Rippenbogen und anschließend geschnitten Rippen in der medialen Axillarlinie, lenken die Brustkorb nach oben.
6. Öffnen Herzbeutel, finden großen Gefäße. Drücken Sie vorsichtig Herzen caudal zur besseren Darstellung der Aorta. Klemmen Sie die Aorta mit einer Pinzette.
7. Legen des Herzens in Konkavität eines Paars von n cissors und sezieren alle verbindenden Gefäße mit einem einzigen Schnitt. Achten Sie darauf, um einen ausreichend großen Teil der aufsteigenden Aorta für Langendorff Kanülierung bewahren.
8. Übertragen herausgeschnitten Herz sofort in eine Petrischale mit eiskaltem und Pre-Oxygenwasser Lösung 1 (für Lösungen, siehe Tabelle 1) gefüllt.

2. Vorbereitung der Herz-und Langendorff Perfusion

1. Kanülieren die Aorta mit einem 1.8F Stahlkanüle. Achten Sie darauf, Luftembolie zu vermeiden.
2. Fixieren Aorta auf der Kanüle mit einer chirurgischen Naht und bündig Koronarien mit 1 ml der Lösung 1.
3. Verbinden Kanüle mit einem Langendorff-Apparatur.
4. Stellen Sie sicher Zeit von Langendorff nach Thorakotomie Kanülisier nicht übersteigt 120 Sek. erweiterten Ischämie / Reperfusionsverletzung des Myokards zu verhindern.
5. Perfuse Herz mit 10 ml Ca ^{2 +} kostenlose Lösung 2 (4 ml / min).
6. Perfuse Herz mit Collagenaselösung 3 für 8 min (4 ml / min).

le "> 3. Mikrochirurgische Dissoziation von Cardiac Chambers

1. Transfer Herz in einer vorgewärmten 100-mm Petrischale mit niedrigen Ca ^{2 +-Lösung} 4.
2. Entfernen Sie vorsichtig Aorten-und andere nicht-Herzgewebe mit Schere und entsorgen Sie sie.
3. Separate Vorhöfe und Kammern und fahren Sie mit jeder Kammer getrennt. Halten Sie Zellen in Lösung 4 eingetaucht. Verwenden Sie kleine Mengen (weniger als 5 ml).

4. Weitere Dissoziation von Kardiomyozyten

1. Atrial Kardiomyozyten:
   1. Zu individualisieren Vorhof Kardiomyozyten übertragen die Vorhöfe in einem separaten vorgewärmten 100-mm Kulturschale und distanzieren das Gewebe durch die sanft Auseinanderziehen mit feinen Pinzetten. Gewährleisten eine fast vollständige Dissoziation des Gewebes.
   2. Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette mit einer erweiterten Feuer-poliert mit Kunststoff Pipettenspitze, um die Zellen in 1 ml Lösung 5 auszusetzen für 5 min.
   3. Trennen der Zellen von Schutt durch Verwendung eines Zellfilter (200 um Maschenweite).
   4. 5 ml Lösung 5 der Zellsuspension und Zentrifuge für 2 min bei 16 xg bei Raumtemperatur.
   5. Die folgenden Schritte werden unter einer Zellkultur Haube betrieben. Überstand verwerfen und resuspendiert das Pellet in 5 ml Lösung 6.
   6. Nach Sedimentation durch die Schwerkraft für 10 min in einem 15 ml-Röhrchen, für 1 min zentrifugieren bei 16 × g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren die Zellen je nach ihrer Menge in 1-5 ml Lösung 6.
2. Ventrikuläre Kardiomyocyten:
   1. Sezieren die linksventrikuläre interessierenden Bereich mit feinen Pinzetten in 5 ml Lösung 4.
   2. Auszusetzen Zellen durch sanftes Pipettieren, bis die meisten der Zellen getrennt sind. Übertragen der Zelle Lösung nach der Filterung (200 um Maschenweite) in einen 50-ml-Röhrchen, einen Volumen von 25 ml aufgefüllt.
   3. Säule für 2 min bei 16 xg bei Raumtemperatur.
   4. Die folgenden Schritte werden unter einer Zellkultur Haube betrieben. Überstand abnehmen, resuspendieren das Pellet in 25 mlLösung 6 und damit die Sedimentation der Zellen für 10 min.
   5. Zählen Sie die Zellen und den Überstand, fügen Sie 25 bis 50 ml Lösung 6 auf die Zellen.

5. Vorbereitung der Kardiomyozyten für Zelluläre Elektrophysiologie, biochemische oder IF Studies

1. Für elektrophysiologischen Studien halten die Myozyten in Lösung 6 in einem 50 ml Röhrchen und hemmen Sedimentation.
2. Für biochemische Untersuchungen, z. B. Calcium imaging, Platte Myozyten auf Laminin beschichteten Zellkulturschale (Endkonzentration 20 ug / ml Laminin in PBS).
3. Für Immunfluoreszenzfärbung bereiten eine Zellkulturschale Platte mit Glasdeckgläschen und beschichtet mit Laminin-Lösung (Endkonzentration 50 ug / ml Laminin in PBS).
   1. Entfernen Sie die Lösung vor dem Beschichten Myozyten. Platte der Zellen und steuern die Zelldichte mit Hilfe eines Mikroskops.
   2. Lassen Sie die Myozyten haften Slip für 1 Stunde bei 37 ° C in 2% CO ₂ abzudecken, entfernen Sie die Lösungund beginnen sofort mit einer Standard-Färbeverfahren Protokoll.
   3. Inkubieren mit Fixiermittel, beispielsweise 4% PFA in PBS (pH 7,5) für 10 min bei Raumtemperatur und folgen mit drei Waschschritten PBS für jeweils 5 min.
   4. Um die Zellen zu hemmen und permeabilisieren unspezifische Antikörperbindung inkubieren Myocyten mit 10% Serum, 0,3% Triton, 0,2% BSA in PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
   5. Inkubieren mit dem primären Antikörper für 1 Std. bei 37 ° C und Waschen wie zuvor beschrieben.
   6. Inkubieren mit dem sekundären Antikörper für 1 Std. bei Raumtemperatur. Um die Kerne Gegenfärbung und α-actinin Verwendung DAPI und Fluorochrom Phalloidin (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
   7. Nach dem Waschen, übertragen die Glasabdeckung rutscht vorsichtig auf Silan behandelten Objektträger und embed Zellen in Fluoreszenz-Eindeckmedium.

6. Cellular Elektrophysiologie

1. Führen Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen auf freshly isoliert atrialen und ventrikulären Kardiomyocyten bei Raumtemperatur.
2. Übertragen erscheint gesund Kardiomyozyten in Perfusionskammer mit einem definierten Volumen extrazellulären Badlösung gefüllt. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH ₂ PO _{4, 4} mM NaHCO _3, 1,7 mM MgCl _2, 3 mM CoCl _2, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose und 0,02 mM Tetrodotoxin (TTX), (pH 7,4) . Verwenden NaOH zur pH-Wert-Einstellung.
3. Mit geeigneten Patch Clamp Technik (dh IX71 inversen Mikroskop, ein Multiclamp 700B Verstärker, ein Erfassungssystem Digidata 1440A und PC mit pClamp10.3 Software (Molecular Devices)).
4. Verwenden Patch-Pipetten mit Widerständen von 3-5 MOhm, wenn mit intrazellulären Lösung, enthaltend 130 mM KCl, 2 mM MgCl _2, 11 mM HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na ₂ ATP, 0,4 mM Na ₂ GTP, 5 mM Na ₂ CP gefüllten und 4,9 mM CaCl ₂ (pH 7,2). Verwenden KOH für pH-Wert-Einstellung.
5. Evoke außen K + Ströme duRing 4.5-sec Spannungsschritte zu testen Potentiale zwischen -60 und +50 mV in 10 mV-Schritten von einem Haltepotential von -70 mV nach einem 20-msek bis -40 mV Vorpuls.
6. Stellen Sie sicher, Leckströme sind immer <100 pA.
7. Zum Sezieren von verschiedenen K +-Ströme verwenden spezifische Inhibitoren, wie 4-Aminopyridin (4-AP; ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) oder Tetraethylammonium (TEA, Sigma). Stammlösungen sollen in extrazellulären Badlösung hergestellt werden, und direkt auf eine möglichst enge Nachbarschaft der Zelle über eine Mikrospitze nach "Baseline" Aufnahmen. Äquilibrierung sollte für 2-3 min vor "Droge" Aufzeichnungen zugelassen werden.
8. Für die Analyse normalisieren Stromamplituden in einzelnen Zellen der Zellgröße (whole-cell Membran Kapazität). Analysieren von Daten mithilfe pClamp10.3 Software (Molecular Devices) oder vergleichbare Software offline.

Ergebnisse

Isolierung von adulten murinen Kardiomyozyten aus gentechnisch veränderten Mäusen, die Funktion bestimmter Gene von Interesse in vitro-Studie hat sich zu einem mächtigen Werkzeug, um weiter zu verstehen kardialen Pathophysiologie. Dieses Verfahren wird derzeit nur von einer kleinen, aber wachsenden Zahl von Grundlagenforschung Labors weltweit verwendet. Allerdings können Isolierung von adulten ventrikulären murine Kardiomyozyten tückisch sein und muss gründlich und wiederholt von erfahrenen Händen durchgeführt ...

Diskussion

Mit der wachsenden Entwicklung von gentechnisch veränderten Mauslinien die Herzfunktion und kardiale Pathologie zu Gen-Deletion zu studieren gibt es auch ein zunehmendes Interesse an spezialisierte Methoden, um Effekte der speziellen Gen-Deletion in vitro zu untersuchen. In unserem Labor untersuchen wir die Rolle einer Familie von Kv-Kanal zusätzlichen Untereinheiten auf die kardiale Repolarisation. Die KCNE Gene umfassen eine Familie von 5 Gene (KCNE1-5), die eine wichtige Rolle in der mensch...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz	Firma
Tetrodotoxin	Alomone
4-Aminopyridin	ICN Biomedicals
Heteropodatoxin 2	Alomone
Tetraethylammonium	Sigma Chemicals
Collagenase Typ 2	Worthington